CN110592280A - 一种基于双适体rca技术快速诊断h1n1流感病毒的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒及检测方法，所述的试剂盒，包括如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5所示的序列，其中SEQ ID NO：1,SEQ ID NO：2为H1N1流感病毒的核酸适体序列，SEQ ID NO：3为成环反应序列，SEQ ID NO：4为环互补序列，SEQ ID NO：5为RCA反应体系引物2。本发明成本低、检测快速。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒及检测方法。
背景技术
H1N1是一种甲型流感RNA病毒，是人类最常感染的流感病毒之一。H1N1流感曾于1918年大爆发。2009年，中国31个省份累计报告甲型H1N1流感确诊病例92904例，死亡病例200例。2019年以来，印度已确诊6701例甲型H1N1流感病例，其中至少226人死亡，远超2018年同期798例确诊病例和68人死亡的数据。截至2019年以来，希腊感染H1N1流感病毒而死亡的人数已经上升到了127人。由于H1N1可直接感染人，导致人类患病或死亡，其公共卫生意义日渐显著。加强对H1N1监控和检测的研究，在减少世界经济损失和提高人类卫生健康方面，都具有深远的现实意义。
当前流感病毒检测有两个趋势。一是高精度检测，主要技术有RT-real-time PCR、RT-LAMP和微流控、生物芯片及传感器等。多适合大的研究单位和疾病控制部门使用。另外一个是现场快速检测，主要是操作简单的试剂盒。例如，常规滚环扩增(rolling circleamolification,RCA)。适用于基层诊所、普通易感人群和偏远乡村居民。
但常规RCA，需要多种酶和高温裂解流感病毒，其操作复杂，且RNA极易降解，成本高。
发明内容
本发明设计了基于双适体滚环扩增(double aptamer-rolling circleamolification,DA-RCA)检测流感病毒的新方法和试剂盒。该方法无需裂解禽流感病毒，只需通过适体1捕获流感病毒，适体2结合流感病毒，同时适体2作为RCA的引物1，进行RCA扩增。RCA结果通过羟基萘酚蓝(HNB)指示剂显色。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，包括如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5所示的序列，其中SEQ ID NO：1,SEQ ID NO：2分别为H1N1流感病毒的核酸适体序列，SEQ ID NO：3为成环反应序列，SEQ ID NO：4为环互补序列，SEQ ID NO：5为RCA反应体系引物2。
在本发明一较佳实施例中，所述RCA反应体系每50μL中包括：
余量为ddH20。
在本发明一较佳实施例中，所述H1N1流感病毒的核酸适体,适体1序列SEQ ID NO：1和适体2序列SEQ ID NO：2分别采用H1N1完整病毒颗粒和B型流感病毒颗粒进行点杂交实验进行验证。
在本发明一较佳实施例中，所述H1N1流感病毒的核酸适体1，采用磁珠-多价适体1。
在本发明一较佳实施例中，所述磁珠-多价适体1捕获H1N1流感病毒的缓冲液组分为0.5M NaCl、20mM Tris-HCL和1mM EDTA，缓冲液pH＝7.5。
在本发明一较佳实施例中，所述磁珠-多价适体1-H1N1流感病毒复合物结合适体2的缓冲液组分为0.5M NaCl、20mM Tris-HCL和1mM EDTA，缓冲液pH＝7.5。
在本发明一较佳实施例中，所述成环反应步骤为加入0.5μL SEQ ID NO：3和0.5μLSEQ ID NO：4所示的序列，缓冲液组分为20mM Tris-HCL和1mM EDTA，缓冲液pH＝7.5，15μLddH2O于PCR管中。95℃反应4～6min,37℃放置12～18min,加入3μL 10×T4 DNA ligasebuffer、1μL 400U/μL T4 DNA连接酶,置25℃反应2h。反应结束后加入EXO I外切酶0.8μL，EXO III外切酶0.4μL，于37℃反应1h后85℃灭活20min，备用。
本发明技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明技术方案采用适体1富集禽流感病毒，禽流感病毒结合适体2，以适体2作为RCA反应的引物1，再加入RCA引物2，进行双引物滚环扩增技术。本发明以DA-RCA为基础，开发了一种成本低、检测快速、组成和操作简单的H1N1病毒检测装置及相应方法与试剂，低成本和简便的操作可使流感病毒检测门槛降低。
附图说明
图1为双适体滚环扩增(DA-RCA)法示意图。
图2为适体1和适体2点杂交实验结果图。其中图2A为适体1点杂交实验结果图；图2B为试点2点杂交实验结果图。
图3为锁式法制备环DNA示意图。
图4DA-RCA实验结果核酸电泳图。图4A为DA-RCA检测H1N1流感病毒实验结果核酸电泳图；图4B为DA-RCA检测B型流感病毒实验结果核酸电泳图。
图5DA-RCA实验结果显色效果图。
具体实施方式
本实施例的一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，包括如SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：5所示的序列，还包括RCA反应体系：
SEQ ID No：1：
5′-BIO-gtacttccattcgacctctgtaacagccacgaaaaccctatatcaaaagtg-3′
SEQ ID No：2：
5′-ggaccagttgtctttcggtctctaccccagcccgt-3′
SEQ ID No：3：
5′-Pho-cctacgaaccactgaacacgggctggggtagagaccgaaaga
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SEQ ID No：4：
5′-gttcagtggttcgtagggctttcccccact-3′
SEQ ID No：5：
5′-tggtctatctggaagaat-3′
其中SEQ ID NO：1为H1N1流感病毒的核酸适体1序列，SEQ ID NO：2为H1N1流感病毒的核酸适体2序列，SEQ ID NO：3为成环反应序列，SEQ ID NO：4为环互补序列，SEQ IDNO：5为RCA反应体系引物2。
本实施例的RCA反应体系每50μL中包括：
余量为ddH20。
本试剂盒检测H1N1流感病毒经如下步骤：
一、适体合成筛选验证
将不同浓度梯度(750ng/μL,375ng/μL,187.5ng/μL,93.75ng/μL)的H1N1完整病毒颗粒和B型流感病毒颗粒(均已灭活)分别取1μL点样在NC膜上，将膜放入微孔板室温放置2h，用BW缓冲液(20mM Tris-HCl,pH7.5,0.5M NaCl,2mM MgCl2,5mM KCl,1mM CaCl2,0.02％NP40)500μL洗涤1次，然后用3％BSA溶液进行封闭，室温1h，用BW缓冲液500μL洗涤1次，在不同微孔板中加入不同适体0.5uM，适体采用95℃加热10min，立即置于冰上10min进行处理，摇床孵育2h，用BW缓冲液500μL洗涤3次，加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(streptavidin-horseradish peroxidase(HRP)conjugate)1μL，用去离子水稀释至1mL，摇床孵育1h，加入ECL显色液，AB液按1：1混合，显示结果图(如图2A,2B所示)。获得适体1(序列SEQ ID NO：1)和适体2(序列SEQ ID NO：2)，适体1和适体2能够很好的结合灭活H1N1完整病毒颗粒。
二、磁珠-多价适体制备实验
取0.1mg链霉亲和素磁珠，置于1.5mL洁净离心管中；配置漂洗/结合缓冲液(0.5MNaCl，20mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH7.5)，取300μL漂洗/结合缓冲液与0.1mg链霉亲和素磁珠溶液在离心管中混匀，涡旋振荡后于室温放置10min，磁性分离，移除上清。另取100μL漂洗/结合缓冲液置于1.5mL洁净离心管中，加入3μL(100umol/L)适体1，室温混合放置10min，将该适体1溶液加入装有磁珠的离心管中，室温结合30min，磁性分离，移除上清；随后加入300ul漂洗/结合缓冲液洗涤3次，磁分离后移除上清，加入100ml超纯水获得磁珠-多价适体复合物。
三、磁珠-多价适体捕获流感病毒实验
利用上述方法制备的磁珠-多价适体捕获禽流感病毒。配置漂洗/结合缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH7.5)。取50μL漂洗/结合缓冲液与H1N1病毒颗粒50μL在离心管中混匀，于室温放置30min,再加入制备的磁珠-多价适体500μL,涡旋混匀使其充分混匀30min，磁性分离，移除上清。随后加入漂洗/结合缓冲液500μL洗涤3次，磁分离后移除上清。获得磁珠-多价适体-流感病毒复合物。
四、流感病毒结合适体2(序列SEQ ID NO：2)
利用上述方法获得磁珠-多价适体-流感病毒复合物，另取100μL漂洗/结合缓冲液置于1.5mL洁净离心管中，加入3μL(100umol/L)核酸适体2，室温混合放置10min，将该适体溶液加入装有磁珠-多价适体-流感病毒复合物的离心管中，在离心管中混匀，于室温放置30min，磁性分离，移除上清。随后加入低盐缓冲液(0.1M NaCl，20mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH7.5)500μL洗涤3次，磁分离后移除上清，加入20ul超纯水获得磁珠-多价适体1-流感病毒-适体2复合物。
五、锁式法制备环DNA
将SEQ ID NO：3序列，SEQ ID NO：4序列和水混匀后在液面表面加入10μL矿物油(防污染，防蒸发)，95℃变性5min，室温放置15min，冷却后加入T4连接酶buffer、T4连接酶等置于恒温水浴锅。根据产品说明书，T4连接酶体系于25℃反应2h。酶连结束后，在酶连反应管里直接加入EXO I外切酶0.8μL，EXO III外切酶0.4μL，于37℃反应1h后85℃灭活20min。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证酶连结果。
六、DA-RCA法对H1N1流感病毒检测研究
在上述体系中，加入10umol/L引物2(序列SEQ ID NO：5)0.5μL于PCR管中，随后加入dNTPs(10mM)4μL，MgSO4(100mM)1.5μL，10×Thermopol buffer 2.5μL，与8U Bst DNA聚合酶大片段0.5μL，羟基萘酚蓝(HNB)指示剂(4.5mM)1μL，ddH20补齐至50μL，65℃反应1h，观察颜色反应。采用羟基萘酚蓝(HNB)指示剂方法，由于Mg2+与HNB结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色，随着DP-RCA反应的进行，Mg2+与DP-RCA反应析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了Mg2+使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色，可以直接观测DP-RCA反应结果，其中阳性结果为天蓝色，阴性结果为紫罗兰色，从而肉眼快速检测出H1N1病毒(如图5所示)。若通过电泳检测，则反应结束后取5μL的RCA产物于3％的琼脂糖凝胶上进行电泳，阳性扩增产物在凝胶上呈现典型的梯形条带，阴性显示无条带(如图4A,4B所示)。
对12份H1N1甲型流感病毒临床样本和1份乙型流感病毒临床样本进行了检测。检测结果统计表明H1N1检测试剂盒准确性：47/52＝90.4％。
表1 12份H1N1甲型流感病毒临床样本和1份乙型流感病毒临床样本检测结果。
表1 12份H1N1甲型流感病毒临床样本和1份乙型流感病毒临床样本检测结果表
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<120> 一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒及检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtacttccat tcgacctctg taacagccac gaaaacccta tatcaaaagt g 51
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaccagttg tctttcggtc tctaccccag cccgt 35
<210> 3
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctacgaacc actgaacacg ggctggggta gagaccgaaa gacaactggt ccagccgttc 60
ctcacaccag acagtggggg aaagc 85
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact 30
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggtctatct ggaagaat 18
Claims (9)
1.一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，包括如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5所示的序列，其中：
SEQ ID NO：1：gtacttccattcgacctctgtaacagccacgaaaaccctatatcaaaagtg；
SEQ ID No：2：ggaccagttgtctttcggtctctaccccagcccgt
SEQ ID No：3：cctacgaaccactgaacacgggctggggtagagaccgaaaga
ca actggtccagccgttcctcacaccagacagtgggggaaagc
SEQ ID No：4：gttcagtggttcgtagggctttcccccact
SEQ ID No：5：tggtctatctggaagaat
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为H1N1流感病毒的核酸适体序列1和2，SEQ ID NO：3为成环反应序列，SEQ ID NO：4为环互补序列，SEQ ID NO：5为RCA反应体系引物2。
2.根据权利要求1所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：H1N1流感病毒的核酸适体：序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2分别采用H1N1完整病毒颗粒和B型流感病毒颗粒进行点杂交实验进行验证。
3.根据权利要求1所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述H1N1流感病毒的核酸适体1，采用磁珠-多价适体1结合的方式。
4.根据权利要求3所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述磁珠-多价适体1捕获H1N1流感病毒的缓冲液组分为0.5M NaCl、20mM Tris-HCL和1mM EDTA，缓冲液pH＝7.5。
5.根据权利要求3所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述磁珠-多价适体1-H1N1流感病毒复合物结合适体2的缓冲液组分为0.5MNaCl、20mM Tris-HCL和1mM EDTA，缓冲液pH＝7.5。
6.一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的反应体系，所述反应体系每50μL中包括：
7.一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒检测方法，包括如下步骤：
1)提供SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5所示的序列；其中SEQ ID NO：1为H1N1流感病毒的核酸适体1序列,SEQ ID NO：2为H1N1流感病毒的核酸适体2序列，SEQ ID NO：3为成环反应序列，SEQ ID NO：4为环互补序列，SEQ ID NO：5为RCA反应体系引物2。
2)制备磁珠-多价适体1复合物；
3)磁珠-多价适体1捕获流感病毒；
3)被捕获的流感病毒结合适体2
4)锁式法制备DNA环；
5)DA-RCA法对H1N1流感病毒检测。
8.如权利要求7所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒检测方法，其特征在于：
步骤4)中，所述成环反应步骤为加入0.5μL SEQ ID NO：3和0.5μL SEQ ID NO：4所示的序列，缓冲液组分为20mM Tris-HCL和1mM EDTA，缓冲液pH＝7.5，15μL ddH2O于PCR管中；95℃反应4～6min,37℃放置12～18min,加入3μL 10×T4 DNA ligase buffer、1μL 400U/μLT4 DNA连接酶,置25℃反应2h；反应结束后加入EXO I外切酶0.8μL，EXO III外切酶0.4μL，于37℃反应1h后85℃灭活20min，备用。
9.如权利要求7所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒检测方法，其特征在于：步骤5)中，在步骤4)反应之后，加入10umol/L引物2即序列SEQ ID No：5，0.5μL于PCR管中，随后加入dNTPs(10mM)4μL，MgSO4(100mM)1.5μL，10×Thermopol buffer 2.5μL，与8U Bst DNA聚合酶大片段0.5μL，羟基萘酚蓝(HNB)指示剂(4.5mM)1μL，ddH20补齐至50μL，65℃反应1h，观察颜色反应。
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