CN110050067A - 产生经扩增的双链脱氧核糖核酸的方法以及用于所述方法的组合物和试剂盒 - Google Patents

Abstract

提供从核酸样品产生经扩增的双链脱氧核糖核酸(dsDNA)的方法。所述方法的各个方面包括使用单一产物核酸引物和模板转换寡核苷酸进行扩增以产生经扩增的dsDNA产物。也提供用于执行所述方法的组合物和试剂盒。

Description

产生经扩增的双链脱氧核糖核酸的方法以及用于所述方法的 组合物和试剂盒

相关申请的交叉引用

依据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2016年11月10日提交的美国临时专利申请序列号62/420,503的提交日期的优先权；所述申请的公开内容以引用的方式并入本文。

引言

逆转录与聚合酶链式反应扩增联用，也称为RT-PCR，是一种可为研究者所用以及同样可为临床医师所用的最强力的RNA检测技术。RT-PCR是一种用于从起始RNA样品产生可用于各种目的的经扩增的双链互补脱氧核糖核酸(cDNA)的示例性方法，所述目的包括简单检测和定量或作为原材料用于下游生物工程改造和生物信息学尝试。相较于用于RNA探索的较早技术，包括例如Northern印迹分析和RNA酶保护测定，RT-PCR代表重大进步。RT-PCR的出现允许更快速检测和/或定量目标RNA，同时也允许研究者使用较小样品或含有较小量RNA的样品，包括小至从单一细胞获得的量。随着下一代测序技术的进一步进展，RT-PCR反应的最终结果，即经扩增的cDNA的群体，现时可被快速且有效处理以获得大量强力科学数据。

涉及产生具有经添加已知核酸序列链段的双链DNA(dsDNA)产物的技术已被证明在许多生物技术和生物医学研究应用中是类似强力的。举例来说，允许从具有完全未知序列的DNA模板产生产物dsDNA，同时使具有已知序列的区域连接于产生的dsDNA的模板转换已在各种测序方法中被应用于核酸条型码化和文库产生。

鉴于对这些强力技术的广泛采用，对dsDNA产生、RT-PCR和相关方法的改进一定会对许多领域尤其是生物医学技术中的研究进度具有巨大影响。诸如尤其是降低方案长度、减少操作者时间、降低反应污染机会、增加反应特异性和增加反应精度的增强将是极其有价值的。

发明内容

提供从核酸样品产生经扩增的双链脱氧核糖核酸(dsDNA)的方法。方法的各个方面包括使用单一产物核酸引物和模板转换寡核苷酸进行扩增以产生经扩增的dsDNA产物。也提供用于执行所述方法的组合物和试剂盒。

附图描述

图1提供使用模板转换进行单一产物核酸合成的图示。

图2提供三步逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方案的图示。

图3提供根据本公开的一个实施方案的两步RT-PCR方案的图示。

图4提供根据本公开的一个实施方案的一步RT-PCR方案的图示。

图5描绘根据本公开的一个实施方案使用模板转换寡核苷酸和单一产物核酸引物对单一产物核酸的扩增。

图6描绘根据本公开的一个实施方案使用模板转换寡核苷酸和第一链cDNA引物从mRNA模板进行的逆转录和扩增方案。

图7A-图7D提供对各种类型的BUMI结构域的说明。

图8提供根据本文所述的本公开的一实施方案的含有BUMI结构域的模板转换寡核苷酸的示意图。

图9提供根据本文所述的本公开的一实施方案的含有BUMI结构域的引物的示意图。

图10提供如本文所述的经编码BUMI结构域的实例。

图11提供根据本公开的一个实施方案使用连接于模板转换寡核苷酸的经笼蔽捕集部分(caged capture moiety)来捕集所产生的dsDNA的实例。

图12提供如本文所述的三步RT-PCR方案的经扩增的双链cDNA产物的序列长度分布。

图13提供如本文所述的两步RT-PCR方案的经扩增的双链cDNA产物的序列长度分布。

图14提供如本文所述的一步RT-PCR方案的经扩增的双链cDNA产物的序列长度分布。

图15提供根据本公开的一个实施方案的于珠粒上进行模板转换的图示。

图16显示在RT反应之后使用存在的模板转换寡核苷酸和第一链合成引物在不存在PCR引物下进行的扩增。

图17提供SMART-Seq v4试剂盒工作流程和SMART-Seq HT试剂盒工作流程的示意性比较。

图18显示相较于三步方法，使用本公开的各种步骤减少方法达成的类似的基因主体覆盖度和适当大小的文库的产生。

图19显示SMART-Seq HT试剂盒与SMART-Seq v4试剂盒提供相同灵敏性和可重现性。

图20显示对于用SMART-Seq v4试剂盒和SMART-Seq HT试剂盒产生的数据，在经鉴定转录物的数目方面具有高度关联。

图21显示使用三步方法作为基线参照，在步骤减少方法中不存在额外GC含量表示偏倚。

图22显示一步RT-PCR反应维持对低GC含量基因和高GC含量基因的表示。

图23显示使用SMART-Seq v4试剂盒或SMART-Seq HT试剂盒来从个别细胞产生的RNA-seq文库具有类似测序量度。

图24显示SMART-Seq HT试剂盒中的步骤减少工作流程在测量基因表达水平方面不引入任何重大偏倚。

定义

如本文所用，术语“杂交条件”意指其中引物或其他多核苷酸特异性与靶标核酸的区域杂交的条件，所述引物或其他多核苷酸与所述区域共有一定互补性。引物是否特异性与靶标核酸杂交由诸如聚合物与靶标核酸之间的互补性程度和发生杂交所处的温度的因素确定，所述温度可通过引物的熔解温度(T_M)来获悉。熔解温度是指一半引物-靶标核酸双链体保持杂交，并且一半双链体解离成单链所处的温度。双链体的Tm可以实验方式测定，或使用下式预测：Tm＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(G+C分数)-(60/N)，其中N是链长，并且[Na+]小于1M。参见Sambrook和Russell(2001；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor N.Y.，第10章)。视各种杂交条件而定，依赖于各种参数的其他更先进模型也可用于预测引物/靶标双链体的Tm。用于实现特异性核酸杂交的方法可见于例如Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays，”Elsevier(1993)中。

如本文所用的术语“互补”和“互补性”是指核苷酸序列通过非共价键与靶标核酸的全部或区域(例如产物核酸的区域)进行碱基配对。在典型沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对中，在DNA的情况下，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA的情况下，胸腺嘧啶由尿嘧啶(U)替换。因此，A互补于T，并且G互补于C。在RNA的情况下，A互补于U，并且反之亦然。通常，“互补”是指核苷酸序列是至少部分互补的。术语“互补”也可涵盖双链体是完全互补的，以致一条链中的每个核苷酸都互补于另一条链中在相应位置中的每个核苷酸。在某些情况下，核苷酸序列可部分互补于靶标，其中并非所有核苷酸都互补于靶标核酸中在所有相应位置中的每个核苷酸。举例来说，引物可完全(即100％)互补于靶标核酸，或引物和靶标核酸可共有不及完全的一定互补性程度(例如70％、75％、85％、90％、95％、99％)。

两个核苷酸序列的同一性百分比可通过出于最优比较目的使序列对准来确定(例如可在第一序列的序列中引入空位以达成最优比对)。接着比较在相应位置处的核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比是由序列共有的同一位置的数目的函数(即同一性％＝同一位置的数目/位置的总数目×100)。当一个序列中的位置与另一序列中的相应位置由相同核苷酸占据时，那么分子在那个位置处是同一的。这种数学算法的一非限制性实例描述于Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877(1993)中。这种算法被并入如Altschul等，Nucleic Acids Res.25：389-3402(1997)中所述的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。当利用BLAST和空位化BLAST程序时，可使用相应程序(例如NBLAST)的缺省参数。在一个方面，用于序列比较的参数可被设置在评分＝100，字长＝12下，或可加以改变(例如字长＝5或字长＝20)。

结构域是指核酸的由多个核苷酸组成的链段或长度，其中所述链段或长度对所述核酸提供确定功能。结构域的实例包括条型码化独特分子标识符(BUMI)结构域、引物结合结构域、杂交结构域、条型码结构域(诸如来源条型码结构域)、独特分子标识符(UMI)结构域、下一代测序(NGS)衔接头结构域、NGS索引结构域等。尽管给定结构域的长度可变化，但在一些情况下，长度在2至100nt，诸如5至50nt，例如5至30nt的范围内。

如以下更详细所述，BUMI结构域是包括BUMI标签的至少一部分的结构域。给定BUMI结构域可包括完整BUMI标签，并且与BUMI标签共同延伸。在其他情况下，BUMI结构域可包括BUMI标签的一部分。在这些情况中的任一者下，BUMI结构域可进一步包括BUMI编码组分，其为存在于BUMI结构域中的BUMI标签或其部分提供编码信息。

具体实施方式

提供从核酸样品产生经扩增的双链脱氧核糖核酸(dsDNA)的方法。方法的各个方面包括使用单一产物核酸引物和模板转换寡核苷酸进行扩增以产生经扩增的dsDNA产物。也提供用于执行方法的组合物和试剂盒。

在更详细描述本公开的方法之前，应了解方法不限于所述特定实施方案，因此当然可变化。也应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图具有限制性，因为方法的范围将仅受限于随附权利要求。

当提供数值范围时，应了解除非上下文另外明确规定，否则在那个范围的上限与下限之间的达到下限单位的十分之一的各间插值以及在那个陈述范围内的任何其他陈述值或间插值都涵盖在方法内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在方法内，服从于陈述范围内的任何明确排除的限值。当陈述范围包括一个或两个限值时，排除那些所包括限值中的任一者或两者的范围也包括在方法中。

某些范围在本文中以前置有术语“约”的数值呈现。术语“约”在本文中用于对它所前置的精确数值以及接近或近似是所述术语所前置的数值的数值提供字面支持。在确定数值是否接近或近似是明确叙述的数值时，接近或近似未叙述数值可为在它被呈现所处的情形中提供明确叙述数值的大致上等效值的数值。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由方法所属领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述的那些方法类似或等效的任何方法也都可用于实施或测试方法，但现时描述代表性说明性方法和材料。

在本说明书中引用的所有出版物和专利都以引用的方式整体并入本文，所述引用的程度就好像已特定地和个别地指示将各个别出版物或专利以引用的方式并入一样，并且以引用的方式并入本文来公开和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用都是因为它的公开内容在提交日期之前，并且不应解释为承认本发明方法无权借助先前发明而先于所述出版物。此外，提供的出版日期可不同于可能需要独立确认的实际出版日期。

应注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文以及随附权利要求中所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”包括复数个(种)指示物。应进一步注意权利要求可被起草来排除任何任选要素。因此，这个陈述意图充当与叙述权利要求要素相关使用诸如“只有”、“仅有”等的排他性术语或使用“否定性”限制的前提基础。

应了解，为明晰起见在单独实施方案的情形下描述的方法的某些特征也可在单一实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单一实施方案的情形下描述的方法的各种特征也可单独或以任何适合子组合提供。实施方案的所有组合都由本发明明确包括，并且在本文中公开，就好像各个和每个组合都在所述组合包括可操作方法和/或装置/系统/试剂盒的程度上被个别地和明确地公开一样。此外，描述所述变量的实施方案中所列的所有子组合也都由本发明方法明确包括，并且在本文中公开，就好像各个和每个所述子组合都被个别地和明确地在本文中公开一样。

如将为本领域技术人员在阅读本公开后显而易知，本文描述和说明的各个别实施方案都具有离散组成部分和特征，其可在不脱离本发明方法的范围或精神下易于与任何其他若干实施方案的特征分开或组合。任何叙述的方法都可以叙述的事件顺序或以在逻辑上可能的任何其他顺序进行。

方法

如上所概述，本公开的各个方面包括产生经扩增的双链脱氧核糖核酸(dsDNA)。本发明方法包括使用单一产物核酸引物和模板转换寡核苷酸从模板核酸进行扩增。在一些情况下，用于从单一产物核酸进行扩增的所述引物可为例如在逆转录反应中从核酸模板产生单一产物核酸时使用的相同引物。如本文所用，术语“逆转录”和“逆转录反应”将通常是指其中逆转录酶用于核酸合成反应中，而与所转录核酸模板的性质无关(例如无论是DNA还是RNA模板由逆转录酶处理以合成互补于模板的核酸)的任何反应。

就“经扩增的dsDNA”来说，其意指单链单一产物核酸的双链DNA拷贝的群体。“单一产物核酸”将变化，并且可包括例如从核糖核酸(RNA)模板产生的单链第一链cDNA或从DNA模板产生的第一单链DNA(ssDNA)链。因此，单一产物核酸可从DNA模板或非DNA模板例如RNA模板产生。扩增程度以及因此所产生的dsDNA拷贝群体的大小将变化，但在一些情况下是5X扩增或更多，其中例如“5X扩增或更多”是指从各单一产物核酸分子产生5个或更多个dsDNA。实现的扩增程度可超过5X扩增，并且可包括但不限于例如10X扩增或更多、100X扩增或更多、1000X扩增或更多、10,000X扩增或更多、100,000X扩增或更多、1,000,000X扩增或更多等。

对扩增程度的度量无需必定是精确的，并且可例如基于样品的平均值或近似平均值，其中例如10X扩增是指从各单一产物核酸分子平均产生10个dsDNA或近似10个dsDNA。在一些情况下，可对扩增程度和/或所产生的dsDNA拷贝群体的大小进行间接定量，例如其中测量在扩增之后存在于反应中的DNA的量，并且由其外推扩增程度。在一些情况下，可对扩增程度和/或所产生的dsDNA拷贝群体的大小进行直接定量，例如通过使用包括例如定量测序方法或生物分析仪(例如Agilent生物分析仪)的任何适宜方法来直接测量所产生的dsDNA拷贝的数目。

一般来说，如本文所用的扩增将不指代例如从模板核酸产生单一产物核酸。扩增将通常包括从单一产物核酸产生超过小数目的拷贝，例如超过单一拷贝的dsDNA，包括但不限于例如超过2个拷贝、超过3个拷贝、超过4个拷贝、超过5个拷贝、超过10个拷贝、超过15个拷贝、超过20个拷贝、超过30个拷贝、超过100个拷贝、超过1,000个拷贝、超过10,000个拷贝、超过100,000个拷贝、超过10⁶个拷贝、超过10⁷个拷贝、超过10⁸个拷贝等。根据本文所述方法的扩增可为指数性的或近似指数性的。

本发明方法可在扩增过程中利用模板转换寡核苷酸。模板转换寡核苷酸是用于模板转换反应(包括从模板核酸产生单一产物核酸，例如RNA模板的逆转录或DNA模板的逆转录)中的寡核苷酸。因此，产生单一产物核酸可利用模板转换和某些核酸聚合酶进行“模板转换”的能力，即使用第一核酸链作为聚合模板，接着向第二模板核酸链(其可被称为“模板转换核酸”或“接受体模板”)转换，同时继续聚合反应。结果是合成具有互补于第一模板核酸链的5’区域和互补于模板转换核酸的3’区域的杂合核酸链。本公开的方法可在通过模板转换来产生单一产物核酸时利用模板转换寡核苷酸，并且所述模板转换寡核苷酸可进一步用于扩增单一产物核酸。

转向图1，描绘了模板转换反应的一个图式化实例。在所示实施方案中，单一产物核酸引物(100)通过由单一产物核酸引物和模板共有的互补序列(由“XXXX”表示)来与模板核酸(101)杂交。单一产物核酸引物可但无需必定包括不互补于模板(例如非模板化)的具有额外序列的区域(102)。在单一产物核酸引物与模板退火之后，逆转录(103)通过使用逆转录酶来进行，以产生互补于模板的单一产物核酸链(104)。具有末端转移酶活性的逆转录酶将非模板化核苷酸转移至所产生的单一产物核酸(由“YYY”表示)，并且模板转换寡核苷酸(105)通过存在于模板转换寡核苷酸上的具有互补核苷酸的序列(也由“YYY”表示，并且在本文中也称为3′杂交结构域)来与单一产物核酸的非模板化核苷酸杂交。模板转换寡核苷酸包括不与非模板化核苷酸杂交的额外序列(106)。发生模板转换(107)，其中逆转录酶从模板进行转换以利用模板转换寡核苷酸作为第二模板，从而转录额外序列(106)以产生它的互补序列(108)。现时完全产生的单一产物核酸链(109)包括单一产物核酸引物的完整序列，包括不与模板杂交的任何额外序列(102)(如果存在)；模板的互补序列以及模板转换寡核苷酸的互补序列。与模板转换相关的方法和试剂也描述于美国专利号9,410,173中；所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。

在一些情况下，模板转换的过程可限于产生第一链，并且例如模板转换可不在扩增期间发生，即使扩增反应利用模板转换寡核苷酸。举例来说，在聚合酶从第一核酸模板向模板转换寡核苷酸转换所处的例如如用于产生单一产物核酸的初始模板转换反应之后，当模板转换寡核苷酸进一步用于后续扩增时，模板转换可不再发生。因此，在一些情况下，当在反应的扩增部分中利用模板转换寡核苷酸时，包括例如在扩增单一产物核酸以产生经扩增的dsDNA产物期间，不发生模板转换。

主题方法可包括使为扩增所必需的那些反应组分或为单一产物核酸链合成以及扩增两者所必需的那些反应组分组合在反应混合物中。举例来说，主题方法可包括使逆转录酶和扩增聚合酶组合在单一反应混合物中，并且以在所述反应混合物中进行逆转录与扩增两者。如组合在单一反应混合物中的组分，包括例如本文所述的那些，可例如由使用者添加至反应混合物中，或可例如组合预先在反应混合物中来向使用者提供。

本发明方法包括具有有限数目的步骤的那些。用于特定方法或方案中的“步骤”的数目可以各种方式确定，并且在一些情况下，可涉及将组分添加或组合至反应混合物中。举例来说，在一些情况下，“三步”方案可包括三轮或三次发生将一种或多种组分添加至反应混合物中，“两步”方案可包括两轮或两次发生将一种或多种组分添加至反应混合物中，并且“一步”方案可包括仅一轮或一次发生将一种或多种组分添加至反应混合物中。在一些情况下，可在将组分添加至反应混合物中的步骤之间进行温度变化。举例来说，可预先加热反应混合物，并且在预先加热之后，可在进一步反应过程之前进行包括将额外组分添加至反应混合物中的第二步骤。

反应过程可在具有有限数目的步骤的方案的一个或多个步骤之前、期间、之间或之后进行。举例来说，在一些情况下，可在方案的一个或多个步骤之前、期间、之间或之后加热反应混合物。在一些情况下，可在方案的一个或多个步骤之前、期间、之间或之后使反应混合物经受一种或多种温度、一次或多次温度变化、或热循环程序。所述反应过程，例如不包括将额外组分添加至反应混合物中的那些，当它们在本文中关于具有有限数目的步骤的方法和方案被提及时不构成方法“步骤”。举例来说，在其中在单轮“组合”中将一种或多种组分添加至反应混合物中，并且使反应混合物经受热循环过程的各种温度变化的“一步”方法的情况下，个别温度变化不被视为如本文定义的“步骤”。类似地，在其中在两轮单独“组合”中将一种或多种组分添加至反应混合物中，并且在各轮试剂添加之间使反应混合物经受一次或多次温度变化的“两步”方法的情况下，组分添加步骤之间的一次或多次温度变化不被视为如本文定义的“步骤”。

因此，本文所述的方法可以包括两个步骤或一个步骤的有限数目的步骤来进行。举例来说，在一些情况下，本文所述的方法代表两步dsDNA扩增方法。在一些情况下，本文所述的方法代表从模板核酸进行逆转录和dsDNA扩增的两步方法。在一些情况下，本文所述的方法代表一步dsDNA扩增方法。在一些情况下，本文所述的方法代表从模板核酸进行逆转录和dsDNA扩增的一步方法。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增方法可以三个步骤来进行。举例来说，如图2中所描绘，在第一步骤中，可预先加热存在于反应容器中的样品(例如总RNA或细胞)。在一些情况下，可或可不在主题预先加热步骤之前添加一种或多种额外试剂，所述额外试剂包括但不限于例如RNA酶抑制剂、逆转录(RT)引物和缓冲液(例如样品溶解缓冲液)。在一些情况下，可在预先加热之后添加一种或多种所述额外试剂。在第二步骤中，可添加为RT所必需的试剂，包括例如逆转录酶、RNA酶抑制剂等，并且可随后进行RT。在一些情况下，这个第二步骤可进一步包括如所描绘的模板转换(“TS”)，用于模板转换的试剂可在这个步骤期间和/或之前添加。接着，在第三步骤中，可添加PCR扩增试剂，包括例如DNA聚合酶、扩增引物(例如如所描绘的PCR IIA引物)等，并且可进行PCR。这个三步过程的结果可为例如视所用寡核苷酸/引物的构型而定的双链cDNA或其文库，包括非模板化序列(包括例如测序衔接物、条型码序列等)。

在本发明方法的一些实施方案中，RT-PCR可以两个步骤进行，例如如图3中所描绘。在这种两步方法的第一步骤中，可预先加热存在于反应容器中的样品(例如总RNA或细胞)。这种步骤也可包括添加额外试剂，诸如像RNA酶抑制剂、缓冲液(例如溶解缓冲液)和第一链引物(在图3中描绘为“CDS”)。在两步方法的一些实施方案中，除样品的RNA之外，第一链引物也可在预先加热之前存在。在两步方法的一些实施方案中，在预先加热期间，用于下游步骤中的模板转换寡核苷酸可不存在于反应混合物中。接着，在第二步骤中，向反应混合物中添加用于RT与PCR扩增两者的组分，包括但不限于例如逆转录酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、模板转换寡核苷酸(以“TSO”描绘)、dNTP、反应缓冲液等，并且在一些情况下进行伴有模板转换(“TS”)的RT-PCR。在一些情况下，可采用在RT反应条件下是非活性的，但在扩增条件下或在变性温度下变得具有活性的DNA聚合酶，包括例如热启动DNA聚合酶。这个两步过程的结果可为例如视所用寡核苷酸/引物的构型而定的双链cDNA或其文库，可包括非模板化序列(包括例如测序衔接物、条型码序列等)。

在以上实施方案中，可或可不进行纯化。举例来说，在一些情况下，在以上实施方案中，不对例如在第一步骤中产生的中间产物进行纯化。本公开的方法可但无需必定排除对反应产物(中间反应产物或最终反应产物)的纯化。因此，在一些情况下，在如本文所述的方法的步骤之前、期间、之间或之后的步骤或过程可排除纯化。因此，本文所述的方法可从个别步骤排除纯化，或从方法完全排除纯化。排除纯化可允许一种或多种涉及于对反应混合物的先前处理中的试剂存在和涉及于后续过程中。举例来说，由于不存在纯化，RT反应的组分可存在和涉及于稍后反应诸如像PCR扩增反应中。这种配置与其中采用纯化例如以从反应混合物移除一种或多种在初始反应(例如RT反应)中采用的组分以使一种或多种试剂不存在，因此不涉及于后续反应(例如PCR扩增)中的配置形成比较。因此，在一些情况下，在本文所述方法的连续反应之间不存在纯化可允许一种或多种组分在所述方法的多个不同反应中起多种作用。

或者，本文所述的方法可在个别步骤内或在整体方法内包括一次或多次纯化。在一些情况下，本公开的方法可但无需必定包括对反应产物(中间反应产物或最终反应产物)的纯化。因此，在一些情况下，在如本文所述的方法的步骤之前、期间、之间或之后的步骤或过程可包括纯化。

在本发明方法的一些实施方案中，RT-PCR可以一个步骤进行，例如如图4中所描绘。在这种方法的唯一步骤中，可一次性添加用于RT反应和PCR扩增中的所有组分(即不在反应中的额外时间或时刻添加其他组分)，所述组分可包括但不限于例如样品(例如细胞或总RNA)、第一链引物(在图4中以“星号”描绘)、逆转录酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、模板转换寡核苷酸(“TSO”)、dNTP、反应缓冲液等。在一些实施方案中，一步方法中采用的样品可为纯化RNA样品。在第一步骤中添加的寡核苷酸/引物即第一链引物和模板转换寡核苷酸可用于PCR扩增反应中。因此，用于产生单一产物核酸的相同寡核苷酸/引物可用于扩增所产生的单一产物核酸以产生经扩增的产物dsDNA(例如如所描绘的双链cDNA)。在方法的唯一步骤中组合所有必要组分之后，反应混合物可通过各种反应条件来继续前进，所述反应条件包括预先加热反应条件、RT反应条件、模板转换(“TS”)反应条件和PCR反应条件。在一些情况下，一步方法可排除预先加热条件，以使在开始一步RT-PCR反应之前，反应混合物不经预先加热。

在一些情况下，当一步方法采用预先加热条件时，所述条件可包括在以下温度下孵育：50℃或更低温度至70℃或更高温度，包括但不限于例如50℃至75℃、55℃至75℃、60℃至75℃、65℃至75℃、70℃至75℃、50℃至70℃、55℃至70℃、60℃至70℃、65℃至70℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、72℃、75℃、小于70℃、小于65℃、小于60℃等。孵育的时长可变化，并且可在1分钟至5分钟或更久的范围内，包括但不限于例如1至5分钟、1至3分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟等。在一些情况下，在预先加热条件下孵育之后，反应可例如通过将反应放置在冰上来冷却，包括例如其中使反应在冷却条件下(例如在冰上)保持一定时期，包括但不限于例如1分钟或更久，例如1至2分钟、1至3分钟、1分钟、2分钟、3分钟等。

如上所概述，本发明方法可包括在第一链的扩增中使用模板转换寡核苷酸和第一链引物以产生产物双链核酸。在一些情况下，用于产生产物双链核酸的反应可为利用模板转换进行的单一产物核酸合成反应。现参照图5，从基本上如图1中所述产生的单一产物核酸(500)开始，模板转换寡核苷酸(501)与(502)于单一产物核酸杂交，并且扩增聚合酶从模板转换寡核苷酸延伸以产生互补于单一产物核酸的链(503)。后续扩增(504)可通过各轮的使模板转换寡核苷酸(501)和第一链引物(505)(在本文中也称为“RT引物”和“CDS引物”，即cDNA合成引物)与所产生的链退火并延伸来进行，从而最终产生经扩增的dsDNA(506)。

在如图6中描绘的一个实施方案中，可进行本发明方法来使用聚dT(也被称为寡(dT))单一产物核酸引物(601)扩增具有聚A尾部的模板mRNA(600)以产生互补于模板mRNA(601)的单一产物核酸(602)。后续扩增可基本上如上所述使用模板转换寡核苷酸(603)和单一产物核酸引物(601)来进行，以产生经扩增的dsDNA产物(604)。

在一些情况下，可进行本发明方法来使用具有互补于尾部序列的序列的单一产物核酸引物扩增具有所述尾部序列的模板核酸。如本文所用的术语“尾部序列”通常是指存在于模板核酸的3’末端上的由单一核苷酸种类(例如A、C、G、T等)组成的多核苷酸链段。mRNA模板的聚(A)尾部是尾部序列的一个非限制性实例。此外，存在于DNA模板的3’末端上的聚(T)序列是尾部序列的另一非限制性实例。因此，可存在于主题模板核酸上的尾部序列的实例包括但不限于例如聚(A)尾部、聚(C)尾部、聚(G)尾部、聚(T)尾部等。尾部序列的大小可在小于10nt至300nt或更多的范围内，包括但不限于例如10至300nt、10至200nt、10至150nt、10至100nt、10to 90nt、10至80nt、10至70nt、10至60nt、10至50nt、10至40nt、10至30nt、10至20nt、20至300nt、20至200nt、20至150nt、20至100nt、20至90nt、20至80nt、20至70nt、20至60nt、20至50nt、20至40nt、20至30nt、15nt、16nt、18nt、20nt等。当模板核酸含有尾部序列时，用于主题方法中的单一产物核酸引物可含有互补于尾部序列的序列，引物与所述尾部序列杂交并引发单一产物核酸的伸长。存在于单一产物核酸引物上的互补于尾部序列的适用序列将变化，并且可包括但不限于例如聚(dA)序列、聚(dC)序列、聚(dG)序列、聚(dT)序列等。

存在于模板核酸上的尾部序列可为天然存在的(例如在mRNA模板的聚(A)尾部的情况下)，或可为人工或合成产生的。举例来说，在一些情况下，可在加尾反应中将尾部序列添加至核酸模板例如DNA模板中。加尾反应将变化，并且可包括例如其中通过酶促过程来将尾部序列添加至模板中。适用于对主题核酸模板加尾的酶包括但不限于例如末端转移酶(例如末端脱氧核苷酸基转移酶、RNA特异性核苷酸基转移酶等)。加尾序列的核苷酸种类可根据需要(例如通过使得在利用末端转移酶进行的加尾反应中仅有所需种类的dNTP(例如仅有dATP、仅有dCTP、仅有dGTP或仅有dTTP)可用)来控制。在一些情况下，“dNTP加尾混合物”用于加尾反应中，其中这种混合物仅含有一个种类的dNTP。在一些情况下，可例如通过移除存在于核酸模板上的3’磷酸(脱磷酸化)来制备用于加尾反应的核酸模板。任何适宜和适当磷酸酶都可出于所述目的加以采用，包括但不限于例如碱性磷酸酶(例如虾碱性磷酸酶及其衍生物)等。

在一些情况下，主题方法可包括例如通过使模板核酸与末端转移酶在某一种类的dNTP存在下在足以产生具有尾部序列的模板(即经加尾模板)的条件下接触来进行加尾反应以将加尾序列添加至模板核酸中。dNTP的添加率-因此尾部序列的长度-随3′末端与dNTP浓度的比率而变，并且也随使用哪种dNTP而变。末端转移酶反应在末端转移酶具有活性所处的温度下，诸如在30℃与50℃之间，包括在37℃下进行。末端转移酶反应中的dNTP可在0.01mM至1mM，诸如0.05mM至0.5mm，包括0.1mM的最终浓度下存在。模板核酸可在0.05至500pmol，诸如0.5至50pmol，包括1至25pmol，例如5pmol的浓度下存在于末端转移酶反应中。末端转移酶缓冲溶液和任何其他适用组分(例如金属辅因子诸如Co，等)也可例如以单独溶液(例如缓冲液)形式或作为″dNTP加尾混合物″的一部分包括在末端转移酶反应中。末端转移酶反应导致在核酸模板的3’末端添加核苷酸，并且所得经加尾模板核酸可接着用于根据主题方法的反应的其他步骤中。

在主题方法的一些实施方案中，在扩增dsDNA期间，除模板转换寡核苷酸和单一产物核酸引物之外，可不存在其他引物(所述术语也将指代用于引发延伸反应的寡核苷酸)。换句话说，扩增可仅使用模板转换寡核苷酸和单一产物核酸引物来进行。因此，本发明扩增方法可在不存在任何额外扩增引物下进行(即除模板转换寡核苷酸和单一产物核酸引物之外，无引物用于扩增)。因此，用于本文所述方法中的主题反应混合物可排除存在除模板转换寡核苷酸和单一产物核酸引物之外的任何扩增引物(即在根据本发明方法的实施方案来扩增dsDNA时，可不添加或另外使用额外扩增引物)。

就“扩增引物”来说，其通常意指用于扩增(例如PCR扩增)中的引物，包括例如通常在第一链合成之后添加(例如在反应开始之前或在反应期间)至RT-PCR反应中以进行扩增的那些引物。按照惯例，除第一链合成引物之外，扩增引物也存在于RT-PCR反应中，并且扩增引物独立于第一链合成引物用于对所产生的第一链cDNA进行PCR扩增。扩增引物可有时被称为“第二链合成引物”、“第二链引物”、“PCR引物”、“正向引物”、“反向引物”、“通用扩增引物”等，并且可有时被描述为存在于“多样引物混合物(multiplex primer mix)”中。即使当在第一链合成和/或模板转换反应期间存在时(例如当在RT-PCR反应开始时添加时)，扩增引物也将通常不涉及于单一产物核酸合成和/或模板转换中。

因此，在本发明方法的实施方案中，在不存在一种或多种扩增引物下进行扩增。在一些实施方案中，一种或多种扩增引物不存在(即缺席于)于反应混合物中，以致反应混合物不含有扩增引物。换句话说，在一些实施方案中，反应混合物可不含有也不涉及于单一产物核酸合成和/或模板转换中的任何引物。

主题方法可包括使逆转录酶、单一产物核酸引物、模板转换寡核苷酸和扩增聚合酶与模板核酸组合至反应混合物中。反应混合物可含有用于逆转录和/或PCR中的其他组分，包括必需组分和非必需组分，包括但不限于例如三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)、缓冲液等。

如上所指示，主题方法包括使模板转换寡核苷酸组合至反应混合物中以及使用所述模板转换寡核苷酸进行扩增。就“模板转换寡核苷酸”来说，其意指在核酸聚合反应期间聚合酶从初始模板(例如模板核酸(例如RNA模板或DNA模板))向其转换的寡核苷酸模板。就此而言，模板可被称为“供体模板”，并且模板转换寡核苷酸可被称为“接受体模板”。如本文所用，“寡核苷酸”是2至500个核苷酸，例如2至200个核苷酸的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可为合成的，或可以酶促方式制备，并且在一些实施方案中，长度是10至50个核苷酸。寡核苷酸可含有核糖核苷酸单体(即可为寡核糖核苷酸或“RNA寡核苷酸”)或脱氧核糖核苷酸单体(即可为寡脱氧核糖核苷酸或“DNA寡核苷酸”)。寡核苷酸的长度可为例如10至20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150或150至200、多达500个或更多个核苷酸。

主题方法的反应混合物可包括在足以易于容许聚合酶从模板向模板转换寡核苷酸进行模板转换的浓度下，在足以使用模板转换寡核苷酸来扩增单一产物核酸的浓度下，或在足以易于容许进行模板转换以及扩增单一产物核酸的浓度下的模板转换寡核苷酸。举例来说，模板转换寡核苷酸可在0.01至100μM，诸如0.1至10μM，诸如0.5至5μM，包括1至2μM(例如1.2μM)的最终浓度下添加至反应混合物中。

模板转换寡核苷酸可包括一个或多个经修饰或另外是非天然存在的核苷酸(或其类似物)。举例来说，模板转换寡核苷酸可包括一个或多个核苷酸类似物(例如LNA、FANA、2’-O-Me RNA、2’-氟RNA等)、键联修饰(例如硫代磷酸酯、3’-3’和5’-5’反向键联)、5’末端和/或3’末端修饰(例如5’和/或3’氨基、生物素、DIG、磷酸、硫醇、染料、淬灭剂等)、一个或多个经荧光标记核苷酸、或对模板转换寡核苷酸提供所需功能性的任何其他特征。

在某些方面，模板转换寡核苷酸包括3’杂交结构域。3′杂交结构域的长度可变化，并且在一些情况下，长度在2至10nt的范围内，诸如长度在3至7nt的范围内。模板转换寡核苷酸的3’杂交结构域可包括互补于添加至单一产物核酸中的非模板化序列的序列。以下更详细描述的非模板化序列通常是指不对应于例如RNA模板或DNA模板的模板，并且不通过所述模板来加以模板化的那些序列。当存在于模板转换寡核苷酸的3’杂交结构域中时，非模板化序列可涵盖整个3’杂交结构域或其一部分。在一些情况下，非模板化序列可包括异多核苷酸或由异多核苷酸组成，其中这种异多核苷酸的长度可变化，长度是2至10nt，诸如长度是3至7nt，包括3nt。在一些情况下，非模板化序列可包括同多核苷酸或由同多核苷酸组成，其中这种同多核苷酸的长度可变化，长度是2至10nt，诸如长度是3至7nt，包括3nt。

根据一些实施方案，组合至反应混合物中的聚合酶(例如逆转录酶诸如MMLV RT)具有末端转移酶活性，以致同核苷酸链段(例如同三核苷酸诸如C-C-C)可被添加至初生链的3’末端，并且模板转换寡核苷酸的3’杂交结构域包括互补于初生链的3’末端的同核苷酸链段的同核苷酸链段(例如同三核苷酸诸如G-G-G)。在其他方面，当具有末端转移酶活性的聚合酶将核苷酸链段(例如三核苷酸链段)添加至初生链的3’末端时，模板转换寡核苷酸的3’杂交结构域包括异三核苷酸，其包含包括胞嘧啶的核苷酸和包括鸟嘌呤的核苷酸(例如r(C/G)₃寡核苷酸)，模板转换寡核苷酸的所述异三核苷酸链段互补于初生链的3’末端。3’杂交结构域和模板转换寡核苷酸的实例进一步描述于美国专利号5,962,272中，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。

根据一些实施方案，模板转换寡核苷酸包括在合成模板转换寡核苷酸的5’末端(例如模板转换寡核苷酸的5’衔接物序列)的互补序列之后阻止聚合酶从模板转换寡核苷酸向不同模板核酸转换的修饰。适用的修饰包括但不限于无碱基损伤(例如四氢呋喃衍生物)、核苷酸加合物、异核苷酸碱基(例如异胞嘧啶、异鸟嘌呤和/或类似物)及其任何组合。

在一些情况下，模板转换寡核苷酸可包括5’衔接物序列(例如在模板转换寡核苷酸的3’杂交结构域的5’的确定核苷酸序列)，所述5’衔接物序列可在下游应用中用于各种目的。在一些情况下，5’衔接物序列可充当引物结合位点以达成对经扩增的dsDNA的进一步扩增，或例如巢式扩增或抑制扩增。

如上所概述，本发明方法包括在单一产物核酸的扩增反应中使用第一链引物例如单一产物核酸引物来产生经扩增的dsDNA。在一些情况下，用于产生产物双链核酸的反应可为利用模板转换和第一链引物进行的第一链cDNA合成反应。用于从单一产物核酸进行扩增的单一产物核酸引物可为用于例如从RNA模板或DNA模板产生单一产物核酸的相同引物。

单一产物核酸引物，也被称为单一产物核酸合成引物(例如第一链cDNA合成引物)或第一链引物，包括模板结合结构域。举例来说，核酸可包括被构造来与模板核酸例如mRNA、ssDNA等杂交的第一(例如3’)结构域，并且可或可不包括一个或多个可被视为不与模板核酸杂交的第二(例如5’)结构域的额外结构域，例如非模板序列结构域，如以下更详细所述。模板结合结构域的序列可为独立确定的或任意的。在某些方面，模板结合结构域具有确定序列，例如聚dT或基因特异性序列。在其他方面，模板结合结构域具有任意序列(例如随机序列，诸如随机六聚体序列)。尽管模板结合结构域的长度可变化，但在一些情况下，这个结构域的长度在5至50nt，诸如6至25nt，例如6至20nt的范围内。

单一产物核酸引物可包括一个或多个经修饰或另外是非天然存在的核苷酸(或其类似物)。举例来说，单一产物核酸引物可包括一个或多个核苷酸类似物(例如LNA、FANA、2’-O-Me RNA、2’-氟RNA等)、键联修饰(例如硫代磷酸酯、3’-3’和5’-5’反向键联)、5’末端和/或3’末端修饰(例如5’和/或3’氨基、生物素、DIG、磷酸、硫醇、染料、淬灭剂等)、一个或多个经荧光标记核苷酸、或对单一产物核酸引物提供所需功能性的任何其他特征。

在一些情况下，单一产物核酸引物可包括5’衔接物序列(例如在单一产物核酸引物的3’杂交结构域的5’的确定核苷酸序列)，所述5’衔接物序列可在下游应用中用于各种目的。在一些情况下，5’衔接物序列可充当引物结合位点以达成对经扩增的dsDNA的进一步扩增，或例如巢式扩增或抑制扩增。

在一些情况下，用于主题方法中的引物(包括例如单一产物核酸引物、模板转换寡核苷酸等)中的一者或多者可包括两个或更多个结构域。举例来说，引物可包括与模板杂交的第一(例如3’)结构域和不与模板杂交的第二(例如5’)结构域。第一结构域和第二结构域的序列可为独立确定的或任意的。在某些方面，第一结构域具有确定序列，并且第二结构域的序列是确定的或任意的。在其他方面，第一结构域具有任意序列(例如随机序列，诸如随机六聚体序列)，并且第二结构域的序列是确定的或任意的。在一些情况下，两个结构域的序列均是确定的。当用于主题方法中的引物(包括例如单一产物核酸引物、模板转换寡核苷酸等)包括两个或更多个结构域时，所述结构域中的一者或多者可包括如下所述的非模板化序列。

本公开的方法包括使一种或多种聚合酶组合至反应混合物中，包括例如扩增聚合酶、逆转录酶、扩增聚合酶和逆转录酶等。当实施主题方法时，可采用多种聚合酶。

在一些情况下，组合至反应混合物中的聚合酶能够进行模板转换，其中所述聚合酶使用第一核酸链作为聚合模板，接着向第二模板核酸链的3’末端转换以继续相同的聚合反应。在一些情况下，能够进行模板转换的聚合酶是逆转录酶。适用于实施主题方法的能够进行模板转换的逆转录酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、第II组内含子源性逆转录酶及其突变体、变体衍生物或功能性片段，例如减除RNA酶H的酶或RNA酶H活性降低的酶。举例来说，逆转录酶可为莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)逆转录酶(MMLVRT)或家蚕(Bombyx mori)逆转录酶(例如家蚕R2非LTR元件逆转录酶)。适用于实施主题方法的能够进行模板转换的聚合酶可商购获得，并且包括可从Clontech Laboratories，Inc.(Mountain View，CA)获得的SMARTScribe^TM逆转录酶和PrimeScript^TM逆转录酶。

除模板转换能力之外，聚合酶也可包括其他适用功能性。举例来说，聚合酶可具有末端转移酶活性，其中聚合酶能够催化将脱氧核糖核苷酸添加至RNA或DNA分子的3’羟基末端。在某些方面，当聚合酶到达模板的5’末端时，聚合酶能够在初生链的3’末端并入一个或多个不由模板编码的额外核苷酸。举例来说，当聚合酶具有末端转移酶活性时，聚合酶可能够在初生链的3’末端并入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个额外核苷酸。所有核苷酸都可为相同的(例如在初生链的3’末端产生同核苷酸链段)，或一个或多个核苷酸可不同于其他核苷酸(例如在初生链的3’末端产生异核苷酸链段)。在某些方面，聚合酶的末端转移酶活性导致添加具有2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个相同核苷酸(例如全都是dCTP、全都是dGTP、全都是dATP或全都是dTTP)的同核苷酸链段。举例来说，根据一个实施方案，聚合酶是MMLV逆转录酶(MMLV RT)。MMLV RT在初生链的3’末端并入额外核苷酸(主要是dCTP，例如三个dCTP)。如在本文中其他地方更详细所述，这些额外核苷酸可适用于使得能够在模板转换寡核苷酸的3’杂交结构域与初生链的3’末端之间进行杂交，例如以有助于由聚合酶从模板向所述模板转换寡核苷酸进行模板转换。

在一些情况下，用于主题方法中的逆转录酶可为热敏性聚合酶，即不是热稳定的聚合酶。所述热敏性聚合酶可在高于它们的活性温度范围的温度下变为是非活性的。举例来说，在一些情况下，热敏性聚合酶可在暴露于75°或更高、80°或更高、85°或更高、90°或更高、或95°或更高的温度之后变为是非活性的，或显示活性显著降低。

当采用逆转录酶时，它可被组合至反应混合物中以使所述逆转录酶的最终浓度足以产生所需量的RT反应产物，例如所需量的单一产物核酸。在某些方面，逆转录酶(例如MMLV RT、家蚕RT等)以0.1至200单位/μL(U/μL)，诸如0.5至100U/μL，诸如1至50U/μL，包括5至25U/μL，例如20U/μL的最终浓度存在于反应混合物中。

本公开的方法包括使用扩增聚合酶，例如用于使用模板转换寡核苷酸和单一产物核酸引物来从单一产物核酸进行扩增以产生经扩增的dsDNA产物。可采用任何适宜扩增聚合酶，包括但不限于DNA聚合酶，包括热稳定聚合酶。适用的扩增聚合酶包括例如Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、其衍生物等。在一些情况下，扩增聚合酶可为热启动聚合酶，包括但不限于例如热启动Taq DNA聚合酶、热启动Pfu DNA聚合酶等。

热启动聚合酶将变化，并且可包括例如以与聚合酶结合剂的复合物形式存在的聚合酶，所述聚合酶结合剂与所述聚合酶直接缔合以阻止或抑制它的持续性，即阻止所述聚合酶使核酸聚合。聚合酶结合剂将变化，并且可包括例如特异性结合聚合酶，从而阻止它的活性的抗体、适体等。在“热启动”反应中，将反应加热可用于使聚合酶结合剂从聚合酶解离，从而允许聚合酶使核酸聚合。热启动聚合酶也可为热稳定的。

使扩增聚合酶组合至反应混合物中以使扩增聚合酶的最终浓度足以产生所需量的产物核酸，例如所需量的产物经扩增的dsDNA。在某些方面，扩增聚合酶(例如热稳定DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶等)以0.1至200单位/μL(U/μL)，诸如0.5至100U/μL，诸如1至50U/μL，包括5至25U/μL，例如20U/μL的最终浓度存在于反应混合物中。

如上所述，主题方法可包括使dNTP组合至反应混合物中。在某些方面，将四种天然存在的dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)中的各者添加至反应混合物中。举例来说，可将dATP、dGTP、dCTP和dTTP添加至反应混合物中以使各dNTP的最终浓度是0.01至100mM，诸如0.1至10mM，包括0.5至5mM(例如1mM)。在一些情况下，添加至反应混合物中的一种或多种类型的核苷酸可为非天然存在的核苷酸，例如具有与其连接的结合部分或其他部分(例如荧光部分)的经修饰核苷酸、核苷酸类似物、或适用于主题方法或目标下游应用中的任何其他类型的非天然存在的核苷酸。

可使反应混合物经受各种温度以驱动反应的各个方面，包括但不限于例如核酸的变性/熔解、核酸的杂交/退火、聚合酶介导的伸长/延伸等。进行各种过程所处的温度可根据发生的过程加以提及，包括例如熔解温度、退火温度、伸长温度等。用于所述过程的最优温度将例如视所用聚合酶，视核酸的特征等而变化。用于包括逆转录酶和扩增聚合酶的特定聚合酶的最优温度可易于从参考教科书获得。与核酸相关的最优温度例如退火温度和熔解温度可易于基于主题核酸的已知特征来计算，所述特征包括例如总长度、杂交长度、G/C含量百分比、二级结构预测等。

一旦产生经扩增的dsDNA产物，方法可包括将产物直接输入一个或多个目标下游应用(例如克隆、测序等)中。在其他方面，方法可包括使用产物作为例如向载体中的dsDNA插入物以达成克隆和/或文库构建。

模板核酸

模板核酸可存在于模板核酸组合物(例如确定组合物)或生物样品(例如从活生物体和/或活细胞获得或含有活生物体和/或活细胞的样品)中。含有模板核酸的生物样品可通过任何适宜手段来制备以致使样品的核酸可为本文所述方法的组分(例如引物、寡核苷酸等)所用。制备含有模板核酸的生物样品可包括但不限于例如使样品均质化，使样品的一种或多种细胞类型溶解，使样品中的所需核酸富集，移除一种或多种存在于样品中的组分(例如蛋白质、脂质、污染性核酸)，进行核酸分离以分离模板核酸，等。

本公开的模板核酸可含有多个具有不同序列的不同模板核酸。模板核酸(例如模板RNA、模板DNA等)可为任何长度的聚合物。尽管聚合物的长度可变化，但在一些情况下，聚合物是10nt或更长、20nt或更长、50nt或更长、100nt或更长、500nt或更长、1000nt或更长、2000nt或更长、3000nt或更长、4000nt或更长、5000nt或更长或更多nt。在某些方面，模板核酸是聚合物，其中聚合物上碱基的数目可变化，并且在一些情况下，是10nt或更少、20nt或更少、50nt或更少、100nt或更少、500nt或更少、1000nt或更少、2000nt或更少、3000nt或更少、4000nt或更少、或5000nt或更少、10,000nt或更少、25,000nt或更少、50,000nt或更少、75,000nt或更少、100,000nt或更少。

根据某些实施方案，模板核酸是模板核糖核酸(模板RNA)。模板RNA可为任何类型的RNA(或其亚型)，包括但不限于信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反式作用性小干扰RNA(ta-siRNA)、天然小干扰RNA(nat-siRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、非编码RNA(ncRNA)、转移-信使RNA(tmRNA)、前体信使RNA(pre-mRNA)、小卡哈尔体(Cajal body)特异性RNA(scaRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核糖核酸内切酶制备的siRNA(esiRNA)、小时序RNA(stRNA)、信号识别RNA、端粒RNA、核酶、或其RNA类型或其亚型的任何组合。

根据某些实施方案，模板核酸是模板脱氧核糖核酸(模板DNA)。模板DNA可为任何类型的DNA(或其亚型)，包括但不限于基因组DNA(例如原核基因组DNA(例如细菌基因组DNA、古细菌基因组DNA等)、真核基因组DNA(例如植物基因组DNA、真菌基因组DNA、动物基因组DNA(例如哺乳动物基因组DNA(例如人基因组DNA、啮齿动物基因组DNA(例如小鼠、大鼠等)等)、昆虫基因组DNA(例如果蝇(drosophila))、两栖动物基因组DNA(例如非洲蟾蜍(Xenopus)等)))、病毒基因组DNA)、线粒体DNA、或其DNA类型或其亚型的任何组合。

给定模板核酸组合物中具有不同序列的不同模板核酸的数目可变化。尽管给定模板核酸组合物中不同模板核酸的数目可变化，但在一些情况下，给定模板核酸组合物中不同模板核酸的数目在1至10⁸，诸如1至10⁷，包括1至10⁵的范围内。

所述方法中采用的模板核酸组合物可为任何适合核酸样品。可使包括模板核酸的核酸样品以足以产生产物核酸的量组合至反应混合物中。根据一个实施方案，使核酸样品组合至反应混合物中以使反应混合物中核酸的最终浓度是1fg/μL至10μg/μL，诸如1pg/μL至5μg/μL，诸如0.001μg/μL至2.5μg/μL，诸如0.005μg/μL至1μg/μL，诸如0.01μg/μL至0.5μg/μL，包括0.1μg/μL至0.25μg/μL。在某些方面，包括模板核酸的核酸样品从单一细胞分离，例如如以下更详细所述。在其他方面，包括模板核酸的核酸样品从2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、或500个或更多个细胞分离。根据某些实施方案，包括模板核酸的核酸样品从500个或更少个、100个或更少个、50个或更少个、20个或更少个、10个或更少个、9、8、7、6、5、4、3或2个细胞分离。

模板核酸可存在于任何目标核酸样品中，所述核酸样品包括但不限于从单一细胞、多个细胞(例如所培养细胞)、组织、器官、生物体(例如细菌、酵母等)分离的核酸样品。在某些方面，核酸样品从哺乳动物(例如人、啮齿动物(例如小鼠)、或任何其他目标哺乳动物)的细胞、组织、器官和/或类似物分离。在其他方面，核酸样品从除哺乳动物以外的来源分离，所述来源诸如细菌、酵母、昆虫(例如果蝇)、两栖动物(例如蛙(例如非洲蟾蜍属))、病毒、植物、或任何其他非哺乳动物核酸样品来源。

用于从所述来源分离核酸的方法、试剂和试剂盒在本领域中是已知的。举例来说，用于从目标来源分离核酸的试剂盒-诸如由Clontech Laboratories，Inc.(MountainView，CA)销售的和基因组DNA或RNA分离试剂盒-可商购获得。在某些方面，核酸从经固定生物样品例如经福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织分离。来自FFPE组织的核酸可使用可商购获得的试剂盒-诸如由ClontechLaboratories，Inc.(Mountain View，CA)销售的FFPE DNA或RNA分离试剂盒加以分离。

非模板化序列和非模板序列

术语“非模板化序列”和“非模板序列”通常是指主题方法中涉及的不对应于模板(例如不存在于模板中，不具有模板中的互补序列，或不可能存在于模板中或具有模板中的互补序列)的那些序列。非模板化序列是不通过例如RNA或DNA模板的模板来加以模板化的那些，因此它们可在不存在相应模板下在伸长反应期间添加，例如通过具有非模板引导的末端转移酶活性的聚合酶来添加的核苷酸。非模板序列和非模板化序列可但不仅仅指代存在于引物或模板转换寡核苷酸上的那些不与模板杂交的序列，在一些情况下，所述序列可被称为非杂交序列。非模板化序列将在大小与组成两个方面变化。在一些情况下，非模板化序列，例如存在于模板转换寡核苷酸或单一产物核酸引物上的非模板化序列，可在10nt至1000nt或更多的范围内，包括但不限于例如10nt至900nt、10nt至800nt、10nt至700nt、10nt至600nt、10nt至500nt、10nt至400nt、10nt至300nt、10nt至200nt、10nt至100nt、10nt至90nt、10nt至80nt、10nt至70nt、10nt至60nt、10nt至50nt、10nt至40nt、10nt至30nt、10nt至20nt等。

在一些情况下，如上指示的非模板化序列可包括在模板转换寡核苷酸的3’杂交结构域中。当存在于模板转换寡核苷酸的3’杂交结构域中时，非模板化序列可包括异多核苷酸或由异多核苷酸组成，其中这种异多核苷酸的长度可变化，长度是2至10nt，诸如长度是3至7nt，包括3nt。在一些情况下，存在于模板转换寡核苷酸的3’杂交结构域中的非模板化序列可包括同多核苷酸或由同多核苷酸组成，其中这种同多核苷酸的长度可变化，长度是2至10nt，诸如长度是3至7nt，包括3nt。

存在于模板转换寡核苷酸或引物例如单一产物核酸引物上的非模板化序列可存在于所述模板转换寡核苷酸或引物的5’末端，并且在所述情况下可被称为5’非模板化序列。在主题扩增方法中，在一些情况下，模板转换寡核苷酸或单一产物核酸引物中仅一者可包括非模板化序列(例如5’非模板化序列)。在主题扩增方法中，在一些情况下，模板转换寡核苷酸与单一产物核酸引物两者均包括非模板化序列(例如5’非模板化序列)。当模板转换寡核苷酸与单一产物核酸引物两者均包括非模板化序列时，非模板化序列可相同或不同。在一些情况下，模板转换寡核苷酸与单一产物核酸引物两者均可具有相同5’非模板化序列。

在一些情况下，包括例如5’非模板化序列的非模板化序列可包括一个或多个限制核酸内切酶识别位点。在一些情况下，在扩增之后，一个或多个限制核酸内切酶识别位点可被并入经扩增的dsDNA中，从而允许对经扩增的dsDNA的操作，例如在一个或多个并入的限制核酸内切酶识别位点处裂解经扩增的dsDNA。

在一些情况下，包括例如5’非模板化序列的非模板化序列可包括一个或多个引物结合位点。在一些情况下，在扩增之后，一个或多个引物结合位点可被并入经扩增的dsDNA中，从而允许对经扩增的dsDNA的进一步扩增，包括例如使用一个或多个引物结合位点来扩增经扩增的dsDNA的一部分，包括例如通过使用一个或多个引物结合位点对经扩增的dsDNA进行巢式PCR。

视引物结合位点和相应引物的所需复杂性而定，适用引物结合位点将广泛变化。在一些情况下，适用的引物结合位点包括与II A引物(例如如可从Takara Bio USA，Inc.，Mountain View，CA获得)具有互补性的那些。根据一个实施方案，模板转换寡核苷酸包括非模板序列，其包括II A引物结合位点。根据一个实施方案，单一产物核酸引物包括非模板序列，其包括II A引物结合位点。根据一个实施方案，模板转换寡核苷酸与单一产物核酸引物两者均包括非模板序列，其包括II A引物结合位点。

在一些情况下，包括例如5’非模板化序列的非模板化序列可包括一个或多个条型码序列，在一些情况下，所述条型码序列可为或可包括以下详述的独特分子标识符(UMI)结构域和/或条型码化独特分子标识符(BUMI)结构域。在一些情况下，非模板化序列的一个或多个条型码序列可提供对经扩增的dsDNA的来源的回顾性鉴定，例如在其中对条型码进行测序的测序反应之后。举例来说，在一些情况下，在扩增期间并入包括为模板的来源(例如样品、孔、细胞等)所特有的条型码的非模板化序列。所述来源鉴定条型码可在本文中称为“来源条型码序列”，并且所述序列可变化并可被指定基于通过条型码来鉴定的来源的术语。来源条型码可包括例如样品条型码序列，其回顾性地鉴定模板所源于的样品；孔条型码序列，其回顾性地鉴定模板所源于的孔(例如多孔板的孔)；小滴条型码序列，其回顾性地鉴定模板所源于的小滴；细胞条型码序列，其回顾性地鉴定模板所源于的细胞(例如多细胞样品的细胞)；等。条型码可适用于各种程序中，包括例如其中例如在测序之前在条型码化之后将核酸汇合。

在一些情况下，例如存在于模板转换寡核苷酸和/或单一产物核酸引物上的非模板化序列包括测序平台衔接物构建体。就“测序平台衔接物构建体”来说，其意指包括由目标测序平台利用的核酸结构域(例如测序平台衔接物核酸序列)或其互补序列的至少一部分的核酸构建体，所述测序平台诸如由(例如HiSeq^TM、MiSeq^TM和/或GenomeAnalyzer^TM测序系统)；Ion Torrent^TM(例如Ion PGM^TM和/或Ion Proton^TM测序系统)；Pacific Biosciences(例如PACBIO RS II测序系统)；Life Technologies^TM(例如SOLiD测序系统)；Roche(例如454GS FLX+和/或GS Junior测序系统)提供的测序平台；或任何其他目标测序平台。

在某些方面，非模板化序列包括测序平台衔接物构建体，其包括核酸结构域，所述核酸结构域是特异性结合表面连接的测序平台寡核苷酸(例如连接于测序系统中的流动槽的表面的P5或P7寡核苷酸)的结构域(例如“捕集位点”或“捕集序列”)；测序引物结合结构域(例如平台的读段1引物或读段2引物可结合的结构域)。测序平台衔接物构建体可包括具有适于目标测序平台的任何长度和序列的核酸结构域(例如“测序衔接物”)。在某些方面，核酸结构域的长度是4至200nt。举例来说，核酸结构域的长度可为4至100nt，诸如长度是6至75、8至50、或10至40nt。根据某些实施方案，测序平台衔接物构建体包括长度是2至8nt，诸如长度是9至15、16-22、23-29、或30-36nt的核酸结构域。

核酸结构域可具有使得由目标测序平台采用的多核苷酸(例如寡核苷酸)能够特异性结合核酸结构域，例如以通过合成由核酸结构域侧接的cDNA插入物来达成固相扩增和/或测序的长度和序列。示例性例核酸结构域包括在基于的测序平台上采用的P5(5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’)(SEQ ID NO：1)，P7(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’)(SEQ ID NO：2)、读段1引物(5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’)(SEQ IDNO：3)和读段2引物(5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’)(SEQ ID NO：4)结构域。其他示例性核酸结构域包括在基于Ion Torrent^TM的测序平台上采用的A衔接物(5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3’)(SEQ ID NO：5)和P1衔接物(5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’)(SEQ ID NO：6)结构域。

适用于在目标测序平台上进行的测序的非模板化序列结构域的核苷酸序列可变化和/或随时间而变化。衔接物序列通常由测序平台的制造商提供(例如在与测序系统一起提供和/或可在制造商的网站上获得的技术文件中)。基于所述信息，非模板化序列(例如模板转换寡核苷酸和/或单一产物核酸引物和/或类似物)的测序平台衔接物构建体的序列可被设计来以使得能够在目标平台上对核酸插入物(对应于模板核酸)测序的构型包括一个或多个核酸结构域的全部或一部分。可包括在非模板化序列中的测序平台衔接头构建体以及本文所述的其他核酸试剂进一步描述于以US 2015-0111789 A1公开的美国专利申请序列号14/478,978中，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。

非模板化序列可通过多种手段来例如添加至模板转换寡核苷酸、单一产物核酸引物、经扩增的产物dsDNA等中。举例来说，如上所指示，非模板化序列可通过具有末端转移酶活性的聚合酶的作用来添加。例如存在于引物或寡核苷酸上的非模板化序列可在扩增反应期间并入产物核酸中。在一些情况下，非模板化核酸序列可直接连接于核酸，例如在扩增之前直接连接于引物或寡核苷酸，在扩增之后直接连接于产物核酸，等。使非模板化序列直接连接于靶标核酸的方法将变化，并且可包括但不限于例如连接、化学合成/连接、酶促核苷酸添加(例如通过具有末端转移酶活性的聚合酶)等。

在一些情况下，方法可包括使测序平台衔接物构建体连接于产物核酸或其衍生物(诸如如上所述的经扩增的dsDNA)的末端，例如在其中单一产物核酸引物和模板转换寡核苷酸不包括所述衔接头构建体的那些实施方案中。连接于产物核酸或其衍生物的末端的衔接物构建体可包括适用于下游测序应用中的任何序列元件，包括以上关于模板转换寡核苷酸和/或单一产物核酸合成引物的任选测序平台衔接物构建体所述的任何元件。举例来说，连接于产物核酸或其衍生物的末端的衔接物构建体可包括选自由以下组成的组的核酸结构域或其互补序列：特异性结合表面连接的测序平台寡核苷酸的结构域、测序引物结合结构域、条型码结构域、条型码测序引物结合结构域、分子标识结构域及其组合。

根据某些实施方案，连接于产物核酸或其衍生物的末端的测序平台衔接物构建体存在于单一核酸分子上。在某些方面，当测序平台衔接物构建体存在于单一分子上时，使构建体连接于产物核酸或其衍生物会产生包括产物核酸或其衍生物和测序平台衔接物构建体的环状核酸。所述实施方案适用于多种应用中，例如其中可合乎需要的是在单一核酸上接合多个核酸序列元件。仅仅作为一个实例，当可合乎需要的是将产物核酸或其衍生物克隆至载体(例如克隆载体、表达载体、病毒载体、或任何其他目标载体类型)中时。因此，当连接于产物核酸或其衍生物的末端的测序平台衔接物构建体存在于单一核酸分子上时，所述单一核酸分子可进一步包括目标载体元件，包括但不限于可选择标记(例如对宿主生物体赋予对选择剂的抗性的遗传元件)；报告基因(例如编码荧光蛋白(例如GFP、RFP等)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)的基因或任何其他适用报告基因)；启动子(例如T7、T3或其他启动子)；复制起点(例如oriC)；多克隆位点或所述元件的任何组合。

如上所概述，主题方法的实施方案包括使测序平台衔接物构建体连接于产物核酸或其衍生物的末端。就产物核酸的“衍生物”来说，其意指产物核酸的经修饰形式和/或由产物核酸产生的核酸。产物核酸的经修饰形式的一个实例是通过用酶(例如像核酸酶(例如限制核酸内切酶、核酸外切酶、RNA酶等)、尿嘧啶-N-糖基化酶(UDG)、尿嘧啶特异性切除试剂和/或类似物)、对产物核酸的一个或多个核苷酸进行修饰的化学物质、或对产物核酸的一个或多个核苷酸进行所需修饰的任何其他试剂处理产物核酸所产生的单链或双链核酸。

在某些方面，经扩增的核酸例如经扩增的dsDNA或其衍生物的一个或两个末端包括限制酶的识别位点，并且对双链产物核酸衍生物的末端进行修饰包括使限制酶与它的识别位点接触，以使所述限制酶裂解(或“消化”)末端。经裂解末端可为钝性末端或“粘性”末端，并且使测序平台衔接物构建体连接可包括使构建体连接于钝性或粘性末端。根据某些实施方案，一个或多个限制酶识别位点被工程改造至产物核酸中(例如通过选择这种识别位点以及使其包括在模板转换寡核苷酸、第一链合成引物、或两者中)以有助于使测序平台衔接物构建体连接(attachment)(例如连接(ligation))于产物核酸或其双链衍生物的经处理末端。

测序平台衔接物构建体的连接可使用任何适合方法来实现。在某些方面，使用与“无缝”克隆策略相同或类似的方法来使衔接物构建体连接于产物核酸或其衍生物的末端。无缝策略消除一轮或多轮限制酶分析和消化、DNA末端修复、脱磷酸化、连接、酶失活和净化，并且消除相应核酸物质损失。目标无缝连接策略包括：可从Takara Bio USA，Inc.(Mountain View，CA)获得的克隆系统、如Li和Elledge(2007)Nature Methods4：251-256中所述的SLIC(序列和连接酶非依赖性克隆(sequence and ligaseindependent cloning))；如Gibson等(2009)Nature Methods 6：343-345中所述的吉布森(Gibson)装配；如Quan和Tian(2009)PLoS ONE 4(7)：e6441中所述的CPEC(环状聚合酶延伸克隆(circular polymerase extension cloning))；如Zhang等(2012)Nucleic AcidsResearch 40(8)：e55中所述的SLiCE(无缝连接克隆提取(seamless ligation cloningextract))以及属于Life Technologies(Carlsbad，CA)的无缝克隆技术。根据某些实施方案，使用吉布森装配来使衔接物构建体连接于产物核酸或其衍生物的末端，所述装配使得无论片段长度或末端相容性如何都能够在单管等温反应中高效连接核酸。根据这种方法，核酸外切酶产生有助于在一个末端(重叠区)共有互补性的片段的退火的单链3′突出部分，聚合酶填充(或“修复”)各退火片段内的空位，并且DNA连接酶使所装配DNA中的切口密封。结果是可充当用于目标下游应用的输入物质的双链完全密封DNA分子，所述应用例如是使用目标测序平台进行的测序(伴有或不伴有在测序之前的扩增)。

任何适合方法都可用于对具有少于全部的适用于目标测序平台或为目标测序平台所必需的测序结构域的产物核酸或其衍生物提供额外核酸测序结构域。举例来说，产物核酸或其衍生物可使用在它们的5’末端(例如引物的互补于产物核酸或其衍生物的区域的5’)具有衔接物序列的PCR引物来扩增，以使扩增子以任何所需构型包括原始产物核酸中的衔接物序列以及引物中的衔接物序列。可采用其他方法，包括基于无缝克隆策略、限制消化/连接等的那些。

BUMI结构域

如上所指示，在一些情况下，本公开的方法可采用包括条型码化独特分子标识符(BUMI)结构域的非模板化核酸序列。举例来说，非模板化序列，包括连接于引物或模板转换寡核苷酸的非模板化序列，可包括BUMI结构域。在一些情况下，可使一个或多个包括BUMI结构域的核酸连接(ligate)或以其他方式连接(attach)于本文所述的核酸，包括但不限于例如模板核酸、单一产物核酸、经扩增的dsDNA产物等。

BUMI结构域是核酸的包括BUMI标签或其部分的区域或子序列。BUMI标签由一系列散布条型码和独特分子标识符(UMI)碱基组成。就散布来说，其意指是条型码碱基(即共同构成BUMI标签的条型码组分的碱基)的碱基分布或定位在UMI碱基(即共同构成BUMI标签的UMI结构域的碱基)之中。因此，存在于BUMI结构域中的给定BUMI标签或其部分是包括至少一个邻近于至少一个条型码碱基定位的UMI碱基的BUMI标签或其部分，其中在其中BUMI标签由3个或更多个碱基组成的那些情况下，至少两个第一类型(例如UMI或条型码)碱基可由至少一个另一类型(例如UMI或条型码)碱基分隔。给定BUMI标签的长度可变化，在一些情况下，在2至200nt，诸如3至100nt，包括4至50nt的范围内，其中在一些情况下，长度在5至25nt，例如6至20nt的范围内，其中特定目标长度包括但不限于：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16nt。

在给定BUMI标签中，条型码碱基的数目可变化，在一些情况下，在1至20，诸如1至10，例如1至6的范围内。给定BUMI标签中邻接条型码碱基的数目也可变化，在一些情况下，在1至10，诸如1至5，例如1至3的范围内。在给定BUMI标签中，UMI碱基的数目也可变化，在一些情况下，在1至20，诸如1至12，包括1至10，例如1至6的范围内。给定BUMI标签中邻接UMI碱基的数目也可变化，在一些情况下，在1至10，诸如1至5，例如1至3的范围内。此外，条型码碱基和UMI碱基的样式和比率可变化。在一些情况下，避免邻接放置条型码碱基以便降低获得与引物具有假同源性的BUMI标签的可能性。条型码碱基和UMI碱基的样式的其他实例包括：(a)一个条型码碱基继之以两个UMI碱基，其中这个样式在BUMI标签的整个长度中加以重复；(b)一个条型码碱基继之以一个UMI碱基，接着继之以一个条型码碱基和两个UMI碱基，并且这个五碱基单元持续总计两个或更多个五碱基单元加以重复，继之以条型码碱基，接着是UMI碱基在BUMI标签的末端；等。可构建在条型码碱基和UMI碱基的样式方面的许多所述变化形式。根据需要，BUMI标签可由天然存在或非天然存在的碱基组成。因此，BUMI标签可仅由天然存在的碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶组成。或者，BUMI标签也可并有一个或多个能够充当聚合酶的模板的经修饰核苷酸和核苷酸类似物，诸如尤其是甲基化核苷酸、生物素化核苷酸(例如生物素-11-dUTP或5-(bio-AC-AP3)dCTP)、用染料或半抗原修饰的核苷酸、经硼修饰的核苷酸(5′-α-[P-甲硼烷代]-三磷酸2′-脱氧核苷)、经二茂铁标记的dTTP类似物(例如5′-三磷酸5-(3-二茂铁甲酰胺基丙烯基-1)2′-脱氧尿苷(Fcl-dUTP))。因此，BUMI标签可并有以下中的一者或多者：经修饰核苷酸和核苷酸类似物(例如LNA、FANA、2’-O-Me RNA、2’-氟RNA等)、键联修饰(例如硫代磷酸酯、3’-3’和5’-5’反向键联)、5’末端和/或3’末端修饰(例如5’和/或3’氨基、生物素、DIG、磷酸、硫醇、染料、淬灭剂等)、一个或多个经荧光标记nt、或提供所需功能性的任何其他特征。除使用杂交和/或测序方法检测之外，在BUMI标签中使用经修饰核苷酸也可允许并有所述标签的PCR产物通过电泳迁移率差异、荧光、抗体结合和/或酶活性来检测。

根据需要，BUMI标签的序列可变化。在一些情况下，BUMI的待测序的第一碱基(例如最5’核苷酸)是UMI碱基。这个构型使测序读段的复杂性增加，从而在一些下游应用中产生改进结果。给定BUMI标签可包括汉明距离(Hamming distance)，并且可具有纠错性。BUMI可被构造以使它们可在某些下游应用中用于纠错。BUMI可被构造以测定SNP置信度(例如观察的SNP是真实的，而非是通过扩增来传播的PCR错误的置信度)。在一些情况下，BUMI标签可在一个或多个条型码碱基中包括可被纠正的错误。了解BUMI标签中条型码碱基的错误率可提供同一BUMI标签中UMI碱基的错误率的信息，因为相比于处于传统条型码-UMI定向，位置更加靠近。

图7A至图7D提供对例如在一些情况下可被包括在例如本发明方法的引物或模板转换寡核苷酸的核酸的非模板化序列中的不同类型的BUMI结构域的说明。在图7A中，所说明的BUMI结构域与BUMI标签重合或完全由BUMI标签组成，以致说明为一系列B和U核苷酸的所述BUMI标签与BUMI结构域具有相同长度。在图7B中，BUMI结构域仅包括BUMI标签(如由四核苷酸BUBU序列所说明)的一部分。也显示的是一个或多个根据需要可具有任何所需序列，并且在长度方面可变化的额外核苷酸子序列(由黑色棒条指示)，其中在一些情况下，这个子序列的长度在1至10nt，诸如2至8nt，例如3至6nt的范围内。图7C说明包括例如如图7A中所示的完全BUMI标签偶联于BUMI编码组分(指定为ENC)的BUMI结构域，其中所述BUMI结构域的这个组分在以下更详细描述。图7D说明包括编码组分和部分BUMI标签的BUMI结构域。

在一些情况下，可使核酸组合物(即多个具有特定类型的个别核酸分子，其中视情形而定，各个别核酸可相同或不同)与多个含有不同BUMI结构域的核酸组合或使用多个含有不同BUMI结构域的核酸加以扩增，所述核酸至少关于存在于BUMI结构域中的BUMI标签或其部分的UMI部分是不同于彼此的。如本文所用，在一些情况下，术语“含有不同BUMI结构域的核酸”可指包括BUMI结构域的引物或模板转换寡核苷酸。因此，可例如通过用具有BUMI结构域的引物和/或模板转换寡核苷酸进行扩增来使BUMI结构域附接于反应的扩增产物。

在一些情况下，使核酸组合物与多个含有不同BUMI结构域的核酸组合有助于例如通过连接或其他连接方法来使含有BUMI结构域的核酸连接于所述组合物的个别核酸分子。举例来说，可使含有BUMI结构域的核酸与含有多个不同模板(例如RNA模板、DNA模板)或单一产物核酸的核酸组合物组合，从而有助于使含有BUMI结构域的核酸连接于所述多个模板或单一产物核酸的个别分子。

BUMI结构域的BUMI标签或其部分的UMI部分的独特组合的数目可变化，并且在一些情况下，数目是50或更多，例如250或更多，包括500或更多，其中在一些情况下，数目是1,000或更多、5,000或更多、10,000或更多、50,000或更多、100,000或更多、250,000或更多、500,000或更多、1,000,000或更多，包括5,000,000或更多，诸如50,000,000或更多，包括100,000,000或更多，包括1,000,000,000或更多，其中在一些情况下，数目是100,000,000或更少，诸如1,000,000或更少，诸如750,000或更少，包括500,000或更少。BUMI结构域的BUMI标签或其部分的UMI部分的独特组合的数目可为BUMI标签的UMI核苷酸的数目的函数。举例来说，如果在BUMI标签中存在10个UMI核苷酸(例如贯穿BUMI分散在条型码核苷酸之中，例如如上所述)，那么存在UMI核苷酸的4¹⁰个可能独特组合。在所述组合物的BUMI结构域的BUMI标签或其部分之中，在一些情况下，组合物的不同BUMI标签或其部分具有共同条型码碱基和不同UMI核苷酸。换句话说，BUMI结构域的不同BUMI标签或其部分中各条型码碱基的身份和位置是相同的，但在组合物的含有BUMI结构域的核酸的2个或更多个BUMI标签或其部分之间，各UMI碱基的身份是不同的。出于给定应用，可选择各组BUMI标签以使组中各标签的条型码部分具有相等C-G与A-T比率，因此消除BUMI标签之间在熔解温度方面的差异。也可选择BUMI标签组以使在各标签的条型码部分之间存在至少三核苷酸差异，由此在来源于一个BUMI标记的样品的分子变得被错误鉴定为来源于不同样品之前需要进行三重核苷酸序列取代。

如上所指示，含有BUMI结构域的核酸可例如关于BUMI结构域组分(其可包括完整BUMI标签或其一部分，其中这些标签或其部分可被编码)或核酸的其他组分诸如引物结合结构域、模板转换结构域等而变化。现时更详细综述不同类型的含有BUMI结构域的核酸的实例。

在一些情况下，模板转换寡核苷酸可包括例如如上所述的BUMI结构域。含有BUMI结构域的模板转换寡核苷酸可包括模板转换结构域和例如如上所述的BUMI结构域(其可包括BUMI标签或其部分，并且可或可不被编码，例如如以下更详细所述)。在一些情况下，模板转换结构域可为或可包括如上所述的3’杂交结构域。模板转换结构域可位于BUMI结构域(以及模板转换寡核苷酸的任何其他结构域)的3’。

对具有BUMI结构域的模板转换寡核苷酸的说明提供于图8中。如图8中所示，模板转换寡核苷酸(800)包括3’杂交即模板转换结构域(801)，任选包括5′额外非模板化序列结构域(802)和具有BUMI标签的例如如图7A中说明的BUMI结构域(803)，所述BUMI结构域位于这两个侧接结构域之间，以致所述BUMI结构域由所述模板转换结构域和所述5′额外非模板化序列结构域侧接。

在一些情况下，例如如包括在引物或模板转换寡核苷酸中的BUMI结构域可包括BUMI标签的一部分，其中BUMI标签部分也可被称为拆分BUMI。因为这些实施方案的核酸的BUMI结构域仅包括BUMI标签的一部分，所以它们不包括完整BUMI标签。这些实施方案的BUMI标签的部分包括它们是其一部分的BUMI标签的nt总数的百分比，其中给定BUMI标签部分中的nt的所述百分比可变化，在一些情况下，在10至95％，诸如15至75％，例如40至60％，包括45至65％的范围内，其中在一些情况下，所述百分比可为50％，以致BUMI标签部分是完整BUMI标签的一半。

包括具有BUMI标签的一部分的BUMI结构域的核酸适用于多种应用中，其中可合乎需要的是将BUMI标签拆分在不同核酸之中。在一个核酸例如单一产物核酸引物、模板转换寡核苷酸(TSO)等上完整具有长BUMI标签可干扰给定应用或方案的一个或多个方面，例如第一链合成、模板转换效率等，和/或导致例如引物、TSO等的试剂更难以合成。将BUMI标签拆分在给定方案中采用的不同核酸试剂例如单一产物核酸合成引物和TSO之中允许在各核酸试剂上使用较短BUMI结构域，同时维持伴随较长UMI的多样性。当在所述实施方案中使用拆分BUMI标签时，对BUMI标签的所有部分例如BUMI标签的两个半部测序以允许重构完全BUMI标签。当需要时，计算机执行算法可用于鉴定拆分BUMI的各部分的条型码部分和UMI部分，并且由此重构完全BUMI标签。

如上所概述，在一些情况下，诸如单一产物核酸引物的引物可包括BUMI结构域。举例来说，图9提供对包括BUMI结构域的单一产物核酸引物(900)的说明，其中例如在一些情况下，所述BUMI结构域包括BUMI标签的一部分。如所说明，核酸(900)包括三个结构域，即在本实例中包括BUMI标签的一部分的BUMI结构域(901)，与模板核酸杂交的模板结合结构域(902)，以及任选地，不与所述模板核酸杂交的额外非模板序列(NTS)结构域(903)。第一结构域和第二结构域(即非BUMI结构域)的序列可为独立确定的或任意的。在某些方面，模板结合结构域(902)具有确定序列(例如寡dT序列或模板特异性序列)或任意序列(例如随机序列，诸如随机六聚体序列)，并且额外NTS结构域(903)的序列是确定的。

在一些情况下，例如引物和/或模板转换寡核苷酸的核酸可包括经编码BUMI结构域。经编码BUMI结构域包括BUMI标签组分，其可具有例如如上所述的完整BUMI标签或其部分；以及提供关于散布条型码nt和UMI nt在所述BUMI标签组分中的顺序的信息的编码组分。因为编码组分提供关于散布条型码nt和UMI nt的顺序的信息，所以它可被视为标识条型码nt和UMI nt在BUMI标签或BUMI标签部分中的顺序的流程码。因此，编码组分的序列用于确定BUMI标签或其部分中哪些碱基是条型码nt，以及哪些碱基是UMI nt，以使条型码nt和UMI nt在BUMI标签中的位置可根据编码结构域确定。经编码BUMI结构域适用于其中需要UMI具有极大多样性，但需要BUMI标签具有较短长度的应用中。较长UMI提供独特序列的较大多样性，并且允许对增加数目的分子进行独特标记。然而，在一些情况下，较长序列不合乎需要，因为它们可导致例如较低模板转换效率或其他复杂情况。如本文所述的经编码BUMI结构域允许在使用较短BUMI的情况下在给定群体内维持与较长UMI类似的多样性。以这个方式，BUMI的汇合物在长度方面可较短，但仍然维持多样性。

BUMI结构域的经编码BUMI标签或其部分的编码组分的长度可变化，在一些情况下，长度在1至10nt，例如1至5nt，包括2至4nt的范围内。编码组分的位置可根据需要而变化，其中在一些情况下，编码组分位于BUMI标签组分的5′，并且在其他情况下，编码组分在BUMI标签组分的3′。编码组分可或可不由间插碱基或碱基序列来与BUMI标签组分分隔。如果存在，那么这种间插结构域的长度可变化，在一些情况下，在1至3nt，诸如1至2nt的范围内。

图10提供经编码BUMI结构域的实例，其中经编码BUMI结构域包括编码组分和BUMI标签组分。在图10的经编码BUMI结构域中，编码结构域的长度是3nt，其中各三碱基长度编码结构域标识独特8nt长度BUMI标签。

经编码BUMI结构域可根据需要用作给定方案的任何核酸试剂。因此，经编码BUMI结构域可用于诸如以上所述的核酸引物、模板转换寡核苷酸等中，其中经编码BUMI结构域可包括例如如上所述的完整BUMI标签或BUMI标签的一部分。在其中采用经编码BUMI结构域的应用中，编码组分的序列用于解码BUMI标签组分。当需要时，计算机执行算法可用于例如通过鉴定BUMI标签组分中条型码碱基和UMI碱基的样式来解码编码组分，因此鉴定BUMI标签组分(其可为诸如以上所述的完整BUMI标签或其部分)的条型码部分和UMI部分。

在一些情况下，由多个含有不同BUMI结构域的核酸组成的组合物(例如其中不同BUMI结构域连接于或未连接于引物(例如单一产物核酸引物)或模板转换寡核苷酸)可用于主题方法中，例如添加至一种或多种本文所述的反应混合物中。组成给定多个所述组合物的不同的含有BUMI结构域的核酸至少关于它们的BUMI结构域，并且更具体来说至少关于它们的BUMI结构域的BUMI标签或其部分中它们的UMI nt而具有不同序列。因此，多个包括许多不同核酸，其具有它们的BUMI结构域的不同BUMI标签或其部分。在一些情况下，不同BUMI标签或其部分具有共同条型码nt和不同UMI nt。在所述情况下，在多个BUMI结构域的不同BUMI标签或其部分之间，BUMI结构域的BUMI标签或其部分的各条型码nt的身份和位置是相同的，即是同一的，而在BUMI标签或其部分的其余UMI位置处的UMI nt的身份有变化，以致在多个核酸中的任何两个不同核酸中，在BUMI结构域的BUMI标签或其部分的至少一个UMI位置处的至少一个UMI nt的身份例如A、G、C或T不是相同的，即不是同一的。给定组合物中不同的含有BUMI结构域的核酸的数目可变化，并且在一些情况下，数目是50或更多，例如250或更多，包括500或更多，其中在一些情况下，数目是1,000或更多、5,000或更多、10,000或更多、50,000或更多、100,000或更多、250,000或更多、500,000或更多、1,000,000或更多，包括5,000,000或更多，包括100,000,000或更多，包括1,000,000,000或更多，其中在一些情况下，数目是100,000,000或更少，诸如1,000,000或更少，诸如750,000或更少，包括500,000或更少。

额外方法参数

在足以产生包含模板核酸和与单一产物核酸的邻近区域杂交的模板转换寡核苷酸的双链核酸复合物的条件下使反应混合物组分组合。使用模板转换寡核苷酸和第一链cDNA引物在足以产生经扩增的dsDNA的条件下从单一产物核酸进行扩增。

就“足以产生双链核酸复合物的条件”来说，其意指容许反应中的相关核酸以所需方式彼此相互作用(例如杂交)的反应条件。实现适合的反应条件可包括选择反应混合物组分、其浓度和反应温度以创建相关核酸以序列特异性方式彼此杂交所处的环境。举例来说，除模板核酸、模板转换寡核苷酸和单一产物核酸之外，反应混合物也可包括建立适当pH、盐浓度(例如KCl浓度)等的缓冲组分。足以产生双链核酸复合物的条件可包括适于杂交的那些条件，也被称为“杂交条件”。

就“在足以产生经扩增的dsDNA的条件下”来说，其意指容许达成聚合酶介导的与模板杂交的核酸链的末端的延伸的反应条件。适合的反应条件可包括容许达成扩增聚合酶介导的延伸、逆转录酶介导的延伸、或扩增聚合酶介导的延伸与逆转录酶介导的延伸两者的那些。足以产生经扩增的dsDNA的条件可包括足以产生单一产物核酸的条件，并且反应的一个或多个步骤可在所述条件下进行。当反应过程不需要逆转录时(即当向反应混合物提供单一产物核酸时)，适合的反应条件无需关于逆转录与扩增两者加以配置。当用于产生单一产物核酸的模板核酸(例如DNA或非DNA模板(例如RNA模板))是起始物质，并且反应是一步反应时，适合的反应条件将通常是容许达成逆转录与PCR扩增两者的那些。

足以产生单一产物核酸的条件可进一步包括容许聚合酶向模板转换寡核苷酸进行模板转换，以及延伸反应向模板转换寡核苷酸的5’末端继续的反应条件。

实现适合的反应条件可包括选择反应混合物组分、其浓度和反应温度以创建其中一种或多种聚合酶具有活性和/或反应中的相关核酸以所需方式彼此相互作用(例如杂交)的环境。在一些情况下，可配置适合的反应条件以使两种不同聚合酶具有活性，包括例如扩增聚合酶和逆转录酶。在适合的反应条件下，除模板、一种或多种聚合酶、单一产物核酸引物、模板转换寡核苷酸和dNTP之外，反应混合物也可包括建立适于发生延伸反应和/或模板转换的pH、盐浓度(例如KCl浓度)、金属辅因子浓度(例如Mg²⁺或Mn²⁺浓度)等的缓冲组分。可包括其他组分，诸如一种或多种核酸酶抑制剂(例如RNA酶抑制剂和/或DNA酶抑制剂)、一种或多种用于有助于扩增/复制富含GC的序列的添加剂(例如GC-Melt^TM试剂(ClontechLaboratories，Inc.(Mountain View，CA))、甜菜碱、DMSO、乙二醇、1，2-丙二醇或其组合)、一种或多种分子拥挤剂(例如聚乙二醇等)、一种或多种酶稳定性组分(例如在1至10mM的范围内(例如5mM)的最终浓度下存在的DTT)和/或适用于有助于聚合酶介导的延伸反应和/或模板转换的任何其他反应混合物组分。

一种或多种反应混合物可具有适于引物延伸反应和/或模板转换的pH。在某些实施方案中，反应混合物的pH在5至9，诸如7至9，包括8至9，例如8至8.5的范围内。在一些情况下，反应混合物包括pH调节剂。目标pH调节剂包括但不限于氢氧化钠、盐酸、磷酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液等。举例来说，反应混合物的pH可通过添加适量pH调节剂来调节至所需范围。

适于引物延伸反应的温度范围可根据诸如所用特定聚合酶、所用任何引物的熔解温度等的因素而变化。在一些情况下，可采用逆转录酶(例如MMLV逆转录酶)，并且足以达成逆转录酶介导的杂交引物的延伸的反应混合物条件包括使反应混合物达到在4℃至72℃，诸如16℃至70℃，例如37℃至50℃，诸如40℃至45℃的范围内，包括42℃的温度。

在一些情况下，本文所述的方法可包括例如通过使含有模板(例如RNA或DNA模板)的反应混合物经受足以使模板的二级结构变性的温度来使模板变性。视情形而定，变性可在一种或多种反应组分已添加至反应混合物中之前或之后发生，并且在一些情况下，在开始例如逆转录的转录之前进行以产生单一产物核酸。适用的变性温度将变化，并且可在低于50℃至高于100℃的范围内，包括但不限于例如50℃或更高、55℃或更高、65℃或更高、70℃或更高、72℃或更高、75℃或更高、80℃或更高、85℃或更高、90℃或更高、95℃或更高等。

在一些情况下，扩增反应可在一种或多种核酸检测试剂存在下进行，所述检测试剂例如DNA染料，包括荧光DNA染料，诸如像DAPI、Hoechst、PI、DRAQ5、SYBR Green、LCGreen、Eva Green、BEBO、BOXTO、SYTO9等。如本文提及的核酸检测试剂包括游离DNA染料诸如以上所列的那些，以及探针结合的DNA染料，包括但不限于TaqMan探针、MolecularBeacons探针、Scorpions探针、Light-Up探针等。在一些情况下，可将一种或多种核酸检测试剂添加至反应混合物中，并且可根据本文所述的方法进行扩增，以使一种或多种核酸检测试剂可用于检测经扩增的产物dsDNA的存在或监测经扩增的产物dsDNA的产生。因此，检测经扩增的dsDNA的存在或定量经扩增的dsDNA的量可基于核酸检测试剂。在一些情况下，如本文所述的扩增方法可包括定量PCR。

在一些情况下，例如当在适当反应容器或小滴中进行扩增反应时，基于核酸检测试剂对经扩增的dsDNA的检测和/或定量可用于快速筛选和/或分选扩增反应。举例来说，可在核酸检测试剂存在下在多个反应容器(例如多孔板的多个孔)中进行多个扩增反应，并且经扩增的dsDNA的产生可基于所述核酸检测试剂来进行以快速筛选各孔(例如使用板读取器或类似装置)以及检测的成功扩增反应。在一些情况下，可在核酸检测试剂存在下在多个小滴中进行多个扩增反应，并且可基于所述核酸检测试剂来分选小滴(例如使用流式细胞仪、使用基于微流控的小滴分选器等)。

在一些情况下，特异性核酸检测试剂(例如对特定核酸序列具有特异性的经标记探针)可用于检测经扩增的产物dsDNA中特定靶标序列的存在。这种探针可在扩增反应之前、期间或之后添加，并且可涉及使反应混合物经受杂交条件以使经标记探针与经扩增的dsDNA杂交。适用的探针可包括但不限于例如荧光原位杂交(FISH)探针(例如DNA FISH探针、核糖探针、LNA FISH探针等)。适用于检测特定靶标序列的经标记探针将互补于所述靶标序列，并且当与经扩增的dsDNA杂交时，可指示在经扩增的dsDNA中存在所述靶标序列。在一些情况下，例如当在适当反应容器或小滴中进行扩增反应时，基于经标记探针对经扩增的dsDNA中靶标序列的检测和/或定量可用于快速筛选和/或分选扩增反应，例如如以上关于核酸检测试剂所述。

在一些情况下，本公开的方法可包括分离和/或纯化经扩增的dsDNA产物，包括其中在已进行扩增反应之后，包括仅在已进行扩增反应之后进行纯化(即不对扩增反应的中间组分进行纯化)。可采用任何适宜的纯化方法，包括但不限于例如核酸沉淀(即醇沉淀)、凝胶纯化等。

在一些情况下，固体载体(例如珠粒、板等)可用于本发明方法中。举例来说，在一些情况下，单一产物核酸引物可连接于固体载体，并且用于如本文所述的扩增反应中。在一些情况下，模板转换寡核苷酸可连接于固体载体，并且用于如本文所述的扩增反应中。当使载体连接的核苷酸与反应的一种或多种组分或中间体杂交时，固体载体连接的单一产物核酸引物和/或模板转换寡核苷酸可用于分离经扩增的dsDNA，例如通过在反应期间或之后收集珠粒。可采用收集载体连接的核酸的任何适宜的方法，包括但不限于例如磁性分离、基于密度/离心/重力的分离、基于过滤的分离、基于分子结合的分离、基于荧光的分离(即基于固体载体的荧光)等。

例如模板转换寡核苷酸和/或单一产物核酸引物的核酸可直接在固体载体上合成，或可以化学方式连接或“捕集”。举例来说，在一些情况下，主题方法的一种或多种核酸例如模板转换寡核苷酸和/或单一产物核酸引物可包括经笼蔽捕集部分(例如经笼蔽生物素、经笼蔽荧光素等)，其在被释放(uncaged)时使核酸结合于存在于固体载体上的相应结合配偶体(例如抗生物素抗体、亲和素、链霉亲和素、抗荧光素抗体等)。可进行扩增反应以使经笼蔽捕集部分并入经扩增的dsDNA产物中，从而允许通过在足以使被释放的捕集部分结合它的存在于固体载体上的结合配偶体的条件下将捕集部分释放来使经扩增的dsDNA产物连接于固体载体。适用于对核酸进行笼蔽捕集的方法和试剂包括但不限于例如美国专利号7,947,477中所述的那些；所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。

连接于模板转换寡核苷酸的经笼蔽捕集部分的一非限制性实例描绘于图11中。如所描绘，例如如图5中图式化的所产生的dsDNA(1100)进一步包括经笼蔽捕集部分(1101)。在从笼中放出之前(1102)，经笼蔽捕集部分不结合它的连接于固体载体的相应结合配偶体(1103)，所述固体载体在本实例中由珠粒(1104)表示。在从笼中放出之后(1105)，从笼中放出的捕集部分(1101)自由结合它的相应结合配偶体(1103)，因此有助于对所产生的dsDNA(1100)的捕集。

单一细胞、反应容器和小滴

反应混合物及其组分可向其中添加以及主题方法的反应可在其内发生的反应容器将变化。适用的反应容器包括但不限于例如管(例如单管、多管条等)、孔(例如多孔板(例如96孔板、384孔板或具有任何数目的孔(诸如2000、4000、6000或10000或更多)的板)的孔)。多孔板可为独立的，或可为芯片和/或装置的一部分。多孔板可为独立的，或可为芯片和/或装置的一部分。

在某些实施方案中，所用的反应容器可为多孔装置的一个孔或多个孔。本公开不受限于所用多孔装置(例如板或芯片)的类型。在一些情况下，所述装置具有多个孔，其含有或被确定尺寸以含有液体(例如被捕集在孔中，以致单独重力不能使得液体从孔流出的液体)。一个示例性芯片是由WAFERGEN^TM(WaferGen Bio-systems，Inc.)销售的5184孔SMARTCHIP^TM。其他示例性芯片提供于美国专利8,252,581；7,833,709；和7,547,556中，所述专利全都以引用的方式整体并入本文，包括例如关于芯片、孔、热循环条件和其中使用的相关试剂的教义。其他示例性芯片包括用于QUANTSTUDIO^TM实时PCR系统中的OPENARRAY^TM板(由Applied Biosystems销售)。另一示例性多孔装置是96孔板或384孔板。

在一些情况下，反应混合物及其组分可于例如如以下更详细所述的液体小滴(例如水-油乳液小滴)中添加至主题方法的反应中。尽管小滴可充当个别反应容器，但小滴(或含有小滴的乳液)将通常被安放在适合容器诸如像管或孔或微流控通道中。在小滴中进行的扩增反应可例如使用基于荧光的小滴分选器来基于荧光(例如来自核酸检测试剂或经标记探针)加以分选。适用的基于荧光的小滴分选器将变化，并且可包括例如流式细胞仪、基于微流控的小滴分选器等。在一些情况下，反应混合物及其组分可使用多样品纳升分配器来添加至主题方法的反应中。分配器可能够一次分配多个反应，并且可将多个体积分配至反应中(例如可分配35nL、50nL、75nL等)。

在一些情况下，可采用乳液PCR。对于乳液PCR，乳液PCR反应(例如在小滴、小滴微型反应器中)用“油包水”混合物创建以产生数千或数百万个微米尺寸化水性区室。核酸来源(例如细胞、核酸文库，任选偶联于固体载体例如珠粒)在乳化之前以有限稀释方式混合或直接混入乳液混合物中。区室尺寸和核酸来源的有限稀释的组合用于产生平均来说仅含有一个核酸来源(例如细胞或样品核酸，诸如细胞核酸-例如与固体载体组合的RNA或DNA，以使核酸可与固体载体(例如珠粒)等稳定缔合)的区室。视在乳化步骤期间产生的水性区室的尺寸而定，可在同一容器例如管、孔或其他适合容器中同时进行每μl多达3×10⁹个个别扩增反应。视乳化条件而定，乳液中区室的平均尺寸在直径是亚微米至超过100微米的范围内。

如上所指示，在包括汇合步骤的方案中，汇合步骤可在例如从单一细胞、从小滴等进行扩增以产生dsDNA产物之后或之前进行。因此，在本文所述的方法的某些实施方案中，从目标组织获得细胞，并且获得单细胞混悬液。将单一细胞放置在多孔板的一个孔或其他适合容器诸如微流控室或管中。使细胞溶解，并且例如在不进行额外纯化下将反应混合物直接添加至溶解产物中。在其他实施方案中，从目标组织获得细胞，并且获得单细胞混悬液。将单一细胞放置在多孔板的一个孔或其他适合容器中。使细胞溶解，并且例如在不进行额外纯化下将反应混合物直接添加至溶解产物中。经扩增的dsDNA样品可或可不加以汇合，并且在一些情况下，可接着测序以产生读段。这可允许鉴定在各单一细胞中表达的基因。

在一些情况下，方法可包括获得单一细胞的步骤。获得单一细胞可根据任何适宜方案来进行。单细胞混悬液可使用本领域中已知的标准方法来获得，包括例如以酶促方式使用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶来消化使组织样品中的细胞连接的蛋白质，或使所培养的粘附细胞释放，或以机械方式使样品中的细胞分开。可将单一细胞放置在单一细胞可在其中被个别处理的任何适合反应容器中。举例来说，96孔板、384孔板或具有任何数目的孔(诸如2000、4000、6000或10000或更多)的板。多孔板可为芯片和/或装置的一部分。本公开不受限于多孔板中孔的数目。在各个实施方案中，板上孔的总数是100至200,000或5000至10,000。在其他实施方案中，板包括较小芯片，其各自包括5,000至20,000个孔。举例来说，正方形芯片可包括125乘125个纳米孔，具有0.1mm的直径。

在本文所述的方法的某些实施方案中，获得小滴，并且将单一小滴分选至多孔板的一个孔或其他适合容器诸如微流控室或管中。可例如在不进行额外纯化下将反应混合物直接添加至小滴中。经扩增的dsDNA样品可或可不加以汇合，并且在一些情况下，可接着测序以产生读段。这可允许鉴定代表单一小滴内含有的基因或所表达核酸的核酸。

在一些情况下，方法可包括获得单一小滴的步骤。获得小滴细胞可根据任何适宜方案来进行，包括例如以机械方式分选小滴(例如利用基于荧光的分选器(例如流式细胞仪或基于微流控的分选器))。可将单一小滴放置在单一小滴可在其中被个别处理的任何适合反应容器中。举例来说，96孔板、384孔板或具有任何数目的孔(诸如2000、4000、6000或10000或更多)的板。多孔板可为芯片和/或装置的一部分。本公开不受限于多孔板中孔的数目。在个种实施方案中，板上孔的总数是100至200,000或5000至10,000。在其他实施方案中，板包括较小芯片，其各自包括5,000至20,000个孔。举例来说，正方形芯片可包括125乘125个纳米孔，具有0.1mm的直径。

多孔板中的孔(例如纳米孔)可以任何适宜尺寸、形状或体积加以制造。孔的长度可为100μm至1mm，宽度可为100μm至1mm，并且深度可为100μm至1mm。在个种实施方案中，各纳米孔具有1至4的纵横比(深度与宽度比率)。在一个实施方案中，各纳米孔具有纵横比2。横向截面区域可为环形、椭圆形、卵形、圆锥形、矩形、三角形、多面形，或呈任何其他形状。孔的在任何给定深度下的横向区域也可在尺寸和形状方面变化。

在某些实施方案中，孔具有0.1nl至1μl的体积。纳米孔可具有1μl或更小，诸如500nl或更小的体积。体积可为200nl或更小，诸如100nl或更小。在一实施方案中，纳米孔的体积是100nl。当需要时，可制造纳米孔以使表面积与体积比率增加，由此有助于穿过单元进行热传递，此可使热循环的匀变时间降低。各孔(例如纳米孔)的空腔可采用多种构型。举例来说，孔内的空腔可由直线壁或曲线壁划分以形成单独但邻近的区室，或由环形壁划分以形成内部和外部环状区室。

可对孔进行设计以使单一孔包括单一细胞或单一小滴。个单独细胞或小滴也可在任何其他适合容器例如微流控室、小滴、纳米孔、管等中分离。可采用用于操作单一细胞或小滴的任何适宜的方法，其中所述方法包括荧光激活的细胞分选(FACS)、机器人装置注射、重力流动、或显微操作以及使用半自动化细胞挑选器(例如来自Stoelting Co.的Quixell^TM细胞转移系统)等。在一些情况下，单一细胞或小滴可根据泊松统计(Poisson statistic)放置在板的各孔中(例如以使约10％、20％、30％或40％或更多的孔含有单一细胞或小滴-所述数值可通过调整给定单位体积的待分配至容器中的流体中细胞或小滴的数目来确定)。在一些情况下，适合的反应容器包含小滴(例如微滴)。个别细胞或小滴可例如基于可通过显微观察来检测的特征加以个别选择，所述特征诸如位置、形态、存在报告基因(例如表达)、存在结合抗体(例如抗体标记)、FISH特征、存在RNA(例如细胞内RNA标记)、或qPCR特征。

在例如如上所述获得单一细胞之后，可通过使细胞溶解来从细胞释放DNA或RNA(例如mRNA)。溶解可例如通过对细胞进行加热或冷冻-融化，或通过使用清洁剂或其他化学方法，或通过这些方式的组合来实现。然而，可使用任何适合的溶解方法。在一些情况下，温和的溶解程序可有利地用于防止释放核染色质，由此避免对cDNA文库的基因组污染，以及使mRNA的降解最小化。举例来说，在吐温-20(Tween-20)存在下在72℃下加热细胞2分钟足以使细胞溶解，同时不导致来自核染色质的可检测基因组污染。或者，可将细胞在水中加热至65℃持续10分钟(Esumi等，Neurosci Res 60(4)：439-51(2008))；或在补充有0.5％NP-40的PCR缓冲液II(Applied Biosystems)中加热至70℃持续90秒(Kurimoto等，NucleicAcids Res 34(5)：e42(2006))；或溶解可用蛋白酶诸如蛋白酶K或通过使用离液盐诸如异硫氰酸胍(美国公布号2007/0281313)来实现。在一些情况下，溶解程序可优先从单一细胞富集DNA，包括例如当利用RNA酶时。

在本文所述的方法中从模板核酸合成单一产物核酸可直接对细胞溶解产物进行，以致将用于逆转录的反应混合物直接添加至细胞溶解产物中。或者，可在核酸模板从细胞释放之后对它进行纯化。这可有助于降低在特定方案中可为非所需的核酸物质的污染，包括例如线粒体和核糖体核酸污染。所需核酸纯化(例如DNA纯化、mRNA纯化)可通过本领域中已知的任何方法，例如通过使所需核酸结合于固相来实现。通常使用的纯化方法包括顺磁性珠粒(例如Dyna珠粒)。或者，特定污染物诸如核糖体RNA可使用亲和纯化、使污染性核酸降解(例如使用RiboGone^TM(Takara Bio USA Inc.，Mountain View，CA)以及美国专利号9,428,794和美国专利申请公布号US 2015/0225773 A1中所述的那些方法；所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文)、其组合等来选择性移除。

当需要时，给定单一细胞或小滴工作流程可包括汇合步骤，其中使例如由合成单一产物核酸或合成dsDNA组成的核酸产物组合物与从一个或多个额外细胞或小滴获得的核酸产物组合物组合或汇合。在所述实施方案中加以组合或汇合的从不同细胞或小滴产生的不同核酸产物组合物的数目可变化，其中在一些情况下数目在2至50，诸如3至25，包括4至20的范围内，或是10,000或更多。

文库

在某些实施方案中，主题方法可用于产生目标经扩增的核酸的文库(例如经扩增的dsDNA文库、经扩增的cDNA文库等)。所述文库可适用于多种不同应用中。

在一些情况下，主题方法可用于产生经扩增的核酸的文库，其用于在目标测序平台(例如由Ion Torrent^TM、Pacific Biosciences、Life Technologies^TM、Roche等提供的测序平台)上进行下游测序。举例来说，可执行所述方法以扩增目标核酸样品中的多个不同核酸，以便产生对应于所述多个不同核酸中的至少一部分的产物dsDNA。可接着根据任何适宜策略来使测序平台衔接物构建体连接于这些经扩增的产物dsDNA或其衍生物的末端。在连接衔接物构建体之后，可直接输入这些核酸物质以在目标测序平台上进行测序，或经扩增的核酸可在测序之前加以进一步处理。

根据某些实施方案，主题方法用于产生对应于多腺苷酸化或非多腺苷酸化RNA的经扩增的cDNA文库以在基于的测序系统上进行下游测序。在一个实施方案中，微小RNA，包括例如已被人工达成多腺苷酸化的微小RNA，作为模板用于如本文所述的模板转换聚合和扩增反应中。经扩增的产物核酸可用于衔接物构建体连接和后续测序。在所述实施方案中，文库中具有不同序列的不同核酸的数目可变化，并且在一些情况下，可在2至100,000(例如30,000至100,000)，诸如50至25,000、100至10,000、或150至5,000，例如200至1000的范围内。

在一些情况下，经扩增的核酸从由单一细胞获得的多个模板核酸产生以产生单一细胞经扩增的核酸文库。所述单一细胞文库可接着用于其他下游应用诸如测序应用中。如本文所用，“单一细胞”是指一个细胞。适用作模板RNA的来源和/或适用于产生单一细胞经扩增的核酸文库的单一细胞可从目标组织，或从活检体、血液样品或细胞培养物获得。另外，可获得来自特定器官、组织、肿瘤、赘瘤等的细胞，并且用于本文所述的方法中。此外，来自任何群体的细胞都可用于主题方法中，诸如包括细菌或酵母的原核或真核单细胞生物体的群体。

根据本文所述的方法产生的经扩增的dsDNA产物的所产生的文库(无论是单细胞文库还是多细胞文库)可以多种方式加以进一步利用。举例来说，在一些情况下，可将主题文库的个别组分例如克隆至一个或多个载体中以产生载体文库，包括例如表达载体文库、测序文库等。在一些情况下，文库整体或其实质性部分可直接用于测序方案包括例如下一代测序(NGS)方案中。

在某些方面，本公开的方法进一步包括使NGS文库经受NGS方案。方案可在任何适合NGS测序平台上进行。目标NGS测序平台包括但不限于由(例如HiSeq^TM、MiSeq^TM和/或NextSeq^TM测序系统)；Ion Torrent^TM(例如Ion PGM^TM和/或Ion Proton^TM测序系统)；Pacific Biosciences(例如PACBIO RS II Sequel测序系统)；Life Technologies^TM(例如SOLiD测序系统)；Roche(例如454GS FLX+和/或GS Junior测序系统)提供的测序平台；或任何其他目标测序平台。NGS方案将视所用特定NGS测序系统而变化。可从所用NGS测序系统的制造商获得用于对NGS文库测序的详细方案，例如其可包括进一步扩增(例如固相扩增)，对扩增子测序，以及分析测序数据。

组合物

本发明的各个方面也包括例如如上所述的组合物。主题组合物可包括例如一种或多种以上关于主题方法所述的任何反应混合物组分。举例来说，组合物可包括以下中的一者或多者：模板核酸(例如模板RNA、模板DNA等)、扩增聚合酶(例如热稳定聚合酶等)、逆转录酶(例如能够进行模板转换的逆转录酶等)、模板转换寡核苷酸、dNTP、盐、金属辅因子、一种或多种核酸酶抑制剂(例如RNA酶抑制剂)、一种或多种酶稳定性组分(例如DTT)、或任何其他所需反应混合物组分，其中核酸试剂例如引物、模板转换寡核苷酸等可包括一个或多个不直接用于RT和扩增反应中的上述核酸结构域，包括但不限于例如非模板化结构域(例如引物结合结构域、条型码结构域、限制酶识别位点结构域、BUMI结构域等)。

主题组合物可存在于任何适合环境中。根据一个实施方案，组合物存在于反应管(例如0.2mL管、0.6mL管、1.5mL管等)或孔或微流控室或小滴或其他适合的容器中。在某些方面，组合物存在于两个或更多个(例如多个)反应管或孔(例如板，诸如96孔板、例如含有约1000、5000或10,000个或更多个孔的多孔板)中。管和/或板可由任何适合的材料例如聚丙烯或类似物、PDMS或铝制得。容器也可被处理以使核酸向容器壁的吸附降低。在某些方面，组合物存在于其中的管和/或板对组合物提供高效热传递(例如当放置在加热块、水浴、热循环仪和/或类似物中时)，以致组合物的温度可在短暂时期内改变，例如如为发生特定酶促反应所必需。根据某些实施方案，组合物存在于薄壁聚丙烯管或具有薄壁聚丙烯孔的板或具有高热导性的材料诸如铝中。在一些情况下，本公开组合物可存在于小滴中。在某些实施方案中，可为适宜的是使反应在固体表面或珠粒上发生，在所述情况下，可通过本领域中已知的方法-诸如生物素连接或通过共价连接-来使单一产物核酸引物和/或模板转换寡核苷酸或一种或多种其他引物连接于固体载体或珠粒，并且使反应在载体上进行。或者，可直接在固体载体上合成寡聚物-例如如Macosko，EZ等，Cell 161，1202-1214，2015年5月21日中所述。

适于主题组合物的其他环境包括例如微流控芯片(例如“芯片实验室装置”，例如包含通道和进口的微流控装置)。组合物可存在于被配置来使组合物达到所需温度的仪器中，例如温度控制的水浴、加热块、加热块接头等。被配置来使组合物达到所需温度的仪器可被配置来使组合物达到一系列不同所需温度，各自持续适合时期(例如仪器可为热循环仪)。

试剂盒

本公开的各个方面也包括试剂盒。试剂盒可包括例如一种或多种以上关于主题方法所述的任何反应混合物组分。举例来说，试剂盒可包括模板核酸、扩增聚合酶(例如热稳定聚合酶等)、逆转录酶(例如能够进行模板转换的逆转录酶等)、模板转换寡核苷酸、单一产物核酸引物、dNTP、盐、金属辅因子、一种或多种核酸酶抑制剂(例如RNA酶抑制剂和/或DNA酶抑制剂)、一种或多种分子拥挤剂(例如聚乙二醇等)、一种或多种酶稳定性组分(例如DTT)或任何其他所需试剂盒组分。

在一些情况下，主题试剂盒的组分可呈现为“混合物”，其中如本文所用，混合物是指单一容器中两种或更多种不同但类似的组分的集合或组合。主题试剂盒中的适用的混合物包括但不限于例如“引物混合物”，其中所述混合物的组成可变化，并且可包括例如两种或更多种引物的混合物，所述引物包括例如单一产物核酸引物(例如CDS引物)和模板转换寡核苷酸。主题试剂盒中的适用的混合物也可包括但不限于例如“聚合酶混合物”，其中所述混合物的组成可变化，并且可包括例如两种或更多种聚合酶的混合物，所述聚合酶包括例如扩增聚合酶和逆转录酶。

在某些实施方案中，试剂盒包括用于从目标核酸来源分离DNA或RNA的试剂。试剂可适于从多种DNA或RNA来源分离核酸样品，所述来源包括单一细胞、所培养细胞、组织、器官或生物体。主题试剂盒可包括用于从固定细胞、组织或器官例如经福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织分离核酸样品的试剂。所述试剂盒可包括一种或多种脱石蜡剂、一种或多种适于使核酸解交联的试剂和/或类似物。

试剂盒的组分可存在于单独容器中，或多个组分可存在于单一容器中。举例来说，模板转换寡核苷酸和单一产物核酸引物可被提供在同一管中，或可被提供在不同管中。在一些情况下，逆转录酶和扩增聚合酶可被提供在同一管中，或可被提供在不同管中。在一些情况下，模板转换寡核苷酸和单一产物核酸引物和扩增聚合酶中的一者或多者可被提供在同一管中，或可被提供在不同管中。在一些情况下，逆转录酶、扩增聚合酶、单一产物核酸引物和模板转换寡核苷酸可被提供在同一管中，或可被提供在单独管中，或其组合可被组合至同一管中。在一些情况下，三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)可与逆转录酶、扩增聚合酶、单一产物核酸引物或模板转换寡核苷酸一起被包括在同一管中，或被包括在含有逆转录酶、扩增聚合酶、单一产物核酸引物和/或模板转换寡核苷酸的某一组合的管中。

除以上提及的组分之外，主题试剂盒可进一步包括使用试剂盒的组分例如来实施如上所述的主题方法的说明书。此外，例如当试剂盒的引物和/或寡核苷酸包括BUMI结构域时，所述试剂盒可进一步包括用于分析结果的程序编制，例如解码经编码BUMI结构域，对独特分子种类进行计数等。说明书和/或分析程序编制通常被记录在适合的记录介质上。说明书和/或程序编制可被印刷在基材诸如纸张或塑料等上。因此，说明书可以包装插页形式存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组成部分(即与包装或子包装相伴的组成部分)的容器的标签中，等。在其他实施方案中，说明书以存在于适合计算机可读储存介质上的电子储存数据文件形式存在，所述介质例如CD-ROM、磁盘、硬盘驱动器(HDD)等。在其他实施方案中，实际说明书不存在于试剂盒中，但提供用于从远程源头获得说明书的手段，例如通过因特网。这个实施方案的一实例是包括可察看说明书所处的和/或可从其下载说明书的网址的试剂盒。如同说明书一样，用于获得说明书的这个手段被记录在适合的基材上。

效用

主题方法适用于多种应用中，包括需要从含有模板核酸的起始样品扩增dsDNA产物的那些应用。本发明方法进一步适用于其中需要最少使用者输入和“亲自动手时间”来获得经扩增的dsDNA产物的那些方法中。本发明方法的缩短方案(即如上所述的仅需要一个或两个步骤的那些方案，限制使用者与反应交互，由此使污染潜力降低)。

当需要反应效率和/或特异性时主题方法可进一步加以采用。在一些实施方案中，本文所述的扩增反应仅利用单一一组来自通过扩增进行的单一产物核酸合成的引物，即模板转换寡核苷酸和单一产物核酸引物。因此，主题反应使引物竞争降低，并且在一些情况下，可使反应效率和/或特异性增加。

主题方法的应用包括医学和研究应用，其中需要检测特定核酸实体，例如病原体RNA(例如病毒RNA、细菌RNA、真菌RNA、寄生物RNA等)、病原体DNA(例如病毒DNA、细菌DNA、真菌DNA、寄生物DNA等)、微小RNA、mRNA、疾病相关DNA或基因组突变、疾病相关RNA和/或突变转录物。主题方法的应用也包括医学和研究应用，其中将考查整个核酸群体，包括例如其中考查核酸多样性，其中考查核酸表达水平，其中考查核酸拷贝数等。主题方法也适用于包括克隆、表达研究等的生物技术应用中。

所述应用存在于基础研究和诊断(例如临床诊断)的领域中，并且包括但不限于产生准备用于测序的目标核酸文库、抑制PCR、克隆、检测、文库扩增、阵列杂交、全基因组扩增和/或类似应用。准备用于测序的文库包括使得能够使用任何适宜测序平台来对文库成员进行测序的衔接物序列，所述测序平台包括：来自的HiSeq^TM、MiSeq^TM和GenomeAnalyzer^TM测序系统；来自Ion Torrent^TM的Ion pGM^TM和Ion Proton^TM测序系统；来自Pacific Biosciences的PACBIO RS II或Sequel测序系统、来自Life Technologies^TM的SOLiD测序系统、来自Roche的454GS FLX+和GS Junior测序系统、或任何其他适宜测序平台。本公开的方法适用于产生准备用于测序的文库，其对应于任何目标DNA或RNA起始物质，例如基因组DNA、mRNA、非多腺苷酸化RNA(例如微小RNA)。举例来说，主题方法可用于从非多腺苷酸化RNA产生准备用于测序的cDNA文库，所述非多腺苷酸化RNA包括微小RNA、小RNA、siRNA和/或任何其他类型的目标非多腺苷酸化RNA。

以下实施例通过说明的方式而非通过限制的方式来提供。

实施例

实施例1：伴有模板转换和扩增的一步RT-PCR

当前RT-PCR测定使用三步方案。第一步骤是移除二级结构以及使逆转录寡聚物与模板退火的热变性步骤。在第二步骤中，添加用于逆转录(RT)反应的试剂，所述步骤产生第一链互补DNA(cDNA)(即“第一链cDNA合成”)。在第三步骤中，添加用于PCR扩增的试剂，所述步骤产生双链cDNA和经扩增的拷贝。

本实施例描述相较于例如以上所述的三步得以缩短的RT-PCR方案，所述三步利用模板转换以及最终产生经扩增的双链cDNA产物。利用模板转换进行的典型三步RT-PCR方案的热循环步骤和反应组分以下提供在表1中以供参照：

表1：

所述缩短方案利用RT寡核苷酸和模板转换寡核苷酸(TSO)作为PCR扩增的引物，从而消除对扩增引物的需要。因此，开发了两步模板转换RT-PCR方案，其热循环步骤大体上如下所述：

1.在72℃下预先加热3分钟

2.RT-PCR：42℃持续90分钟，95℃持续1分钟，17-18个循环的(98℃持续10秒，65℃持续15秒，68℃持续3分钟)。

也开发了单一步骤模板转换RT-PCR方案，其热循环步骤大体上如下所述：

1. 42℃持续90分钟，95℃持续1分钟，17-18个循环的(98℃持续10秒，65℃持续15秒，68℃持续3分钟)。

在本实施例中，利用热启动DNA扩增聚合酶，其在逆转录(RT)期间在42℃下是非活性的。因此，如上加热至95℃持续1分钟使用于扩增的DNA聚合酶活化(例如通过移除存在于聚合酶上的失活性抗体)。在第一链合成之后，将反应加热至95℃也用于使逆转录酶失活。

除初始添加至反应混合物中的那些组分以外，缩短方案不需要将额外引物、缓冲液或聚合酶添加至反应混合物中(即在反应期间(例如在开始反应与产生最终产物前之间)不需要添加额外组分)。用于本实施例中的DNA扩增聚合酶也是热稳定聚合酶。以下缩短方案(“两步方案”(表2)和“一步方案”(表3))和相关反应组分用于从测试模板mRNA扩增双链cDNA，并且与使用以上提供的3步方案实现的对相同模板mRNA的扩增进行比较。

表2：两步方案：

表3：一步方案：

提供三步(图12)、两步(图13)和一步(图14)方案的经扩增的双链cDNA产物的在35至10380个碱基对(bp)范围的以相对频率单位(FU)表示的序列长度分布。这些结果显示缩短方案相较于更常规的三步方案，在产生经扩增的双链cDNA方面不显示任何缺陷。

使由各相应方案(三步、两步和一步)获得的经扩增的双链cDNA产物进一步经受根据常规方法通过生物分析仪、CLC Bio生物信息学和Star比对器(aligner)进行的分析。这些分析的结果以下呈现在表4中。

表4：结果：

生物分析仪分析显示由缩短方案产生的经扩增的双链cDNA产物具有与使用较长3步方案产生的产物cDNA的大小、浓度和产量特征类似的大小、浓度和产量特征。此外，测序和比对分析显示在缩短方案中产生的经扩增的产物cDNA至少与在较长方案中产生的产物同样良好表现。

实施例2：使模板转换发生在珠粒上

在例如如在小滴或微孔中进行的某些逆转录方法中，使用者可利用固体载体，如单一固体载体或多个载体，例如珠粒，来促进RNA样品的捕集和条型码化。常常，所使用的珠粒具有一般与mRNA或与目标特定RNA杂交的经连接寡dT或基因特异性引物。所述程序可被配置成发生逆转录，使得模板转换发生在未结合于即未连接于固体载体例如珠粒的单独模板转换寡核苷酸上。

此处提出其中模板转换发生在珠粒上的方案，其使用连接于所述珠粒的模板转换寡核苷酸来进行。举例来说，如图15中所示出的，使具有引物结合位点和珠粒条型码的模板转换寡核苷酸连接于珠粒。模板转换寡核苷酸包括位于与珠粒连接的末端相对的末端的三核苷酸(GGG)。本实施例描述了使用聚dT引物从含有聚A的mRNA进行逆转录，在完成逆转录后，所用RT的末端转移酶活性优先添加与位于模板转换寡核苷酸的游离末端的三核苷酸互补的非模板化核苷酸(在这个实施例中是“CCC”，如图15中所示)。在非模板化核苷酸与模板转换寡核苷酸的三核苷酸末端杂交之后，发生模板转换，从而导致将珠粒条型码和引物结合位点序列添加至逆转录链中。

由于继续与珠粒结合的模板转换寡核苷酸杂交，所以逆转录链然后与珠粒缔合。此时，珠粒可以或不可以用来例如通过分离和/或分选珠粒来捕集逆转录链。例如使用如上讨论的长方案或缩短方案进行的扩增可用于产生经扩增的最终产物双链cDNA，其含有珠粒结合的模板转换寡核苷酸的珠粒条型码和引物结合位点序列。

实施例3：当存在TSO和CDS引物时，添加PCR引物不为在第一链cDNA合成之后的扩 增所需

这个实施例证明TSO和CDS寡聚物可充当PCR扩增引物。对于这个实验，如下使用用于测序的SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒(Takara Bio USA，Inc.)。

第一链cDNA合成：

1.通过使19μl 10X溶解缓冲液和1μl RNA酶抑制剂混合来制备10X反应缓冲液。

2.在0.2ml PCR管中混合1μl 10X反应缓冲液、1μl 3’SMART-Seq CDS引物IIA、2μl5pg/ul小鼠脑RNA(MBR)和8.5μl无核酸酶的水。

3.将管在72℃下孵育3分钟，接着在冰上放置2分钟。

4.将4μl 5X超低第一链缓冲液、1μl SMART-Seq v4寡核苷酸、0.5μl RNA酶抑制剂(40U/μtl)和2μl SMARTScribe逆转录酶添加至管中(总体积：20μl)。

5.将管放置在热循环仪中，并且运行以下程序：

a.42℃ 90分钟

b.70℃ 10分钟

c.4℃ 永久

当采用时，如下进行对第一链cDNA的任选纯化：

1.将20μl AMPure XP珠粒添加至2个管中。

2.通过涡旋来将管混合，并且在室温下孵育8分钟。

3.将管放置在磁性分离装置上持续数分钟，接着丢弃上清液。

4.将200μl 80％乙醇添加至在磁性分离装置上的管中，接着小心吸移并丢弃。

5.将步骤4重复一次。

6.一旦珠粒干燥，就将cDNA洗脱至20μl洗脱缓冲液中。

当采用时，如下进行任选cDNA扩增：

1.将25μl 2X SeqAmp PCR缓冲液、1μl PCR引物IIA、1μl SeqAmp DNA聚合酶和3μl无核酸酶水添加至第一链cDNA中(总体积：50μl)。

2.将管放置在热循环仪中，并且运行以下程序：

a.95℃ 1分钟

b.98℃ 10秒

c.65℃ 30秒

d.68℃ 3分钟

17个循环的b.-d.

e.72℃ 10分钟

f.4℃ 永久

经扩增的cDNA的纯化：

1.将50μl AMPure XP珠粒添加至管中。

2.通过涡旋来将管混合，并且在室温下孵育8分钟。

3.将管放置在磁性分离装置上持续数分钟，接着丢弃上清液。

4.将200μl 80％乙醇添加至在磁性分离装置上的管中，接着小心吸移并丢弃。

5.将步骤4重复一次。

6.一旦珠粒干燥，就将cDNA洗脱至17μl洗脱缓冲液中。

如图16中所示，例如相较于阳性对照(图16，左侧，“+引物IIA”)，在不添加PCR引物(引物IIA)下以及在不纯化第一链cDNA合成反应(即RT反应)下，仍然检测到具有适当大小的产物，如以生物分析仪迹线所示(图16，左侧，“-引物IIA”)。相比之下，当纯化第一链cDNA合成反应，从而移除TSO和CDS寡聚物时，不产生产物(图16，右侧，“-引物IIA”)，除非也添加PCR引物(图16，右侧，“+引物IIA”)。这些代表性迹线显示即使当PCR引物不被包括在反应中时，扩增也可在TSO和CDS寡聚物存在下进行。然而，当将TSO和CDS寡聚物纯化出反应时，添加IIA扩增引物为产生扩增产物所必需。

下表5提供对这些结果的定量。如表5的最右列中所示，当不添加PCR引物IIA时，在纯化，从而移除TSO和CDS寡聚物之后，不形成cDNA产物。然而，当在RT之后不进行纯化，从而将TSO和CDS寡聚物保留在反应混合物中时，在存在(+)以及不存在(-)PCR引物IIA下产生的扩增产物是高度类似的。

表5：

这个实施例证明当TSO和CDS引物存在于反应混合物中时，PCR引物不为在第一链cDNA合成之后的扩增所需。提供的结果也显示在不存在PCR引物下产生的扩增产物类似于当添加PCR引物时产生的扩增产物。

实施例4：在采用多步RT-PCR程序的工作流程和采用单步RT-PCR程序的工作流程 之间进行的比较

图17提供用于对文库制备进行测序的SMART-Seq v4试剂盒工作流程和SMART-SeqHT试剂盒工作流程的示意性比较。SMART-Seq v4方法(左侧)被修改来产生伴有最少亲自动手时间的简化高通量工作流程(SMART-Seq HT，右侧)。SMART-Seq HT工作流程中亲自动手时间的大量降低是包括了一步RT-PCR程序的结果，如可在图17中所见。

此处提供的实施例显示本公开的不同RTPCR方法之间的比较。对于这个实施例，使用用于测序的SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒(Takara Bio USA，Inc.)。

3步程序

预先加热：

1.通过使19μl 10X溶解缓冲液和1μl RNA酶抑制剂混合来制备10X反应缓冲液。

2.在0.2ml PCR管中混合1μl 10X反应缓冲液、1μl 3’SMART-Seq CDS引物IIA、2μl5pg/ul小鼠脑RNA(MBR)和8.5μl无核酸酶的水。

3.将管在72℃下孵育3分钟，接着在冰上放置2分钟。

第一链cDNA合成：

1.将4μl 5X超低第一链缓冲液、1μl SMART-Seq v4寡核苷酸、0.5μl RNA酶抑制剂(40U/μl)和2μl SMARTScribe逆转录酶添加至预先加热管中(总体积：20μl)。

2.将管放置在热循环仪中，并且运行以下程序：

a.42℃ 90分钟

b.70℃ 10分钟

c.4℃ 永久

cDNA扩增：

1.将25μl 2X SeqAmp PCR缓冲液、1μl PCR引物IIA、1μl SeqAmp DNA聚合酶和3μl无核酸酶水添加至第一链cDNA中(总体积：50μl)。

2.将管放置在热循环仪中，并且运行以下程序：

a.95℃ 1分钟

b.98℃ 10秒

c.65℃ 30秒

d.68℃ 3分钟

17个循环的b.-d.

e.72℃ 10分钟

f.4℃ 永久

2步程序

预先加热：

1.通过使19μl 10X溶解缓冲液和1μl RNA酶抑制剂混合来制备10X反应缓冲液。

2.在0.2ml PCR管中混合1μl 10X反应缓冲液、1μl 3’SMART-Seq CDS引物IIA、2μl5pg/ul小鼠脑RNA(MBR)和8.5μl无核酸酶的水。

3.将管在72℃下孵育3分钟，接着在冰上放置2分钟。

第一链cDNA合成反应(以及程序中应用的扩增)：

1.将4μl 5X超低第一链缓冲液、1μl SMART-Seq v4寡核苷酸、0.5μl RNA酶抑制剂(40U/μl)、2μl SMARTScribe逆转录酶、4μl 2XSeqAmp PCR缓冲液和1μl SeqAmp DNA聚合酶添加至管中(总体积：25μl)。

a.42℃ 90分钟

b.95℃ 1分钟

c.98℃ 10秒

d.65℃ 30秒

e.68℃ 3分钟

17个循环的c.-e.

f.72℃ 10分钟

g.4℃ 永久

1步程序

伴有或不伴有预先加热步骤的第一链cDNA合成(以及程序中应用的扩增)：

1.通过使19μl 10X溶解缓冲液和1μl RNA酶抑制剂混合来制备10X反应缓冲液。

2.在0.2ml PCR管中混合1μl 10X反应缓冲液、1μl 3’SMART-Seq CDS引物IIA、2μl5pg/ul小鼠脑RNA(MBR)和8.5μl无核酸酶的水。

3.将4μl 5X超低第一链缓冲液、1μl SMART-Seq v4寡核苷酸、0.5μl RNA酶抑制剂(40U/μl)、2μl SMARTScribe逆转录酶、4μl 2X SeqAmp PCR缓冲液和1μl SeqAmp DNA聚合酶添加至管中(总体积：25μl)。

a.50℃、60℃或70℃ 1分钟，或不预先加热

b.42℃ 90分钟

c.95℃ 1分钟

d.98℃ 10秒

e.65℃ 30秒

f.68℃ 3分钟

17个循环的d.-f.

g.72℃ 10分钟

h.4℃ 永久

经扩增的cDNA的纯化：

1.将50μl(3步)或25μl(2步和1步)AMPure XP珠粒添加至管中。

2.通过涡旋来将管混合，并且在室温下孵育8分钟。

3.将管放置在磁性分离装置上持续数分钟，接着丢弃上清液。

4.将200μl 80％乙醇添加至在磁性分离装置上的管中，接着小心吸移并丢弃。

5.将步骤4重复一次。

6.一旦珠粒干燥，就将cDNA洗脱至17μl洗脱缓冲液中。

如表6中所示，3步、2步、不伴有预先加热处理的1步和伴有在50℃下预先加热处理的1步RTPCR全都显示类似数目的经鉴定转录物、最少rRNA、高皮尔逊关联和高定位百分比。伴有在60℃和70℃下预先加热处理以及伴有在60℃下预先加热处理与在冰上冷激的1步RTPCR方案在这个实施例中全都不产生结果。在50℃下与在冰上冷激下进行的1步方案产生产物(如所示)，但这个产物未经测序(“NS”)。这些结果显示3步、2步和1步(不伴有预先加热或伴有在50℃下预先加热)程序全都产生类似产物核酸。

表6：

进一步分析使用3步、2步和1步程序产生的产物核酸的基因主体覆盖度和生物分析仪样品特征。这个进一步分析的结果提供在图18中。如可在图18(顶部)中所见，在所有方法之间，基因主体覆盖度(显示3步、2步、1步不加热和1步50℃)都是类似的，此指示在各方法之间具有类似最小偏倚。生物分析仪迹线(图18，底部)显示在这个实施例中，除在60℃下的1步RTPCR之外的所有方法都产生适当大小的文库。

进行进一步分析以比较SMART-Seq v4试剂盒与SMART-Seq HT试剂盒之间的灵敏性和可定位性。具体来说，使用SMART-Seq v4试剂盒或SMART-Seq HT试剂盒来从10pg小鼠脑总RNA产生重复cDNA文库。使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒来从输出cDNA产生RNA-seq文库，并且在Illumina NextSeq仪器(2x 75bp)上测序。在相对于1300万个双端读段使所有样品标准化之后分析序列。如图19中所示，两种试剂盒产生类似测序量度，除强烈皮尔逊和斯皮尔曼(Spearman)关联之外，也具有高定位率和类似数目的经鉴定转录物。这些数据指示SMART-Seq HT试剂盒与SMART-Seq v4试剂盒提供相同灵敏性和可重现性。

进行进一步分析以对于用SMART-Seq v4试剂盒和SMART-Seq HT试剂盒产生的数据，比较经鉴定转录物的数目。具体来说，进一步评估在各试剂盒内的技术性重复测定之间，从10pg小鼠脑总RNA制备的文库(如上)在经鉴定转录物(每100万个经定位读段中对应于转录物的每1千个碱基的片段数FPKM＞0.1)的数目方面的重叠。如图20中所示，发现这些结果极其类似(61-63％重叠)。接着将通过各试剂盒的全部三个重复测定来鉴定的转录物相对于彼此进行比较，指示有71％的重叠(参见图20)。重叠转录物具有37FPKM的平均表达水平，而用个别试剂盒独特鉴定的转录物具有较小丰度，平均在6-7FPKM之间，从而指示更可能不被鉴定的转录物是在低水平下表达的那些。这个分析显示对于用SMART-Seq v4试剂盒和SMART-Seq HT试剂盒产生的数据，在经鉴定转录物的数目方面具有高度关联。

进行进一步分析以评估SMART-Seq v4试剂盒和SMART-Seq HT试剂盒的基因GC含量表示。具体来说，进一步分析由10pg小鼠脑总RNA制得的文库(如上)的GC含量表示。将基因根据GC含量来分仓(bin)，并且在图21中报道各仓中的经鉴定基因的数目(所示数目是三个技术性重复测定的平均值)。如可在所提供数据的情况下所见，对于两种试剂盒，各仓中的经鉴定基因的百分比是相同的。对于参照，存在35,495个经注释RefSeq基因，其中4.7％被任意分类为低CG含量(≤36％)，89.9％被分类为中等CG含量(37-54％)，并且5.4％被分类为高GC含量(≥55％)。这个分析显示相较于3步方法，在步骤减少方法中不存在GC含量表示偏倚。

进行进一步分析以根据基因GC含量来在SMART-Seq v4试剂盒与SMART-Seq HT试剂盒之间比较表达水平。进一步分析所示由10pg小鼠脑总RNA制得的文库(如上)的GC含量表示(参见图21)。将基因根据GC含量来分仓，并且关联图用于显现各仓中基因的表达水平(FPKM)的可重现性(图22)。对于使用SMART-Seq v4试剂盒(图A)或SMART-Seq HT试剂盒(图B)分析的重复样品，平均基因计数是极其可重现的。在SMART-Seq v4试剂盒和SMART-SeqHT试剂盒的情况下，具有高GC含量或低GC含量的基因显示类似表达水平(图C)。因此，这个分析显示引入新SMART-seq HT试剂盒中的一步RT-PCR反应维持对低GC含量基因和高GC含量基因的表示。

进行进一步分析以比较使用SMART-Seq v4试剂盒或SMART-Seq HT试剂盒从293T细胞达成的测序文库产生。具体来说，使用SMART-Seq v4试剂盒或SMART-Seq HT试剂盒来从通过FACS分离的个别293T细胞产生文库。

对于FACS分选，通过胰蛋白酶处理来收集生长至接近汇合的293T细胞，用FITC小鼠抗人CD47抗体(克隆B6H12；BD，目录号556045)染色，并且再混悬于冰冷BD FACS分选前缓冲液(BD，目录号563503)中。用BD细胞分选器在12.5μl FACS分配溶液中进行分选。将细胞冷冻在-80℃下直至准备用于处理。合成cDNA，并且制备测序文库并测序。使用CLC基因组学工作台，将来自所有文库的读段都进行调整并定位于哺乳动物rRNA以及人或小鼠线粒体基因组。其余读段随后使用CLC来定位于具有RefSeq注释的人(hg19)或小鼠(mm10)基因组。与这些分析相关的所有所示百分比(包括定位于内含子、外显子或基因间区域的读段的数目)都是文库中总读段的百分比。在各文库中鉴定的转录物的数目通过FPKM大于或等于1或0.1的转录物的数目来确定。

使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒来产生RNA-seq文库，并且在IlluminaNextSeq仪器(2x 75bp)上测序。在相对于700万个双端读段使所有样品标准化之后分析序列。如可在图23中提供的结果中所见，两种试剂盒产生类似测序量度，具有高定位率，并且在SMART-Seq HT试剂盒的情况下鉴定了约600个额外转录物。这些数据指示相较于SMART-Seq v4试剂盒，SMART-Seq HT试剂盒提供相同或略微更高灵敏性。

进行进一步分析以比较使用SMART-seq v4试剂盒和SMART-Seq HT试剂盒来从FACS分选293T细胞获得的基因表达数据的可重现性。具体来说，进一步分析从21个个别293T细胞产生的文库(参见图23)以评估用SMART-Seq v4试剂盒(SSv4_1至SSv4_12)和SMART-Seq HT试剂盒(HT_1至HT_9)对各细胞获得的基因表达测量结果的可重现性。图24提供显示所有细胞之间的欧几里得距离(Euclidean distance)的分级聚类热图，并且报告在0.74至0.97的范围内的皮尔逊关联。这些数据显示在两种试剂盒之间的关联是极高的，并且基于文库制备方法，细胞不聚类。这些数据进一步显示SMART-Seq HT试剂盒中的经修改工作流程在测量基因表达水平方面不引入重大偏倚。总之，这个分析显示使用SMART-seqv4试剂盒和SMART-Seq HT试剂盒来从FACS分选293T细胞获得的基因表达数据具有高度可重现性。

尽管具有随附权利要求书，但本公开也由以下条款限定：

1.一种从核酸样品产生经扩增的双链脱氧核糖核酸(dsDNA)的方法，所述方法包括：

(a)将以下各物：

核酸样品；

逆转录酶；

单一产物核酸引物；

包含3′杂交结构域的模板转换寡核苷酸；

扩增聚合酶；和

三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)；

在足以产生双链核酸复合物的条件下组合在反应混合物中，所述双链核酸复合物包含模板核酸和与单一产物核酸的邻近区域杂交的所述模板转换寡核苷酸；以及

(b)使用所述模板转换寡核苷酸和所述单一产物核酸引物在足以产生经扩增的dsDNA的条件下从所述单一产物核酸进行扩增。

2.根据条款1所述的方法，其中所述3′杂交结构域与由所述逆转录酶添加至所述单一产物核酸中的非模板化序列杂交。

3.根据条款2所述的方法，其中所述非模板化序列包含异多核苷酸。

4.根据条款3所述的方法，其中所述异多核苷酸包括异三核苷酸。

5.根据条款2所述的方法，其中所述非模板化序列包含同多核苷酸。

6.根据条款5所述的方法，其中所述同多核苷酸包括同三核苷酸。

7.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述逆转录酶是逆转录病毒逆转录酶。

8.根据条款7所述的方法，其中所述逆转录病毒逆转录酶是鼠白血病病毒逆转录酶。

9.根据前述条款中的任一者所述的方法，其中所述扩增聚合酶是热启动聚合酶。

10.根据前述条款中的任一者所述的方法，其中所述扩增聚合酶是热稳定聚合酶。

11.根据前述条款中的任一者所述的方法，其中所述单一产物核酸引物包含‘5-非模板化序列。

12.根据条款11所述的方法，其中所述5’-非模板化序列的长度是10nt至100nt。

13.根据条款11或12所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含限制核酸内切酶识别位点。

14.根据条款11-13中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含引物结合位点。

15.根据条款11-14中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含确定序列。

16.根据条款11-15中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含来源条型码序列。

17.根据条款16所述的方法，其中所述来源条型码序列包括样品条型码序列。

18.根据条款16或17所述的方法，其中所述来源条型码序列包括孔条型码序列。

19.根据条款16-18中的任一条所述的方法，其中所述来源条型码序列包括细胞条型码序列。

20.根据条款11-19中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含独特分子标识符序列(UMI)。

21.根据条款11-20中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含独特分子标识符(UMI)结构域。

22.根据条款11-21中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含条型码化独特分子标识符(BUMI)结构域。

23.根据条款11-21中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含测序平台衔接物构建体。

24.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述单一产物核酸引物包含在所述扩增期间整合至所述经扩增的dsDNA中的经笼蔽捕集部分。

25.根据条款24所述的方法，其中所述方法进一步包括释放所述经笼蔽捕集部分以使所述经扩增的dsDNA连接于固体载体。

26.根据条款25所述的方法，其中所述方法进一步包括收集所述固体载体以分离所述经扩增的dsDNA。

27.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述模板转换寡核苷酸包含5’-非模板化序列。

28.根据条款27所述的方法，其中所述5’-非模板化序列的长度是10nt至100nt。

29.根据条款27或28所述的方法，其中所述5’-非模板化序列包含限制核酸内切酶识别位点。

30.根据条款27-29中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含引物结合位点。

31.根据条款27-30中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含确定序列。

32.根据条款27-31中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含来源条型码序列。

33.根据条款32所述的方法，其中所述来源条型码序列包括样品条型码序列。

34.根据条款32或33所述的方法，其中所述来源条型码序列包括孔条型码序列。

35.根据条款32-34中的任一条所述的方法，其中所述来源条型码序列包括细胞条型码序列。

36.根据条款27-35中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含独特分子标识符序列(UMI)。

37.根据条款27-36中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含独特分子标识符(UMI)结构域。

38.根据条款27-37中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含条型码化独特分子标识符(BUMI)结构域。

39.根据条款27-38中的任一条所述的方法，其中所述‘5-非模板化序列包含测序平台衔接物构建体。

40.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述模板转换寡核苷酸包含在所述扩增期间整合至所述经扩增的dsDNA中的经笼蔽捕集部分。

41.根据条款40所述的方法，其中所述方法进一步包括释放所述经笼蔽捕集部分以使所述经扩增的dsDNA连接于固体载体。

42.根据条款41所述的方法，其中所述方法进一步包括收集所述固体载体以分离所述经扩增的dsDNA。

43.根据条款11-42中的任一条所述的方法，其中所述单一产物核酸引物与所述模板转换寡核苷酸均包含5’-非模板化序列。

44.根据条款43所述的方法，其中所述单一产物核酸引物和所述模板转换寡核苷酸包含相同5’-非模板化序列。

45.根据条款43所述的方法，其中所述单一产物核酸引物和所述模板转换寡核苷酸包含不同的5’-非模板化序列。

46.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述单一产物核酸引物连接于固体载体。

47.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述模板转换寡核苷酸连接于固体载体。

48.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述扩增包括抑制PCR。

49.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述扩增包括定量PCR。

50.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述扩增包括乳液PCR。

51.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述方法进一步包括在转录之前使所述模板核酸变性。

52.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述扩增之后纯化所述经扩增的dsDNA。

53.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中在所述组合与所述扩增之间不纯化所述单一产物核酸。

54.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述方法在反应容器中进行。

55.根据条款54所述的方法，其中所述反应容器是管。

56.根据条款54所述的方法，其中所述反应容器是多孔板的孔。

57.根据条款1-53中的任一条所述的方法，其中所述方法在小滴中进行。

58.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述反应混合物包含核酸检测试剂。

59.根据条款58所述的方法，其中所述方法进一步包括基于所述核酸检测试剂来检测所述经扩增的dsDNA的存在。

60.根据条款59所述的方法，其中所述方法在小滴中进行，并且进一步包括基于所述检测来分选所述小滴。

61.根据条款60所述的方法，其中所述分选使用基于荧光的小滴分选器进行。

62.根据条款61所述的方法，其中所述基于荧光的小滴分选器是流式细胞仪。

63.根据条款61所述的方法，其中所述基于荧光的小滴分选器是基于微流控的小滴分选器。

64.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述方法进一步包括使经标记探针与所述经扩增的dsDNA杂交。

65.根据条款64所述的方法，其中所述经标记探针互补于靶标序列，并且当与所述经扩增的dsDNA杂交时，指示在所述经扩增的dsDNA中存在所述靶标序列。

66.根据条款65所述的方法，其中所述方法进一步包括检测所述靶标序列的存在。

67.根据条款66所述的方法，其中所述方法在小滴中进行，并且进一步包括基于所述检测来分选所述小滴。

68.根据条款67所述的方法，其中所述分选使用基于荧光的小滴分选器进行。

69.根据条款68所述的方法，其中所述基于荧光的小滴分选器是流式细胞仪。

70.根据条款68所述的方法，其中所述基于荧光的小滴分选器是基于微流控的小滴分选器。

71.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述单一产物核酸引物包含随机序列。

72.根据条款71所述的方法，其中所述随机序列是随机六聚体序列。

73.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述模板核酸包含尾部序列。

74.根据条款73所述的方法，其中所述尾部序列包括聚(A)序列。

75.根据条款73所述的方法，其中所述尾部序列包括聚(T)序列。

76.根据条款73-75中的任一条所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述尾部序列添加至所述模板核酸中的加尾反应。

77.根据条款73-76中的任一条所述的方法，其中所述单一产物核酸引物包含互补于所述尾部序列的序列。

78.根据条款77所述的方法，其中互补于所述尾部序列的所述序列包括聚(dT)序列。

79.根据条款77所述的方法，其中互补于所述尾部序列的所述序列包括聚(dA)序列。

80.根据前述条款中的任一条所述的方法，其中所述模板核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)。

81.根据条款80所述的方法，其中所述DNA是基因组DNA。

82.根据条款1-79中的任一条所述的方法，其中所述模板核酸包括核糖核酸(RNA)。

83.根据条款82所述的方法，其中所述RNA是信使RNA(mRNA)。

84.根据条款82或83所述的方法，其中所述单一产物核酸引物是第一链互补DNA(cDNA)引物，并且所述dsDNA是双链cDNA。

85.一种试剂盒，其包括：

单一产物核酸引物；

包含3′杂交结构域的模板转换寡核苷酸；和

包含扩增聚合酶和逆转录酶的聚合酶混合物。

86.根据条款85所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物和所述模板转换寡核苷酸在单独容器中。

87.根据条款85所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物和所述模板转换寡核苷酸在同一容器中。

88.根据条款87所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物、所述模板转换寡核苷酸和所述聚合酶混合物在同一容器中。

89.根据条款85-88中的任一条所述的试剂盒，其中所述扩增聚合酶是热启动聚合酶。

90.根据条款85-89中的任一条所述的试剂盒，其中所述扩增聚合酶是热稳定聚合酶。

91.根据条款85-90中的任一条所述的试剂盒，其中所述逆转录酶是逆转录病毒逆转录酶。

92.根据条款91所述的试剂盒，其中所述逆转录病毒逆转录酶是鼠白血病病毒逆转录酶。

93.根据条款85-92中的任一条所述的试剂盒，其中所述3′杂交结构域与由所述逆转录酶添加至单一产物核酸中的非模板化序列杂交。

94.根据条款93所述的试剂盒，其中所述非模板化序列包含异多核苷酸。

95.根据条款94所述的试剂盒，其中所述异多核苷酸包括异三核苷酸。

96.根据条款85-93中的任一条所述的试剂盒，其中所述非模板化序列包含同多核苷酸。

97.根据条款96所述的试剂盒，其中所述同多核苷酸包括同三核苷酸。

98.根据条款85-97中的任一条所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物包含‘5-非模板化序列。

99.根据条款98所述的试剂盒，其中所述5’-非模板化序列的长度是10nt至100nt。

100.根据条款98或99所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含限制核酸内切酶识别位点。

101.根据条款98-100中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含引物结合位点。

102.根据条款98-101中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含确定序列。

103.根据条款98-102中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含来源条型码序列。

104.根据条款103所述的试剂盒，其中所述来源条型码序列包括样品条型码序列。

105.根据条款103或104所述的试剂盒，其中所述来源条型码序列包括孔条型码序列。

106.根据条款103-105中的任一条所述的试剂盒，其中所述来源条型码序列包括细胞条型码序列。

107.根据条款98-106中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含独特分子标识符序列(UMI)。

108.根据条款98-107中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含独特分子标识符(UMI)结构域。

109.根据条款98-108中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含条型码化独特分子标识符(BUMI)结构域。

110.根据条款98-109中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含测序平台衔接物构建体。

111.根据条款85-110中的任一条所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物包含经笼蔽捕集部分。

112.根据条款85-111中的任一条所述的试剂盒，其中所述模板转换寡核苷酸包含5’-非模板化序列。

113.根据条款112所述的试剂盒，其中所述5’-非模板化序列的长度是10nt至100nt。

114.根据条款112或113所述的试剂盒，其中所述5’-非模板化序列包含限制核酸内切酶识别位点。

115.根据条款112-114中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含引物结合位点。

116.根据条款112-115中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含确定序列。

117.根据条款112-116中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含来源条型码序列。

118.根据条款117所述的试剂盒，其中所述来源条型码序列包括样品条型码序列。

119.根据条款117或118的试剂盒，其中所述来源条型码序列包括孔条型码序列。

120.根据条款117-119中的任一条所述的试剂盒，其中所述来源条型码序列包括细胞条型码序列。

121.根据条款114-120中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含独特分子标识符序列(UMI)。

122.根据条款114-121中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含独特分子标识符(UMI)结构域。

123.根据条款114-122中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含条型码化独特分子标识符(BUMI)结构域。

124.根据条款114-123中的任一条所述的试剂盒，其中所述‘5-非模板化序列包含测序平台衔接物构建体。

125.根据条款85-124中的任一条所述的试剂盒，其中所述模板转换寡核苷酸包含经笼蔽捕集部分。

126.根据条款98-125中的任一条所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物与所述模板转换寡核苷酸均包含5’-非模板化序列。

127.根据条款126所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物和所述模板转换寡核苷酸包含相同的5’-非模板化序列。

128.根据条款127所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物和所述模板转换寡核苷酸包含不同的5’-非模板化序列。

129.根据条款85-128中的任一条所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物连接于固体载体。

130.根据条款85-129中的任一条所述的试剂盒，其中所述模板转换寡核苷酸连接于固体载体。

131.根据条款85-130中的任一条所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括核酸检测试剂。

132.根据条款85-131中的任一条所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括经标记探针。

133.根据条款85-132中的任一条所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括dNTP。

134.根据条款85-133中的任一条所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物包含聚(dT)序列。

135.根据条款85-134中的任一条所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物包含聚(dA)序列。

136.根据条款85-135中的任一条所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物包含随机序列。

137.根据条款136所述的试剂盒，其中所述随机序列是随机六聚体序列。

138.根据条款85-137中的任一条所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括一种或多种用于进行加尾反应的试剂。

139.根据条款138所述的试剂盒，其中用于进行加尾反应的所述一种或多种试剂包括末端转移酶。

140.根据条款138或139所述的试剂盒，其中用于进行加尾反应的所述一种或多种试剂包括dNTP加尾混合物。

141.根据条款138-140中的任一条所述的试剂盒，其中用于进行加尾反应的所述一种或多种试剂包括磷酸酶。

尽管出于清晰理解的目的，以说明和举例方式较详细地描述了前述的发明，但是根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员显而易见的是，可在不背离随附权利要求书的精神或范围下对本发明进行某些更改和修改。

因此，先前所述仅说明本发明的原理。应理解，本领域技术人员将能够设计尽管未在本文中明确描述或示出，但体现本发明的原理，并且包括在本发明的精神和范围内的各种布置(arrangement)。此外，本文叙述的所有实例和条件措辞都主要意图帮助读者理解本发明的原理和由发明人为深化本领域所贡献的构思，并且应被解释为不限于此类具体叙述的实例和条件。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实施例的所有陈述都意图涵盖其结构等效物与功能等效物两者。另外，意图此类等效物包括当前已知的等效物和未来开发的等效物(即所开发的执行相同功能的任何要素，无论其结构如何)。因此，本发明的范围不意图局限于本文所示和所述的示例性实施方案。更确切来说，本发明的范围和精神由随附权利要求书体现。

Claims (15)

1.一种从核酸样品产生经扩增的双链脱氧核糖核酸(dsDNA)的方法，所述方法包括：

(a)将以下各物：

核酸样品；

逆转录酶；

单一产物核酸引物；

包含3′杂交结构域的模板转换寡核苷酸；

扩增聚合酶；和

三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)；

在足以产生双链核酸复合物的条件下组合在反应混合物中，所述双链核酸复合物包含模板核酸和与单一产物核酸的邻近区域杂交的所述模板转换寡核苷酸；以及

(b)使用所述模板转换寡核苷酸和所述单一产物核酸引物在足以产生经扩增的dsDNA的条件下从所述单一产物核酸进行扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述3′杂交结构域与由所述逆转录酶添加至所述单一产物核酸中的非模板化序列杂交。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述非模板化序列包含异多核苷酸或同多核苷酸。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增聚合酶是热启动聚合酶、热稳定聚合酶或两者。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单一产物核酸引物、所述模板转换寡核苷酸或两者包含选自由以下组成的组的‘5-非模板化序列：限制核酸内切酶识别位点、引物结合位点、确定序列、条型码序列、独特分子标识符序列(UMI)、测序平台衔接物构建体及其组合。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述组合与所述扩增之间不纯化所述单一产物核酸。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在反应容器或小滴中进行。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述模板核酸包括信使RNA(mRNA)，所述单一产物核酸引物是第一链互补DNA(cDNA)引物，并且所述dsDNA是双链cDNA。

9.一种试剂盒，其包括：

单一产物核酸引物；

包含3′杂交结构域的模板转换寡核苷酸；和

包含扩增聚合酶和逆转录酶的聚合酶混合物。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物和所述模板转换寡核苷酸在同一容器中。

11.根据权利要求9或10所述的试剂盒，其中所述扩增聚合酶是热启动聚合酶、热稳定聚合酶或两者。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的试剂盒，其中所述逆转录酶是逆转录病毒逆转录酶。

13.根据权利要求9-12中任一项所述的试剂盒，其中所述3′杂交结构域与由所述逆转录酶添加至单一产物核酸中的非模板化序列杂交。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述非模板化序列包含异多核苷酸或同多核苷酸。

15.根据权利要求9-14中任一项所述的试剂盒，其中所述单一产物核酸引物、所述模板转换寡核苷酸或两者包含选自由以下组成的组的‘5-非模板化序列：限制核酸内切酶识别位点、引物结合位点、确定序列、条型码序列、独特分子标识符序列(UMI)、测序平台衔接物构建体或其组合。