CN110982939A - 一种检测甲型流感病毒的试剂盒 - Google Patents

一种检测甲型流感病毒的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于Sanger一代测序技术的甲型流感病毒（Influenza A virus,FluA）检测试剂盒，包括特异性扩增引物、测序引物、对照品、扩增试剂和扩增程序方法。本发明在检测甲型流感病毒方面有较高的准确性，同时可以对甲型流感病毒的具体亚型进行区分、确认，适合在临床甲型流感病毒检测中应用。

Description

一种检测甲型流感病毒的试剂盒
技术领域
本发明涉及医学和生物技术，具体涉及一种基于Sanger一代测序技术的甲型流感病毒检测试剂盒。
背景技术
流感病毒是有包膜的单股负链RNA病毒，属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），包括人流感病毒和动物流感病毒。根据核衣壳蛋白（NP）和基质蛋白（MP）不同，人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒（流感）的病原体。甲型流感病毒（Influenza Avirus, FluA）颗粒呈球状，表面有突起的糖蛋白，分别是血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和基质蛋白M，共有16种不同的血凝素H1～H16和9种不同的神经氨酸酶N1～N9。根据其表面的HA和NA的抗原性特点，将甲型流感病毒进一步分为许多亚型。
由于甲型流感病毒抗原性易发生变异，容易形成新的亚型，引起世界性大流行。20世纪，人类共发生了4次流感大流行：1918年的西班牙流感（H1N1）、1957年的亚洲流感（H2N2）、1968年的香港流感（H3N2）和1977年的俄国流感（H1N1），这4次流感都给人类带来灾难性的后果。2009年出现了H1N1猪 源 流 感 病 毒
(SOIV)，造成了二十一世纪第一次人类流感普遍流行，到2010年4月，仅美国就有43百万到89百万人感染此病毒。
甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8，其中H1、H5、H7是高致病性亚型。
流感病毒的流行病学特征为：人群普遍易感，潜伏期长短取决于侵入的病毒量和机体的免疫状态，一般为1～4天。起病后患者有畏寒、头痛、发热、浑身酸痛、乏力、鼻塞、流涕、咽痛及咳嗽等症状。在症状出现的1～2天内，随分泌物排出的病毒量较多，以后则迅速减少。无并发症患者发病后第3～4天就开始恢复；如有并发症，则恢复期延长。
流感的特点是发病率高，病死率低，死亡通常由并发细菌性感染所致。常见的细菌有肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌等。并发症多见于婴幼儿、老人和慢性病（心血管疾病、慢性气管炎和糖尿病等）患者。
目前流感病毒的临床或实验室诊断方法，主要包括病毒分离培养、血清学诊断和快速诊断方法。
发明内容
本发明提供一种相对准确的检测甲型流感病毒核酸的试剂盒，用二轮PCR扩增程序的方法，解决一般测序方法灵敏度低的不足，适合在临床甲型流感病毒检测中应用。
本发明的技术方案如下：
一种基于Sanger一代测序技术的甲型流感病毒检测试剂盒，包括特异性扩增引物对、测序引物对、对照品、扩增试剂和扩增程序方法。
所述的特异性扩增引物对是指针对甲型流感病毒特征片段SEQ ID NO:1进行扩增的引物对，包含具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示序列的引物对。
所述的测序引物对用于测定甲型流感病毒特征片段SEQ ID NO:1的碱基序列，其包含具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列的引物对。
本发明的特异性扩增引物对和测序引物对可用常规的合成技术进行合成。
本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于上述的2对引物。
本发明的试剂盒还包括对照品、扩增试剂和扩增程序方法。
试剂盒的每一人份用法配方包括：6μL PCR缓冲液、1.2μL 酶混合液、2μL特异性扩增引物。
本发明的试剂盒中包含的试剂所适用的样品份数可以为一人份、二人份、四人份、八人份、更多人份等等，本发明不对此进行限定，本领域技术人员可根据需求自行选择和设置。
本发明提供的检测方法，包含以下步骤：
（1）核酸提取：使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂（核酸提取及纯化试剂（通用型））对待测样本进行核酸提取。
（2）扩增反应：以上述提取的待测物核酸为模板，在特异性扩增引物的介导下进行扩增。每一人份用法配方为：6μL PCR缓冲液、1.2μL 酶混合液、2μL特异性扩增引物。
（3）一代测序反应，获得测序结果。
（4）结果分析：在NCBI上进行比对、分析，确认病原体具体型别。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明提供了一种基于Sanger一代测序技术的甲型流感病毒检测试剂盒，有较高的准确性。
（2）用二轮PCR扩增的方法，高于一般测序方法的灵敏度。
（3）完成一次测序反应进行结果分析后，可直接对甲型流感病毒亚型进行鉴定、区分。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。下列实施例中试剂盒的常规组分均为市售获得。
实施例1
用于特异性扩增甲型流感病毒特征片段SEQ ID NO:1的引物设计
利用NCBI数据库，搜索不同亚型的甲型流感病毒特征片段，并进行序列保守性分析比对，针对各亚型均较保守的序列区段进行引物设计。
引物设计一般采用Primer premier 5.0软件，按照引物设计的一般原则等参数要求进行设计分析，从得到的结果中选择二级结构较少的引物作为试剂盒的特异性扩增引物。引物设计的一般原则包括：长度17~25 bp；GC含量30%~80%；退火温度（Tm值）为50~60℃；避免产生稳定的引物二聚体及发夹结构。
实施例2
甲型流感病毒检测试剂盒的制备
（1）扩增试剂
包括PCR缓冲液，含有60mM Tris·HCl(pH8.8)、30mM KCl、30mM MgSO4、3M Betaine、4.5mM dNTP each；酶混合液，包含逆转录酶3U/ul、Taq DNA聚合酶1U/ul。
（2）引物
含有一对甲型流感病毒扩增上下游引物（SEQ ID NO:2和3）、一对甲型流感病毒测序上下游引物（SEQ ID NO:4和5）。
（3）阴阳性对照
阳性对照有1个，为甲型流感病毒阳性的拭子样本，浓度为3.0E+05copies/mL；阴性对照有1个，为甲型流感病毒阴性的拭子样本。
实施例3
用本发明的试剂盒检测并鉴定购买的ATCC甲型流感病毒标准菌株（H1N1，ATCCVR1736）
本发明的试剂盒在-20℃温度下保存。
（1）甲型流感病毒基因组核酸提取
使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂（核酸提取及纯化试剂（通用型））对待测样本进行核酸提取。
（2）扩增反应
以上述提取的待测物核酸为模板，在特异性扩增引物的介导下进行扩增。每一人份用法配方为：6μL PCR缓冲液、1.2μL 酶混合液、2μL特异性扩增引物、5μL核酸提取液。将上述反应混合液的反应管置于普通PCR仪上，按以下两轮PCR方法进行扩增：（1）第一轮PCR扩增条件为：50℃反应25分钟，循环1次；95℃ 5分钟，循环1次；95℃ 45秒→56℃ 45秒→72℃36秒，循环45次；72℃ 7分钟，循环1次；（2）第二轮PCR扩增条件为：95℃ 5分钟，循环1次；5℃ 45秒→56℃ 45秒→72℃ 36秒，循环30次；72℃ 7分钟，循环1次。
（3）一代测序反应，获得测序结果。
将上述PCR产物和对应测序引物寄送至专业测序服务公司，进行一代测序反应，获得测序结果。
（4）结果分析
将获得的测序结果，上传到NCBI，进行比对、分析，确认病原体具体型别为甲型流感病毒H1N1亚型菌株。
实施例4
用本发明的试剂盒检测临床甲型流感病毒样本具体亚型。
本发明在临床医院收集了2例甲型流感病毒临床样本，经其它甲型流感病毒（H1N1）检测试剂盒未检出阳性，用本试剂盒对该样本进行检测。
（1）临床样本甲型流感病毒基因组核酸提取
使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂（核酸提取及纯化试剂（通用型））对待测样本进行核酸提取。
（2）扩增反应
以上述提取的待测物核酸为模板，在特异性扩增引物的介导下进行扩增。每一人份用法配方为：6μL PCR缓冲液、1.2μL 酶混合液、2μL特异性扩增引物、5μL核酸提取液。将上述反应混合液的反应管置于普通PCR仪上，按以下两轮PCR方法进行扩增：（1）第一轮PCR扩增条件为：50℃反应25分钟，循环1次；95℃ 5分钟，循环1次；95℃ 45秒→56℃ 45秒→72℃36秒，循环45次；72℃ 7分钟，循环1次；（2）第二轮PCR扩增条件为：95℃ 5分钟，循环1次；5℃ 45秒→56℃ 45秒→72℃ 36秒，循环30次；72℃ 7分钟，循环1次。
（3）一代测序反应，获得测序结果。
将上述PCR产物和对应测序引物寄送至专业测序服务公司，进行一代测序反应，获得测序结果。
（4）结果分析
将获得的测序结果，上传到NCBI，进行比对、分析，确认病原体具体型别为甲型流感病毒H3N2亚型菌株。
以上实施例中所使用的试剂盒为多人份的，试剂盒内所含试剂具体适用的样本的份数，可由本领域技术人员根据需求自行选择和设定，本发明不对此进行限定。
在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
序列表
<110> 上海星耀医学科技发展有限公司
<120> 一种检测甲型流感病毒的试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 391
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 1
taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcgtcccgtc aggccccctc aaagccgaga 60
tcgcgcagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatctcgag gctctcatgg 120
aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggattttg gggtttgtgt 180
tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc caaaacgccc 240
taaatgggaa tggagaccca aacaacatgg acagggcagt caaactgtac agaaagttga 300
aaagagagat aacattccat ggggctaaag aagttgcact cagctactca accggtgcac 360
ttgccagttg tatgggtctc atatacaaca g 391
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taaccgaggt cgaaacgta 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgttgtata tgagacccat aca 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaggtcgaaa cgtactca 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatatgagac ccatacagt 19

Claims (4)

1.一种基于Sanger一代测序技术的甲型流感病毒检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括特异性扩增引物对、测序引物对、对照品、扩增试剂和扩增程序方法；所述的特异性扩增引物对是针对甲型流感病毒特征片段SEQ ID NO:1进行扩增的引物对，具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3序列；所述的测序引物对用于测定甲型流感病毒特征片段SEQ ID NO:1的碱基序列，具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5序列。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的扩增试剂包括PCR缓冲液、酶混合液和特异性扩增引物。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的每一人份用法配方包括：6μLPCR缓冲液、1.2μL 酶混合液、2μL特异性扩增引物。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序方法为两轮PCR扩增方法，包含以下步骤：（1）第一轮PCR扩增条件为：50℃反应25分钟，循环1次；95℃ 5分钟，循环1次；95℃ 45秒→56℃ 45秒→72℃ 36秒，循环45次；72℃ 7分钟，循环1次；（2）第二轮PCR扩增条件为：95℃ 5分钟，循环1次；5℃ 45秒→56℃ 45秒→72℃ 36秒，循环30次；72℃7分钟，循环1次。
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CN111910016A (zh) * 2020-04-27 2020-11-10 江苏派森杰生物科技有限公司 通用型甲型流感病毒核酸检测的引物和探针以及试剂盒

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