TWI480374B - 針對ａ型流感ｈ１亞型病毒具有高專一性的適合體及其應用 - Google Patents

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Description

針對A型流感H1亞型病毒具有高專一性的適合體及其應用
本發明係關於一種對於A型流感H1亞型病毒專一性結合之適合體及其應用。
流行性感冒，或簡稱為流感，是一種由流感病毒所引起之急性呼吸道感染疾病。流感病毒可藉由空氣、接觸傳染，隨著交通的發達，旅遊、經貿、社交等活動的頻繁，在世界各地常發生週期性的大流行，例如：1918年發生的西班牙流感、1968年發生的香港流感等。流感的症狀除了呼吸道方面的症狀如流鼻涕、喉嚨痛、咳嗽外，亦可包括發燒、頭痛、肌肉痛、疲倦等。流感的感染症狀為突然發生且通常會引起全身性的併發症，對於抵抗力較弱的老人或小孩及一些免疫功能不全的病人易引起較嚴重的症狀，如肺炎或是心肺衰竭等，甚至會導致死亡。
流感病毒可分為A、B、C三型，其中A型流感又依其外套膜上的兩種醣蛋白-血球凝集素(Hemagglutinin)和神經氨酸酶(Neuraminidase)進一步區分成多種亞型，如：H1N1、H3N2、H7N9等。流感之威脅在於其爆發流行快速、散播範圍廣泛以及併發症嚴重，尤其是A型流感最易造成地區流行或世界流行；此外A型流感在不同物種間的傳播與重組，如：人類、豬隻、禽鳥，亦增加治療及防疫的難度。
因此，流感的早期診斷與預防是至關重要的。目前常用的流感病毒感染的檢測方法包含病毒培養、病毒核酸檢測、血清學檢測及流感快篩等。此些檢測方法普遍有耗時、靈敏性/專一性低、需大量檢體或昂貴試劑等缺點，其中流感快篩雖可簡單且快速得到檢驗結果，不必使用特別的儀器，可在診間或病房直接操作，但其敏感性不高且易出現偽陰性(false negative)，亦無法準確區分流感的類型或亞型。另一方面，臨床上常使用具有專一性的抗體來對流感病毒進行檢測，該些抗體雖具有專一性，但抗體本身對外在的環境條件，如：溫度、濕度，非常敏感，故保存不易且容易失去活性，會造成儲存、運送、及使用上的不便。再者，因抗體的製備為批次反應，各批次間的活性不會完全相同，而且操作抗體時容易受到人為或操作環境的影響而產生誤差。
有鑑於此，預防及準確診斷是對抗流感及公共衛生感染防治之一極為重要的環節，而準確的診斷更是有效治療的基礎。然而目前市面上尚缺乏一種準確、低成本、易保存且高效率的流感病毒檢測技術。
有鑑於此，本發明提供一種適合體，係包含(i)SEQ ID NO：2之核酸序列或其互補之核酸序列，或(ii)SEQ ID NO：2中的40個核苷酸SEQ ID NO：1之核酸序列或其互補之核酸序列，其中該SEQ ID NO：2之互補核酸序列係SEQ ID NO：4之核酸序列，該SEQ ID NO：1之互補核酸序列係SEQ ID NO：3之核酸序列。本發明提供之適合體與A型流感H1亞型病毒專一性結合，其中該適合體具有主幹-環(stem-loop)的立體結構。
本發明提供一種用於偵測檢體中A型流感H1亞型病毒存在 之微流體晶片，至少包含本發明之適合體。
本發明提供一種偵測檢體中A型流感H1亞型病毒存在之方法，其步驟包含：(1)將一檢體與本發明之適合體接觸，使該檢體中的A型流感H1亞型病毒與該適合體結合；以及(2)藉結合反應偵測該檢體中A型流感H1亞型病毒之存在；其中該檢體係為咽喉上皮細胞、痰、或血清。該方法進一步包含以該適合體修飾一磁珠表面。該結合反應係該適合體修飾之磁珠抓取A型流感H1亞型病毒，且經磁場導引分離出已與該適合體結合之A型流感H1亞型病毒，該偵測該檢體中A型流感H1亞型病毒之存在的方法包括但不限於膠體電泳法。
本發明之適合體對A型流感H1亞型病毒具有高度專一性及結合率，可用於檢測A型流感H1亞型病毒。且適合體分子量小、具有熱穩定性、抗降解，可長期保存、可重覆使用並容易結合其他分子，相較於抗體，不僅能克服動物生產的缺點，且容易放大、能保持生產的精確性。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
1‧‧‧A型流感H1亞型病毒專一性適合體修飾之磁珠
11‧‧‧A型流感H1亞型病毒專一性適合體
12‧‧‧磁珠
2‧‧‧目標病毒
3‧‧‧底材
4‧‧‧磁場
5‧‧‧目標病毒的RNA
6‧‧‧目標病毒增幅的DNA
第1圖係利用本發明之適合體修飾的磁珠檢測目標病毒之流程圖。
第2圖係本發明之適合體之有義股與反義股之專一性比較。
第3圖係本發明之適合體的立體結構圖，其中(a)係SEQ ID NO：4之立 體結構；(b)係SEQ ID NO：2之立體結構。
第4圖係利用本發明之適合體修飾的磁珠進行專一性檢測之電泳圖。
第5圖係利用本發明之適合體修飾的磁珠進行靈敏度檢測之電泳圖。
第6圖係利用本發明之適合體修飾的磁珠檢測待測檢體中病毒之電泳圖。
本發明提供一種適合體，係藉由系統性配分子指數增益演繹程序(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)體外篩選技術與微流體晶片技術結合篩選而得，其對A型流感H1亞型病毒具有高專一性與高結合率。更進一步以本發明之適合體修飾於磁珠上與不同的病毒進行結合反應，以驗證其對A型流感H1亞型病毒之高專一性；亦將磁珠以本發明之適合體及抗體修飾，並與不同濃度的A型流感H1亞型病毒進行結合反應，以驗證其靈敏度較抗體為高。
定義
「聚核苷酸」、「核苷酸」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸序列」、「聚核苷酸序列」及「核苷酸序列」一詞在本文中可互換使用，以表示任何長度之核苷酸的聚合物形式。聚核苷酸可包含去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及/或其類似物或衍生物。本文所示之核苷酸序列係以5’至3’方向排列。
「具專一性」係為當該適合體可與A型流感H1亞型病毒結合或產生交互作用，但未顯著地與其他病毒或細胞結合或產生交互作用。
「檢體」一詞係任何衍生自病患之生物檢體。該包括但不限於生物液體，諸如：血液、血清、血漿、尿液、腦脊髓液、淚液、唾液、 咽喉上皮細胞、痰、淋巴、透析液、灌洗液、精液及其他液體樣本，以及生物來源之細胞及組織。該辭彙亦包括細胞或其衍生之細胞及其子代，包括培養物中之細胞、細胞上清液及細胞裂解物。亦包括器官或組織培養物衍生的液體、組織生物樣本、腫瘤生檢樣本、糞便樣本、萃取自生理組織之液體以及分離自固態組織、組織切片及細胞裂解物之細胞。此一定義涵括在其獲得之後以任何方式操作之樣本，諸如：以試劑處理、溶解或使其富含某些組成份，諸如：聚核苷酸或胜肽。亦包括病患樣本之衛生物及區份。病患樣本可用於診斷、其他監測分析。
「微流體晶片」、「微流體裝置」、及「晶片」一詞在本文中可互換使用，以表示一獨立的整合單元，其具有一微流體反應器、一個或多個微流體流道、及一個或多個閥門(valve)。微流體晶片亦典型地具有其他微流體組件，例如：泵浦(pump)、槽(chamber)、混合器(mixer)、及其類似的組件。微流體晶片通常係由合成橡膠(elastomer)、玻璃(glass)、或矽(silicon)製成。典型地，微流體晶片係為具有一高度相較於長度及寬度為短的盒狀物，然而，晶片亦可為任意形狀，例如：立方體、圓柱體、或其他。
材料及方法： 單股DNA分子庫(ssDNA library)
單股DNA分子庫之序列含有：一40-mer隨機的核苷酸序列位於中間、及前後各16-mer的引子序列。該單股DNA分子庫所包含之一種序列如下所示：5’-GGCAGGAAGACAAACA-N40 -TGGTCTGTGGTG-CTGT-3’，其中前向引子F1為：5’-GGCAGGAAGACAAACA-3’(SEQ ID NO：5)、反向引子R1為：5’-ACAGCACCACAGACCA-3’(SEO ID NO：6)；該單 股DNA分子庫所包含之另一種序列如下所示：5’-ACAGCACCACAGACCA-N40 -TGTTTGTCTTCCTGCC，其中前向引子F2為：5’-ACAGCACCACAGACCA-3’(SEQ ID NO：7)、反向引子R2為：5’-GGCAGGAAGACAAACA-3’(SEQ ID NO：8)。使用SELEX自單股DNA分子庫之序列中篩選出對前述特定病毒具有專一性之單股DNA，即為對特定病毒具有專一性的適合體。
抗流感病毒核蛋白單株抗體(Anti-influenza virus nucleoprotein monoclonal antibodies)修飾的磁珠之製備
為了抓取不同的流感病毒，本發明使用抗A型流感病毒核蛋白單株抗體(anti-NP-A mAb,H16L-10-4R5 cell line(HB-65)，ATCC Co.，美國)及抗B型流感病毒核蛋白單株抗體(anti-NP-B mAb,influenza B nucleoprotein(B017)，GeneTex Co.，美國)。將該些單株抗體修飾於環氧樹脂包覆的磁珠(Epoxy-coated magnetic beads，直徑為4.5μm，Dynabeads® M-450 Epoxy，Invitrogen Co.，美國)，並以SELEX篩選對A型流感H1亞型病毒具有專一性之適合體。該些磁珠的表面以環氧樹脂胺基酸基團、氫硫基團、氫氧基團包覆，其用來與該抗A型流感病毒核蛋白單株抗體或該抗B型流感病毒核蛋白單株抗體修飾。該抗流感病毒核蛋白單株抗體修飾的磁珠之製備流程，請參見中華民國專利公開號第201200874號。
對A型流感H1亞型病毒具專一性適合體修飾的磁珠之製備
以SELEX微流體晶片從單股DNA分子庫中篩選出對A型流感H1亞型病毒具高專一性的適合體。將該適合體修飾到以羧酸包覆的磁珠(carboxylic acid coated magnetic beads，直徑為1μm，Dynabeads® MyoneTM Carboxylic Acid，Invitrogen Co.，USA)。該些磁珠的表面以羧酸基團包覆，可作為與胺基結合的雙功能交聯分子(bifunctional cross-linkers)。該對A型流感H1亞型病毒具專一性適合體修飾的磁珠之製備流程，請參見中華民國專利公開號第201200874號。
對A型流感H1亞型病毒具專一性適合體之篩選：以SELEX微流體晶片執行
進行正向篩選(positive selection)與反向篩選(negative selection)以獲得對A型流感H1亞型病毒具有較高專一性之適合體。首先，以抗A型流感病毒核蛋白單株抗體修飾的磁珠(4×108 磁珠/mL)辨識目標病毒，即A型流感病毒。在此步驟中，病毒與該單株抗體修飾的磁珠結合，形成一病毒-磁珠複合體。將該單股DNA分子庫(10μM隨機單股DNA序列，10μL)與該病毒-磁珠複合體共同培養於該SELEX微流體晶片的培養槽，並以一吸入式氣動微泵浦/微混合器混合。藉此，對A型流感H1亞型病毒具專一性的適合體可被該病毒-磁珠複合體抓取，即為正篩選。在培養槽底部使用一磁場來收集該些磁珠。以一清洗緩衝液(1×PBS,pH=7.4)清先去除未被抓取的單股DNA序列。接著，以微泵浦移動該些被抓取的單股DNA序列至PCR槽，並將之放大。
關於負向篩選，該單股DNA分子庫係與B型流感病毒及抗B型流感病毒核蛋白單株抗體修飾的磁珠共同培養。培養後，以磁場抓取磁珠。將上清液中未結合B型流感病毒的單股DNA移動至PCR槽並放大。
上述篩選中的PCR反應係由晶片下方之一溫度控制單元及一電熱冷卻器控制。開始時溫度為95℃並維持10分鐘使DNA變性(denaturation)，之後進行20次循環，該循環由在95℃變性反應30秒、在68℃ 黏著反應(annealing)30秒、及在72℃擴增反應(extension)30秒。在20次循環後，在72℃進行最後一次擴增反應10分鐘，將產物儲存於4℃。
總括而言，該SELEX微流體晶片係包括：一吸入式氣動微泵浦/微混合器混合作為控制單元、一反應物與檢體槽、一PCR單元及一含磁珠之適合體分離單元，可直接於晶片上完成培養、分離、及放大，即上述正向篩選與負向篩選。經過五次正向篩選與負向篩選循環，可分離出對A型流感H1亞型病毒具有高專一性及高結合率的適合體。
對A型流感H1亞型病毒具專一性適合體之TA選殖(TA-cloning)
經上述SELEX微流體晶片篩選並放大的適合體，進一步以TOPO vector® system(pCR® 2.1-TOPO® ，39.kb，Invitrogen Co.，美國)選殖。共選殖28個對A型流感H1亞型病毒具專一性適合體之DNA，該些DNA再以FavorPrepTM Plasmid DNA Extraction Mini Kit(Favorgen Biotech Co.，臺灣)進行分離及純化。
選擇其中1個DNA分子，以其有義股(sense strand)及反義股(antisense strand)進行定序分析。該有義股DNA序列為：5’-ACAGCACCACAGACCACCCGCGGATGCCGGTCCCTACGCGTCGCTGTCACGCTGGCTGTTTGTCTTCCTGCC-3’(SEQ ID NO：4)；該反義股DNA序列為：5’-GGCAGGAAGACAAACAGCCAGCGTGACAGCGACGC-GTAGGGACCGGCATCCGCGGGTGGTCTGTGGTGCTGT-3’(SEQ ID NO：2)。該反義股中含有本發明與A型流感H1亞型病毒專一性結合之DNA序列，係：5’-GCCAGCGTGACAGCGACGCGTAGGGACCGGCATCCGCG-GG-3’(SEQ ID NO：1)；該有義股中含有本發明與A型流感H1亞型病毒專一 性結合之DNA序列，係：5’-CCGCGGATGCCGGTCCCTACGCGTCGCTGTCACGCTGGC-3’(SEQ ID NO：3)。
實施例1：以A型流感H1亞型病毒高專一性適合體修飾之磁珠檢測目標病毒
請參閱第1圖，首先，將A型流感H1亞型病毒專一性適合體11 與磁珠12 結合形成A型流感H1亞型病毒專一性適合體修飾之磁珠1 ，再與目標病毒2 混合。其中，該A型流感H1亞型病毒專一性適合體11 係上述A型流感H1亞型病毒專一性適合體之有義股DNA序列(SEQ ID NO：4)及反義股DNA序列(SEQ ID NO：2)；該目標病毒2 係：A型流感H1亞型病毒(InfA/H1)、B型流感病毒(InfB)、或A型流感H3亞型病毒(InfA/H3)。經混合後，利用磁場4 把磁珠聚集在底材3 上，接著進行三次的清洗，留下與本發明之對A型流感H1亞型病毒具高專一性的適合體結合的目標病毒。接著，於95℃把抓取下來的病毒破壞，釋放出目標病毒的RNA5 ，並進行反轉錄-聚合酶鏈鎖反應來增幅該目標病毒的DNA6 。最後，將放大後的該目標病毒cDNA片段進行膠體電泳。
如第2圖所示，其中，第1道(lane 1)含有該A型流感H1亞型病毒專一性適合體之SEQ ID NO：4的DNA序列，第2道(lane 2)含有該A型流感H1亞型病毒專一性適合體之SEQ ID NO：2的DNA序列；第N道(lane N)為二次蒸餾水的反控制組(negative control)，第P道(lane P)則為目標病毒RNA的正控制組(positive control)，第L道(lane L)代表100bp之DNA梯狀標記(ladder)。放大後的目標病毒，即InfA/H1、InfB、InfA/H3之基因片段長度分 別為：249bp、170bp、147bp。第2圖的結果顯示，該A型流感H1亞型病毒專一性適合體之反義股DNA序列(SEQ ID NO：2)僅在InfA/H1出現條帶(band)，而InfB及InfA/H3均未出現條帶，顯示其對A型流感H1亞型病毒(InfA/H1)具有高專一性；相對的，該A型流感H1亞型病毒專一性適合體之有義股DNA序列(SEQ ID NO：4)雖亦可與InfA/H1結合，但其亦會與InfB結合(InfB之1道出現條帶)，代表其對A型流感H1亞型病毒的專一性較差。
進一步將該A型流感H1亞型病毒專一性適合體之有義股DNA序列(SEQ ID NO：4)及反義股DNA序列(SEQ ID NO：2)以MFOLD軟體進行立體結構的預測，其結果如第3圖所示。預測結果，該A型流感H1亞型病毒專一性適合體之有義股DNA序列(SEQ ID NO：4)的立體結構(第3(a)圖)，其自由能為-19.04kcal/mol；該A型流感H1亞型病毒專一性適合體之反義股DNA序列(SEQ ID NO：2)可能的立體結構(第3(b)圖)，其自由能為-21.88kcal/mol。綜合上述專一性比較結果，該A型流感H1亞型病毒專一性適合體之反義股DNA序列(SEQ ID NO：2)較有義股DNA序列(SEQ ID NO：4)更具有專一性且更穩定。
自由能(Free energy，△G)係一熱力學的特性，可預測一可逆反應(reversible process)是否在一固定的溫度及壓力下自發性地發生。因此，當自由能(單位：kcal/mol)係一負值，表示該反應為一自發性反應(spontaneous reaction)或一放能反應(energy-releasing reaction)；當自由能(單位：kcal/mol)係一正值，表示該反應為一非自發性反應(non-spontaneous reaction)或一耗能反應(energy-consuming reaction)。本發明針對A型流感H1亞型病毒具有高專一性的適合體其立體結構具有負值的自由能，即表示該 適合體形成立體結構的反應係為自發性的放能反應，且該適合體具有的自由能小，代表其穩定，故本案之適合體可代替傳統使用的抗體，作為檢測A型流感H1亞型病毒的生物標記。
實施例2：利用A型流感H1亞型病毒高專一性適合體修飾之磁珠進行專一性檢測
將以A型流感H1亞型病毒專一性適合體修飾之磁珠與不同的病毒共同培養，所使用的病毒包括：A型流感H1亞型病毒、B型流感病毒、A型流感H3亞型病毒、登革熱病毒第二型、腸病毒第71型，並使用人類粒腺體DNA。以市售試劑抽取各病毒的RNA或人類粒腺體的DNA，接著進行反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)。
本實施例中，使用失活的A型流感H1亞型病毒(H1N1)及B型流感病毒，其起始效價(initial titer)分別為64HAU及128HAU。此外，亦使用A型流感H3亞型病毒(H3N2)、登革熱病毒第2型(DENV-2)、腸病毒第71型(EV-71)，其起始效價或濃度分別為：100HAU、5×106 PFU、2×107 PFU。該些病毒首先在血清中混合，加入接近90%聚合的單層Madin-Darby氏狗腎臟上皮細胞(MDCK)並於35℃、5%二氧化碳的條件培養。接著，以一含有0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA，Invitrogen Co.，美國)之無血清的培養基置換該病毒/血清混合物，同樣於35℃、5%二氧化碳的條件培養。收集該培養基的上清液並收集病毒，以-80℃冷凍備用。
反轉錄酶-聚合酶鏈反應的引子分別針對上述各病毒及人類粒腺體DNA設計，放大後的片段長度分別為：A型流感H1亞型病毒(249bp)、B型流感病毒(170bp)、A型流感H3亞型病毒(143bp)、登革熱病毒第二 型(248bp)、腸病毒第71型(232bp)、人類粒腺體DNA(225bp)。本實施例中，進行PCR時所使用的引子，請參考表1所示。
該RT-PCR結果以2%瓊脂糖凝膠(agarose gel)與溴化乙錠 (Ethidium Bromide，EtBr)染色顯示。
其結果如第4圖所示，該圖係利用A型流感H1亞型病毒高專一性適合體SEQ ID NO：2修飾之磁珠進行專一性檢測之電泳圖。在載有A型流感H1亞型病毒的泳道上，實驗組A與控制組P皆出現條帶，即本發明之適合體可與A型流感H1亞型病毒結合；在其他病毒與人類粒腺體DNA的泳道上，僅控制組P出現條帶，即本發明之適合體不與其他病毒及人類粒腺體DNA結合，故可證實本發明之適合體對A型流感H1亞型病毒具有高度的專一性。
實施例3：利用A型流感H1亞型病毒高專一性適合體修飾之磁珠進行靈敏度檢測
使用經本發明之適合體修飾的磁珠與抗A型流感病毒核蛋白單株抗體進行靈敏度比較。所檢測之A型流感病毒的起始濃度為64HAU，並逐步以10倍稀釋至64×10-5 HAU。
結果如第5圖所示，該圖係利用A型流感H1亞型病毒高專一性適合體SEQ ID NO：2修飾之磁珠進行靈敏度檢測。其中，A型流感H1亞型病毒的DNA片段長度為249bp；L道代表100bp之DNA梯狀標記，利用二次蒸餾水來進行反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應；P道代表控制組，利用A型流感H1亞型病毒的RNA來進行反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應；各不同濃度泳道中的1道代表以A型流感H1亞型病毒專一性適合體修飾之磁珠，而2道代表以抗A型流感病毒核蛋白單株抗體修飾之磁珠。在64×10-3 HAU泳道及64×10-4 HAU泳道中，僅1道出現條帶，即僅以A型流感H1亞型病毒專一性適合體修飾之磁珠可與A型流感H1亞型病毒結合，故可知本發明之對A型流感H1亞型 病毒具有專一性的適合體對A型流感H1亞型病毒之檢測極限較抗A型流感病毒核蛋白單株抗體的靈敏度高約100倍。
實施例4：以A型流感H1亞型病毒專一性適合體檢測檢體中病毒
為了驗證本發明對A型流感H1亞型病毒具高專一性之適合體在臨床上的可利用性，將6.4×101 HAU之A型流感H1亞型病毒及B型流感病毒與檢體混合，其中該檢體係為咽喉取樣(throat swab)、痰(sputum)、血清(serum)。以本發明對A型流感H1亞型病毒具高專一性之適合體修飾的磁珠與含有病毒的檢體共同培養，並以PCR檢測。
結果請參考第6圖，其中A型流感H1亞型病毒的DNA片段長度為249bp，B型流感病毒的DNA片段長度為170bp；L道代表100bp之DNA梯狀標記；N道為以二次蒸餾水作為控制組；P道代表控制組，利用A型流感H1亞型病毒/B型流感病毒的RNA來進行反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應。在各病毒的泳道中，1道代表以該病毒與1×磷酸鹽緩衝液混合的樣本、2道代表含有該病毒之咽喉取樣檢體、3道代表含有該病毒之痰檢體、4道代表含有該病毒之血清檢體。第6圖中清楚可見，在以本發明對A型流感H1亞型病毒具高專一性之適合體修飾的磁珠與含有A型流感H1亞型病毒的各檢體共同培養的泳道上出見條帶；反之，在以本發明對A型流感H1亞型病毒具高專一性之適合體修飾的磁珠與含有B型流感病毒的各檢體共同培養的泳道上未出現任何條帶。結果顯示本發明對A型流感H1亞型病毒具高專一性之適合體在檢體(如：痰、血清等)中亦具有高度專一性，故，可準確檢測檢體中A型流感H1亞型病毒，並且有效利用作為檢測A型流感H1亞型病毒之生物標記。
綜上所述，本發明之適合體對A型流感H1亞型病毒具有高度專一性及結合率，且適合體具有分子量小、易變性復性、可重覆使用及容易結合其他分子等優點，故相較於抗體，不僅能克服動物生產的缺點，且容易放大、能保持生產的精確性。適合體亦具有熱穩定性、抗降解，可長期保存。
<110> 國立清華大學
<120> 針對A型流感H1亞型病毒具有高專一性的適合體及其應用
<160> 20
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 與A型流感H1亞型病毒專一性結合之DNA
<400> 1
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A型流感H1亞型病毒專一性適合體之反義股序列
<400> 2
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 與A型流感H1亞型病毒專一性結合之DNA
<400> 3
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A型流感H1亞型病毒專一性適合體之有義股序列
<400> 4
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前向引子F1
<400> 5
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引子R1
<400> 6
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前向引子F2
<400> 7
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引子R2
<400> 8
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A型流感H1亞型病毒PCR前向引子
<400> 9
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A型流感H1亞型病毒PCR反向引子
<400> 10
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A型流感H3亞型病毒PCR前向引子
<400> 11
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A型流感H3亞型病毒PCR反向引子
<400> 12
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B型流感病毒PCR前向引子
<400> 13
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B型流感病毒PCR反向引子
<400> 14
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 登革熱病毒第2型PCR前向引子
<400> 15
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 登革熱病毒第2型PCR反向引子
<400> 16
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 腸病毒第71型PCR前向引子
<400> 17
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 腸病毒第71型PCR反向引子
<400> 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類粒腺體DNA之PCR前向引子
<400> 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類粒腺體DNA之PCR反向引子
<400> 20
1‧‧‧A型流感H1亞型病毒專一性適合體修飾之磁珠
11‧‧‧A型流感H1亞型病毒專一性適合體
12‧‧‧磁珠
2‧‧‧目標病毒
3‧‧‧底材
4‧‧‧磁場
5‧‧‧目標病毒的RNA
6‧‧‧目標病毒增幅的DNA

Claims (10)

  1. 一種適合體，係由(i)SEQ ID NO：2之核酸序列或其完全互補之核酸序列，或(ii)SEQ ID NO：2中的40個核苷酸SEQ ID NO：1之核酸序列或其完全互補之核酸序列所組成，其中該適合體與A型流感H1亞型病毒專一性結合。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之適合體，其中該適合體具有主幹-環(stem-loop)結構。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之適合體，其中該SEQ ID NO：2之完全互補核酸序列是SEQ ID NO：4之核酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之適合體，其中該SEQ ID NO：1之完全互補核酸序列是SEQ ID NO：3之核酸序列。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之適合體，其中該適合體具有主幹-環(stem-loop)結構。
  6. 一種用於偵測檢體中A型流感H1亞型病毒存在之微流體晶片，至少包含如申請專利範圍第1或3項所述之適合體。
  7. 一種偵測檢體中A型流感H1亞型病毒存在之方法，其步驟包含：(1)將一檢體與如申請專利範圍第1或3項所述之適合體接觸，使該檢體中的A型流感H1亞型病毒與該適合體結合；以及(2)藉結合反應偵測該檢體中A型流感H1亞型病毒之存在。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該檢體係為咽喉上皮細胞、痰、或血清。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之方法，進一步包含以該適合體修飾一磁珠 表面。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該結合反應係該適合體修飾之磁珠抓取A型流感H1亞型病毒，且經磁場導引分離出已與該適合體結合之A型流感H1亞型病毒。
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