CN114250281A - 一种核酸代谢酶活性检测方法 - Google Patents
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- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
Abstract
本发明涉及一种核酸代谢酶活性检测方法，其步骤如下：S1，人工合成一条单链核酸片段和一段从3′端互补的引物，通过退火反应形成模板；S2，将模板、反应缓冲液、荧光修饰的核苷酸衍生物或荧光修饰的核苷酸衍生物类似物、待测定的核酸代谢酶进行反应并纯化得到初次纯化产物；S3，将初次纯化产物、Taq反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶进行反应并纯化得到二次纯化产物；S4，对二次纯化产物用毛细管电泳仪分析；S5，制作标准曲线，将S4中结果代入标准曲线得出检测结果。该发明操作快捷，活性检测结果准确、灵敏度高，实现了高通量的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种核酸代谢酶活性检测方法。
背景技术
核酸代谢，包括DNA和RNA合成和降解，是所有核酸研究和相关生命科学领域研究的基础。参与DNA复制和修复的核酸代谢酶的标准活性检测方法是通过检测测量DNA或RNA的产物合成或降解放射性或荧光标记的核酸底物。例如，用同位素标记的方法，结合DNA的荧光染料法(PicoGreen或EvaGreen)均广泛应用于DNA定量，进而应用于核酸代谢酶的活性检测方法中，测定核酸代谢酶的合成活性或者降解活性。为了更好地研究反应中间体或副产物，更全面的捕获反应途径的具体步骤和细节，全面了解核酸酶的活性，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)被广泛的应用于分析底物，中间体的大小分布等实验研究中，对核酸酶进行进一步的表征和标准测定，但聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析方法相对于前述的放射性或荧光标记法，存在着实验时间长效率低通量小等缺点，限制了核酸酶分析的范围。
发明内容
针对现有的不足，本发明提供一种核酸代谢酶活性检测方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种核酸代谢酶活性检测方法，其特征在于:其步骤如下：
S1，人工合成一条单链核酸片段和一段从3′端互补的引物，通过退火反应形成核酸引物复合物，称之为模板；
S2，将模板、反应缓冲液、荧光修饰的核苷酸衍生物或荧光修饰的核苷酸衍生物类似物、待测定的核酸代谢酶加入同一个PCR管中，在PCR反应仪中反应得到初始产物，并对初始产物进行kit纯化得到初次纯化产物；
S3，将初次纯化产物、Taq反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶加入另一个PCR管中，在PCR反应仪中反应得到二次反应产物，并对二次反应产物进行kit纯化得到二次纯化产物；
S4，对二次纯化产物用毛细管电泳仪分析，收集分离图谱并计算出单位时间内碱基的延伸效率；
S5，制作标准曲线，将S4中并分析计算延伸效率代入标准曲线得出待测定核酸代谢酶的活性；其中步骤S2和S3中的PCR反应条件是温度为10℃—90℃，时间为10s—60min。
作为优选，所述模板为一条单链核酸片段，其片段长度为50-150个bp。
作为优选，所述引物长度为15-25个bp。
作为优选，所述步骤S2的反应条件是温度为45-65℃，时间为1min。
作为优选，所述步骤S3的反应条件是温度为72℃，时间为20min。
作为优选，所述标准曲线的制备方法为，在步骤S2中将待测定的核酸代谢酶改为按照活性梯度稀释成不同浓度的已知活性的核酸代谢酶，然后依次经过S2、S3、S4步骤得出各种梯度单位活性初始斜率，并制出标准曲线。
作为优选，所述步骤S2中，待测定的核酸代谢酶按照浓度梯度稀释成不同浓度的核酸代谢酶，然后每一个浓度的核酸代谢酶均依次经过S2、S3、S4步骤得出各浓度单位活性初始斜率，并代入标准曲线中，得出相对活性单位。
作为优选，所述毛细管电泳仪分析依据荧光染料的种类、分离图谱的峰型大小来计算的。
作为优选，所述核酸代谢酶包括高通量的核酸代谢酶。
作为优选，所述荧光修饰的核苷酸衍生物和荧光修饰的核苷酸衍生物类似物是在3′羟基处保护基团修饰且碱基上携带荧光标识基团的核苷酸衍生物。
本发明的有益效果在于：该发明操作快捷，活性检测结果准确，灵敏度高，实现了高通量的检测，可实现精确到单个核苷酸的表征精度，在高通量毛细管电泳中，荧光标记的核酸底物，中间体和产物由大小和电荷分开，并/或通过激光激发检测，检测样品的进样，凝胶电泳和数据采集过程全部是自动化的，可实现单次实验在一小时内检测96个样品，可适用于全部模板带有或不带有荧光染料的检测，也解决了现有技术中操作步骤多、多种荧光标记设计复杂，同位素标记引起的环境污染、受仪器分辨率限制等问题。
附图说明
图1是本发明的原理示意图；
图2是本发明实施例1得到的电泳图谱；
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明中，“延伸”意味着通过与带荧光修饰的核苷酸衍生物的5′磷酸基团形成磷酸二酯键，将所述修饰的核苷酸连接到第二个核苷酸的游离3′羟基，所述修饰的核苷酸连接到的第二个核苷酸通常出现在多核苷酸链的3′末端处。“延伸”可以是在低温下和/或在更宽的温度范围内，可以是在短时间内和/或更宽的时间范围内，与带荧光修饰的核苷酸衍生物或类似物的反应能力。在本发明中，“延伸”可以是在使用较低浓度的带荧光修饰核苷酸或类似物作为底物时的反应能力。
在本发明中，“荧光修饰的核苷酸衍生物衍生物”和“荧光修饰的核苷酸衍生物类似物”是指已在3′糖羟基处保护基团修饰且碱基上携带荧光标识基团的核苷酸衍生物。这类核苷酸衍生物或类似物可以充当链式反应终止物，使得在添加dNTP后链式反应无法继续进行。这些术语可互换使用。
在本发明中，模板优选一条长度为99个bp的单链核酸片段，引物长度优选16-19个bp；所采用的毛细管电泳仪是任何的能够进行核算毛细管电泳分析的仪器，比如QSEP，CE等；在反应时稀释合成的引物和模板所用的稀释液可以是灭菌纯化水或是1XTE(pH8.0)；发明原理如图1中所示，实施例1
单碱基延伸效率测定(毛细管电泳测定法)，
引物和模板的设计合成：
单链核酸序列(5′-3′)：
GACCGCGACTCCAGCCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGA AACTGAATTCAAAGTCGTCGCGGGATCA(SEQ ID NO.1)
引物序列(5′-3′)：
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TGATCCCGCGACGACTTTG(SEQ ID NO.4)
TGATCCCGCGACGACTTTGAATT(SEQ ID NO.5)
用来检测不同核酸代谢酶与不同荧光修饰的核苷酸衍生物衍生物或类似物的反应能力，将通用模板和四种不同荧光标记的核苷酸或类似物之一加入反应体系内，用于延伸反应，通过向反应体系中添加待检测活性的核酸代谢酶来启动反应，在1min内，使用毛细管电泳分析仪对在通用模板3′末端处的一个带有荧光修饰的碱基延伸情况进行分析，通过电泳图的荧光峰面积比例进行计算，得出单位时间内的延伸效率，如图2中所示，然后通过改变加入的核酸代谢酶的浓度梯度，得到在不同浓度下，核酸代谢酶的延伸效率，代入标准曲线中即可计算得出该核酸代谢酶的活性。
实施例2
单碱基延伸错误测定(毛细管电泳测定法)
引物和模板的设计合成：
单链核酸序列(5′-3′)：
GACCGCGACTCCAGCCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGA AACTGAATTCAAAGTCGTCGCGGGATCA(SEQ ID NO.1)
引物序列(5′-3′)：
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用来检测不同核酸代谢酶与不同荧光修饰的核苷酸衍生物的反应能力，将通用模板和四种不同荧光标记的核苷酸之一(不与模板匹配的错误核苷酸)加入反应体系内，用于延伸反应，通过向反应体系中添加待检测活性的核酸代谢酶来启动反应，在1min内，使用毛细管电泳分析仪对在通用模板3′末端处的一个带有荧光修饰的碱基延伸情况进行分析，通过电泳图的荧光峰面积比例进行计算，得出单位时间内掺入错误核苷酸的延伸效率。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
<110> 深圳铭毅智造科技有限公司
<120> 一种核酸代谢酶活性检测方法
<160> 5
<210> 1
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<210> 3
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<212> DNA
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<210> 4
<211> 19
<212> DNA
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<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
TGATCCCGCG ACGACTTTGA ATT
Claims (10)
1.一种核酸代谢酶活性检测方法，其特征在于:其步骤如下：
S1，人工合成一条单链核酸片段和一段从3′端互补的引物，通过退火反应形成核酸引物复合物，称之为模板；
S2，将模板、反应缓冲液、荧光修饰的核苷酸衍生物或荧光修饰的核苷酸衍生物类似物、待测定的核酸代谢酶加入同一个PCR管中，在PCR反应仪中反应得到初始产物，并对初始产物进行kit纯化得到初次纯化产物；
S3，将初次纯化产物、Taq反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶加入另一个PCR管中，在PCR反应仪中反应得到二次反应产物，并对二次反应产物进行kit纯化得到二次纯化产物；
S4，对二次纯化产物用毛细管电泳仪分析，收集分离图谱并计算出单位时间内碱基的延伸效率；
S5，制作标准曲线，将S4中并分析计算延伸效率代入标准曲线得出待测定核酸代谢酶的活性；其中步骤S2和S3中的PCR反应条件是温度为10℃—90℃，时间为10s—60min。
2.根据权利要求1所述核酸代谢酶活性检测方法，其特征在于:所述模板为一条单链核酸片段，其片段长度为50-150个bp。
3.根据权利要求1所述核酸代谢酶活性检测方法，其特征在于:所述引物长度为15-25个bp。
4.根据权利要求1所述核酸代谢酶活性检测方法，其特征在于:所述步骤S2的反应条件是温度为45-65℃，时间为1min。
5.根据权利要求1所述核酸代谢酶活性检测方法，其特征在于:所述步骤S3的反应条件是温度为72℃，时间为20min。
6.根据权利要求1所述核酸代谢酶活性检测方法，其特征在于:所述标准曲线的制备方法为，在步骤S2中将待测定的核酸代谢酶改为按照活性梯度稀释成不同浓度的已知活性的核酸代谢酶，然后依次经过S2、S3、S4步骤得出各种梯度单位活性初始斜率，并制出标准曲线。
7.根据权利要求1所述核酸代谢酶活性检测方法，其特征在于:所述步骤S2中，待测定的核酸代谢酶按照浓度梯度稀释成不同浓度的核酸代谢酶，然后每一个浓度的核酸代谢酶均依次经过S2、S3、S4步骤得出各浓度单位活性初始斜率，并代入标准曲线中，得出相对活性单位。
8.根据权利要求1所述核酸代谢酶活性检测方法,其特征在于:所述毛细管电泳仪分析依据荧光染料的种类、分离图谱的峰型大小来计算的。
9.根据权利要求1所述核酸代谢酶活性检测方法,其特征在于:所述核酸代谢酶包括高通量的核酸代谢酶。
10.根据权利要求1所述核酸代谢酶活性检测方法，其特征在于:所述荧光修饰的核苷酸衍生物和荧光修饰的核苷酸衍生物类似物是在3′羟基处保护基团修饰且碱基上携带荧光标识基团的核苷酸衍生物。
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