CN109666765A

CN109666765A - 一种快速诊断h1n1流感病毒的试剂盒

Info

Publication number: CN109666765A
Application number: CN201910074363.2A
Authority: CN
Inventors: 李招发; 汪赛; 熊莹喆; 杨会勇; 林俊生
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2019-04-23

Abstract

本发明公开了一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，包括7条核苷酸序列和RCA反应体系。本试剂盒结合适体‑配体富集样品中的H1N1流感病毒，特异性成环，双引物RCA反应扩增，RCA产物的羟基萘酚蓝可视化显色，能够实现现场快速检测H1N1流感病毒。

Description

一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒。

背景技术

H1N1是一种RNA病毒，属于正黏液病毒科，是甲型流感病毒的一种，也是人类最常感染的流感病毒之一。H1N1"是病毒名称的缩写，其"H"指的是血球凝集素(Hemagglutinin)、而"N"指的是神经氨酸酶(Neuraminidase)，两种都是病毒上的抗原名称。其意思是:具有"血球凝集素(Hemagglutinin)第1型、神经氨酸酶(Neuraminidase)第1型"的病毒。它的宿主是犬科动物、鸟类和一些哺乳动物。经过鸟类和犬科动物为主的哺乳动物的传播和变异，一些H1N1的种类可以在人类间传播，包括1918年的流感大爆发，另一些可在雀鸟和猪之间传播。2009年3至4月，墨西哥爆发H1N1疫潮，导致过百人感染。疫情其后传播到全世界。2009年4月30日凌晨，世界卫生组织把全球流感大流行警告级别提高到第5级。2013年12月H1N1扩散到美国十个州，引起四名儿童死亡，上万成年人入院治疗。2017年8月16日，H1N1甲型流感疫情在缅甸暴发，已确认687人感染、26人死亡。由于H1N1可直接感染人，导致人类患病或死亡，其公共卫生意义日渐显著。加强对H1N1的研究，在减少世界经济损失和提高人类卫生健康方面，都具有深远的意义。

当前流感病毒检测有两个趋势，一是向高通量、高精度检测方向发展，这类技术获得信息准确而且信息量大，主要技术有RT-real-time PCR、RT-LAMP和微流控、生物芯片及传感器等，多适合大的研究单位和疾病控制部门使用；另外一个趋势是向小型化便携式、适用于现场检测的快速手提箱式检测平台发展，操作简单、获取的信息精准可靠，有效减少病毒扩散和医护人员二次感染的几率。目前无论RT-PCR技术还是手提箱式检测装置，都存在高成本、操作复杂和需要受过专业技术培训人员等要求，RT-PCR等方法还需要样本经过采集、集中、提纯等前处理程序，增加了病毒扩散的几率，延长了样本获得结果的时间，很多时候都需要拖延一天以上。现存方法在应对当前流感集中暴发与长期散发交替、大量隐性感染与少数发病感染并存、易感人群普通市民和偏远乡村居民并存的疫情现状时有些滞后和困难，往往造成疫情拖延和治疗延误甚至引燃疫情爆发。

核酸适体(aptamer，也译为核酸识体、核酸适配子)是指从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲合性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。核酸适体技术是由美国L.Gold和J.Szostak(2009年诺贝尔生理学或医学奖获得者)两个研究组最早提出的。1990年Gold研究组运用体外筛选技术获得能与T4 DNA聚合酶特异性结合的RNA，并把该技术定义为SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，配体指数富集系统进化)。核酸适体可以是RNA，单链DNA或者双链DNA。适体与靶分子的结合和抗原---抗体作用相似，适体具有明显优于抗体的许多特性。具有靶分子范围广、与配体作用亲和力高特异性强、高度稳定性、安全经济、制备方法简单、无免疫原性等优点。经过十几年的发展，适体技术开始广泛应用于分子识别、实验、实验诊断、疾病治疗和药物研究。

滚环核酸扩增(rolling circle amolification,RCA)是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA的方式而提出的，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列(与环状DNA完全互补)的线状单链。线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为10⁵。指数RCA原理与线性RCA相同，采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来在很短的时间内(1h)，产物呈指数递增。指数RCA可用于非环状DNA的扩增，增倍数能达10⁷。

目前常用的核酸染料，如EB、Gold、Green I、Green II和Safe等。但这些染料检测RCA产物不能直接观测，都需要借助设备检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，解决了上述背景技术中的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，包括如SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示的序列，其中SEQ ID No.1为H1N1流感病毒的核酸适体序列，SEQ ID No.2至SEQ ID No.5为成环反应序列，SEQ ID No.6至SEQ IDNo.7为RCA反应体系引物。

在本发明一较佳实施例中，所述RCA反应体系每50μL中包括：

在本发明一较佳实施例中，所述H1N1流感病毒的核酸适体序列SEQ ID No.1分别采用H1N1完整病毒颗粒和B型流感病毒颗粒进行点杂交实验进行验证。

在本发明一较佳实施例中，所述H1N1流感病毒的核酸适体采用磁珠-多价适体。

在本发明一较佳实施例中，所述磁珠-多价适体捕获H1N1流感病毒的缓冲液组分为0.5M NaCl、20mM Tris-HCL和1mM EDTA，缓冲液pH＝7.5。

在本发明一较佳实施例中，所述成环反应步骤为在H1N1病毒颗粒的裂解液中加入SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的序列，及15μL ddH₂O于PCR管中，95℃反应4～6min,37℃放置12～18min,加入3μL 10×T4 DNA ligase buffer、1μL 400U/μL T4 DNA连接酶,置25℃反应1h，反应结束后加入0.5μL 5U/μL核糖核酸酶A，37℃反应8～12mim。

在本发明一较佳实施例中，所述裂解液包括磁分离的H1N1病毒样品和10mM Tris-HCl、2.5mg/mL蛋白酶K，裂解液pH＝7.5。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.本方案采用适体富集禽流感病毒，高温裂解，四通成环，双引物滚环扩增技术(DP-RCA)，使滚环扩增由线性扩增变为指数扩增，增加了检测灵敏度。本项目以DP-RCA为基础，开发一种成本低、检测快速、组成和操作简单的H1N1病毒检测装置及相应方法与试剂，低成本和简便的操作可使流感病毒检测门槛降低，疑似病人也可在第一时间进行自我检测，从而及早进行治疗，以免拖延病情及造成疫情大面积扩散。

2.本方案采用羟基萘酚蓝指示剂方法，羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，显色原理是由于Mg²⁺与HNB结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色，随着RCA反应的进行，Mg²⁺与RCA反应析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了Mg²⁺使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色，以此判断RCA反应结果，可以直接观测RCA应结果，使检测可视化。

附图说明

图1为点杂交实验结果图。

图2为四链成环原理图。

图3为DP-RCA原理图。

图4为DP-RCA实验结果核酸电泳图。

具体实施方式

本实施例的一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，包括如SEQ ID No.1至SEQ IDNo.7所示的序列，还包括RCA反应体系：

SEQ ID No.1：

5′-GTACTTCCATTCGACCTCTGTAACAGCCACGAAAACCCTATATCAAAAGTG-3′

SEQ ID No.2：

5′-CGCAAUGGAAAGAAAUGCUGGAUCUGGUAUUAUCAUUUCAGAUA-3′

SEQ ID No.3：

5′-UAAUCUGCUAUGACCUGGUGUUGACGGACAGAAUAGUAAUCCCG-3′

SEQ ID No.4：

5′-CATTTCTTTCCATTGCGTCCTTCATAGATTCTGTCCGTCAACAC-3′

SEQ ID No.5：

5′-CAGGTCATAGCAGATTAAGAACAGGTAGATAATACCAGATCCAG-3′

SEQ ID No.6：5′-GTATCGTCTAATCCTTGTCC-3′

SEQ ID No.7：5′-CCTGCGTTACCTTTCTTTAC-3′

其中SEQ ID No.1为H1N1流感病毒的核酸适体序列，SEQ ID No.2至SEQ ID No.5为成环反应序列，SEQ ID No.6至SEQ ID No.7为RCA反应体系引物。

本实施例的RCA反应体系每50μL中包括：

本试剂盒检测H1N1流感病毒经如下步骤：

一、适体筛选实验

人工合成多条适体。

点杂交实验：将不同浓度梯度(700ng/μL,140ng/μL,35ng/μL)的H1N1完整病毒颗粒和B型流感病毒颗粒(均已灭活)分别取1μL点样在NC膜上，将膜放入微孔板室温放置2h，用BW缓冲液(20mM Tris-HCl,ph7.5,0.5M NaCl,2mM MgCl₂,5mM KCl,1mM CaCl₂,0.02％NP40)500μL洗涤1次，然后用3％BSA溶液进行封闭，室温1h，用BW缓冲液500μL洗涤1次，在不同微孔板中加入不同适体0.5uM，适体采用95℃加热10min，立即置于冰上10min进行处理，摇床孵育2h，用BW缓冲液500μL洗涤3次，加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(streptavidin-horseradish peroxidase(HRP)conjugate)1μL，用去离子水稀释至1mL，摇床孵育1h，加入ECL显色液，AB液按1：1混合，显示结果图(如图1所示)。

获得适体(序列SEQ ID No.1)能够很好的结合灭活H1N1完整病毒颗粒。

二、磁珠-多价适体制备实验

取2mg羧基化磁珠，置于1.5mL洁净离心管中；用MEST溶液(0.01M，0.05％Tween-20，pH 6.0)500μL洗涤2次，磁分离后移除上清；用4℃储存的0.01M MES(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，pH＝6.0)溶液配制5mg/mL的EDC；加入新配制的200μL EDC(5mg/mL)溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀使磁珠充分悬浮30min(或置于恒温振摇箱中37℃，150rpm活化30min)。离心管置于磁性分离架上，移除上清，加入500μL MEST溶液到离心管中，磁性分离，移除上清，重复3次。加入50-500ug核酸适体AP1，到上述离心管中，用MES调节总体积至500μL，轻柔混匀磁珠和核酸；37℃偶联至少3小时，用用旋转混合仪进行颠倒混匀。

三、磁珠-多价适体捕获禽流感病毒实验

利用上述方法制备的磁珠-多价适体捕获禽流感病毒。配置漂洗/结合缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH7.5)。取50μL漂洗/结合缓冲液与H1N1病毒颗粒50μL在离心管中混匀，于室温放置30min,再加入制备的磁珠-多价适体500μL,涡旋混匀使其充分混匀30min，磁性分离，移除上清。随后加入漂洗/结合缓冲液500μL洗涤3次，磁分离后移除上清。

四、H1N1病毒颗粒裂解

在磁分离的H1N1病毒样品中，加入10μL(10mM Tris-HCl，2.5mg/ml蛋白酶K，pH7.5)裂解液，放入56℃保温0.5小时。95℃保温10分钟。

五、四链成环实验

以H1N1的H1及N1特征序列SEQ ID No.2,SEQ ID No.3设计两条成环序列SEQ IDNo.4,SEQ ID No.5两端分别与其互补成环。

在上述裂解液分别加入0.5μL 10umol二条成环序列SEQ ID No.4及SEQ ID No.5，15μL ddH₂O于PCR管中，95℃反应5min,37℃放置15min,3μL 10×T4 DNA ligase buffer(50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，1mM ATP，10mM DTT，pH7.5)，加入1μL 400U/μL T4 DNA连接酶,置25℃反应1h。反应结束后加入0.5μL 5U/μL核糖核酸酶A，37℃反应10mim。

六、双引物RCA和可视化检测实验

在上述体系中，加入10umol/L引物1(序列SEQ ID No.6)和引物2(序列SEQ IDNo.7)各0.5μL于PCR管中，随后加入dNTPs(10mM)4μL，MgSO4(100mM)1.5μL，10×Thermopolbuffer 2.5μL，与8U Bst DNA聚合酶大片段0.5μL，羟基萘酚蓝(HNB)指示剂(4.5mM)1μL，ddH₂0补齐至50μL，65℃反应1h，观察颜色反应。采用羟基萘酚蓝(HNB)指示剂方法，由于Mg²⁺与HNB结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色，随着DP-RCA反应的进行，Mg²⁺与DP-RCA反应析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了Mg²⁺使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色，可以直接观测DP-RCA反应结果，其中阳性结果为天蓝色，阴性结果为紫罗兰色，从而肉眼快速检测出H1N1病毒。若通过电泳检测，则反应结束后取5μL的RCA产物于3％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果如图4，阳性扩增产物在凝胶上呈现典型的梯形条带，阴性显示无条带。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 华侨大学

<120> 一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtacttccat tcgacctctg taacagccac gaaaacccta tatcaaaagt g 51

<210> 2

<211> 44

<212> RNA

<213> 流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)

<400> 2

cgcaauggaa agaaaugcug gaucugguau uaucauuuca gaua 44

<210> 3

<211> 44

<212> RNA

<213> 流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)

<400> 3

uaaucugcua ugaccuggug uugacggaca gaauaguaau cccg 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catttctttc cattgcgtcc ttcatagatt ctgtccgtca acac 44

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caggtcatag cagattaaga acaggtagat aataccagat ccag 44

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtatcgtcta atccttgtcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctgcgttac ctttctttac 20

Claims

1.一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：包括如SEQ ID No.1至SEQ IDNo.7所示的序列，其中SEQ ID No.1为H1N1流感病毒的核酸适体序列，SEQ ID No.2至SEQID No.5为成环反应序列，SEQ ID No.6至SEQ ID No.7为RCA反应体系引物。

2.根据权利要求1所述的一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述RCA反应体系每50μL中包括：

3.根据权利要求1所述的一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述RCA反应体系每50μL中包括：

4.根据权利要求1所述的一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述H1N1流感病毒的核酸适体序列SEQ ID No.1分别采用H1N1完整病毒颗粒和B型流感病毒颗粒进行点杂交实验进行验证。

5.根据权利要求1所述的一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述H1N1流感病毒的核酸适体采用磁珠-多价适体。

6.根据权利要求5所述的一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述磁珠-多价适体捕获H1N1流感病毒的缓冲液组分为0.5M NaCl、20mM Tris-HCL和1mM EDTA，缓冲液pH＝7.5。

7.根据权利要求1所述的一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述成环反应步骤为在H1N1病毒颗粒的裂解液中加入SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的序列，及15μL ddH₂O于PCR管中，95℃反应4～6min,37℃放置12～18min,加入3μL 10×T4 DNA ligasebuffer、1μL 400U/μL T4 DNA连接酶,置25℃反应1h，反应结束后加入0.5μL 5U/μL核糖核酸酶A，37℃反应8～12mim。

8.根据权利要求7所述的一种快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述裂解液包括磁分离的H1N1病毒样品和10mM Tris-HCl、2.5mg/mL蛋白酶K，裂解液pH＝7.5。