CN104379763A - 使用包含硫代磷酸酯基的寡核苷酸的聚合酶链式反应检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在试验系统中检测核酸的方法和试剂盒。在一个方面，本发明涉及在存在缺少3’-5’核酸酶活性的聚合酶时减少引物延伸反应中非特异性扩增和引物二聚体形成的方法。在另一个方面，本发明涉及检测在存在缺少3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶时产生的引物延伸产物的方法，包括提供能够彼此杂交以形成荧光淬灭对的具有不同Tm的第一和第二单标记的寡核苷酸。在本发明的方法中，一条或更多条引物或寡核苷酸含有至少一个硫代磷酸酯基。

Description

使用包含硫代磷酸酯基的寡核苷酸的聚合酶链式反应检测系统

技术领域

本发明涉及一种在试验系统中用于检测核酸的方法和试剂盒。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种快速且指数式扩增目标核酸序列的有力方法。PCR促进了基因表征和分子克隆技术的发展，包括PCR扩增的DNA的直接测序、等位基因变异的测定以及传染性和遗传性疾病病症的检测。通过下述重复循环进行PCR：将含有目标序列的DNA模板热变性、将反向引物与互补DNA链退火和使用DNA聚合酶将退火的引物延伸。多重PCR循环导致由侧翼扩增引物圈定的核苷酸序列指数式扩增。在PCR方案中加入热稳定的DNA聚合酶避免了重复添加酶的需要并使退火和引物延伸的温度提高，该温度提高了引物：模板相关的特异性。因此，Taq DNA聚合酶可用于增加PCR的特异性和简便性。

在许多基于PCR的反应中，采用信号生成系统，如用于检测扩增产物的产生。在基于PCR的反应中所使用的信号生成系统之一是荧光能量转移(FRET)系统，其中核酸检测物(detector)包括荧光供体和受体基团。FRET标记系统具有许多优于其它标记系统的优势，包括进行匀相试验的能力，其中并不需要结合的与未结合的标记的核酸检测器的分离步骤。许多现有技术的主要问题与双标记的荧光寡核苷酸的合成相关。欧洲专利申请EP1726664公开了一种解决这一问题的检测系统，其使用具有不同解链温度(Tm)的单标记的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在理想溶液(free solution)中彼此杂交以形成荧光猝灭对，其通过将互补序列引入到一个或两个序列上来生成可测量的信号，序列之一具有低于PCR过程的退火温度(Ta)的Tm。

在使用标记的核酸检测物的检测系统中，高保真扩增是非常关键的。由于PCR过程和Taq DNA聚合酶的性质，此类方法可能遇到所需要聚合反应之外的其它副反应。例如，当在环境温度下进行反应时，PCR可能遇到非特异性扩增。在亚PCR温度下，Taq聚合酶保留部分活性，因此可以延伸非互补退火的引物，从而导致形成非预期产物。然后新合成的区域将作为进一步引物延伸和非预期扩增产物合成的模板。然而，如果在聚合起始之前将反应加热至约50℃或更高的温度，这将增加引物退火的严谨性并避免或降低非预期PCR产物的合成。

引物二聚体也是一种常见的影响PCR的副反应。发生引物二聚体的积聚是因为引物相互之间的杂交和延伸。形成引物二聚体导致试剂损耗并因此整体降低PCR效率。

热启动PCR是减少非特异性扩增的一种方法，并因此限制了引物二聚体的形成，且已开发了多种不同的方法来实现这一目的，参见例如Moretti,T.等人，Enhancement of PCR amplification yield and specificity using AmpliTaqGold DNA polymerase.BioTechniques 25,716–22(1998)和Hot Start PCR withheat-activatable primers:a novel approach for improved PCR performanceNucleic Acids Res(2008)36(20):e131。然而，此类技术仅部分缓解了此类问题。由于序列中的任何错误、并非基于聚合的反应或引物错配(如引物二聚化)都可能导致产生弱信号或错误信号，尤其是在等位基因特异性PCR中，因此期望进一步改善这些弱的或不正确的信号。

硫代磷酸酯(或S-oligos)是正常DNA的变体，其中非桥键氧原子中的一个被硫取代。磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷酸间键的实例如下所示：

在寡核苷酸的磷酸酯骨架上，硫代磷酸酯键用硫原子取代了非桥键氧原子，使得核苷酸间键抵抗核酸酶的降解。可以将硫代磷酸酯引入到寡核苷酸的5'-或3'-末端以抑制核酸外切酶的降解。在反义寡核苷酸中，还将硫代磷酸酯引入到内部以限制核酸内切酶的攻击。含有硫代磷酸酯的寡核苷酸的合成描述于如Verma S.和Eckstein,F.(1998).MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES:Synthesis and Strategy for Users.Annu.Rev.Biochem.1998.67:99-134以及Curr Protoc Nucleic Acid Chem.2009Mar；第4章：4.34单元.DNAoligonucleotides containing stereodefined phosphorothioate linkages in selectedpositions.Nawrot B,Rebowska B。

如上所述，核苷酸间键的硫化降低了包括5'→3'和3'→5'DNA POL 1核酸外切酶、核酸酶S1和P1、核糖核酸酶、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶的内切和外切核酸酶2的作用。已证明了与使用外切核酸酶+DNA聚合酶的高保真PCR组合的S-oligo的核酸酶耐受属性，参见如Nucl.Acids Res.(2003)31(3):e7.doi:10.1093/nar/gng007。Taq DNA聚合酶不具有3'→5'核酸外切酶(Kenneth R.Tindall,Thomas A.Kunkel,Biochemistry,1988,27(16),p6008-6013)。也报道了在存在校正(proof-reading)聚合酶的情况下，通过硫代磷酸酯修饰增强单核苷酸多态性的区别。硫代磷酸酯化增加了特异性，减少了引物二聚体相互作用的发生率，但据报道，需要3'核酸酶功能来改善PCR，且已证明，在与等位基因特异性PCR组合时，当与Taq DNA聚合酶组合时，使用S-oligos未提供益处，参见如Zhang,J.和Li,K.(2003)Single-BaseDiscrimination Mediated by Proofreading 3'Phosphorothioate-Modified Primers.Molecular Biotechnology 25,223-227。

需要在引物延伸产物的检测中(如在均质PCR试验中)使用的易于合成的、低成本的和可靠的特异性检测系统，其解决了现有PCR检测系统所遇到的问题。与传统的科学知识相反，本发明是基于下述发现：S-oligos可成功地用于核酸检测试验系统并使其获得改善。

发明内容

本发明提供了一种在模板依赖的引物延伸反应中减少非特异性扩增和/或引物二聚体形成的方法，其包括在缺少3'→5'核酸酶活性的聚合酶存在下进行引物延伸反应，其中一个或多个引物包含至少一个硫代磷酸酯基团。

本发明还提供了在此类方法中所使用的试剂盒和组合物。

附图说明

图1是实施本发明方法的直接检测DNA序列的简单反应方案。

图2是实施本发明方法的间接(实时)检测DNA序列的简单反应方案。

图3是在SNP基因分型中实施本发明方法的间接(终点)检测DNA序列的简单反应方案。

图4示出了利用下述实施例1所述的试验所产生的数据。

图5示出了如下述实施例2所述的在使用含有硫代磷酸酯基团的寡核苷酸序列和不含有硫代磷酸酯的寡核苷酸的试验系统中所产生的数据的比较。

具体实施方式

本发明提供了一种在模板依赖的引物延伸反应中减少非特异性扩增和/或引物二聚体形成的方法，其包括在缺少3'→5'核酸酶活性的聚合酶存在下进行引物延伸反应，其中一个或多个引物包含至少一个硫代磷酸酯基团。

本发明的方法优选包括使用至少两个在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对并通过引入互补于一个或两个序列的互补序列而产生可测量的信号的单标记的寡核苷酸序列，其中用至少一个硫代磷酸酯基团修饰一个或多个引物。

在本发明的一个实施方式中，两个单标记的寡核苷酸序列具有不同的Tm。当寡核苷酸序列具有不同的Tm时，则序列之一可以具有等于或低于引物延伸反应(如PCR过程)的Ta的Tm。其它序列可以具有合适的不低于Ta但优选高于Ta且更优选实质上高于Ta的Tm。在一个实施方式中，猝灭剂寡核苷酸具有高于Ta的Tm。

通常用于确定序列Tm的公式是Tm＝4(G+C)+2(A+T)，因此可以通过使用相对于报告基因对的其它序列而言更短的长度和/或减少的(G+C)/(A+T)比来获得(基本上)一个低Tm的序列。

在本发明的一些方面中，优选单标记的寡核苷酸序列之一比其它序列长多于10个碱基，优选长至少15个碱基。

本发明还提供了用于在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下检测所产生的引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供至少两个在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对并通过引入互补于一个或两个序列的互补序列而产生可测量的信号的单标记的寡核苷酸序列(如具有不同的Tm)，其中寡核苷酸序列中的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团；

b)提供至少一个引物并起始引物延伸反应，从而产生互补于单标记的寡核苷酸序列中的至少一个的序列；和

c)测量所产生的可检测的信号。

在本发明的进一步的优选的方面中，方法包括检测在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下用PCR所产生的引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供第一单标记的寡核苷酸序列和至少一种第二单标记的寡核苷酸序列(如其中第一和第二寡核苷酸序列具有不同的Tm)和至少一种引物，其中第一和第二寡核苷酸序列在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对(如其中第一和第二寡核苷酸序列中的一个具有等于或低于PCR过程的Ta的Tm)，其中所述寡核苷酸序列中的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团，所述至少一种引物包含至少一个未标记的加尾的引物，所述未标记的加尾的引物具有尾部区域，所述尾部区域包含互补于第二单标记的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列，第一单标记的寡核苷酸是引物，一旦在PCR过程中产生了互补于第一单标记的寡核苷酸序列的序列，该引物将起始DNA合成，因此所述第二单标记的寡核苷酸序列不再能够与所述第一单标记的寡核苷酸序列杂交，从而产生可测量的信号；

b)起始引物延伸反应，从而产生单标记的寡核苷酸序列的至少一个的互补序列；和

c)测量所产生的可检测的信号。

在本发明的进一步的优选的方面中，方法包括检测在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下用PCR所产生的引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供第一单标记的寡核苷酸序列和至少一种第二单标记的寡核苷酸序列(如其中第一和第二寡核苷酸序列具有不同的Tm)和至少一种引物，其中第一和第二寡核苷酸序列在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对(如其中第一和第二寡核苷酸序列中的一个具有等于或低于PCR过程的Ta的Tm)，其中所述寡核苷酸序列中的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团，所述至少一种引物包含至少一个未标记的加尾的引物，所述未标记的加尾的引物具有尾部区域，所述尾部区域包含与第一单标记的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列相同或实质上同源的寡核苷酸序列，第一单标记的寡核苷酸是引物，一旦在PCR过程中产生了互补于第一单标记的寡核苷酸序列的序列，该引物将起始DNA合成，因此所述第二单标记的寡核苷酸序列不再能够与所述第一单标记的寡核苷酸序列杂交，从而产生可测量的信号；

b)起始引物延伸反应，从而产生单标记的寡核苷酸序列中的至少一个的互补序列；和

c)测量所产生的可检测的信号。

本发明还提供了一种用于检测在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下产生的引物延伸产物的试剂盒，其包含至少两个在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对并通过引入互补于一个或两个序列的互补序列而产生可测量的信号的单标记的寡核苷酸序列(如具有不同Tm)，其中所述寡核苷酸序列中的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团。

根据本发明的试剂盒还可以包含缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶和/或其它适用于引物延伸反应的组分如镁盐、dNTP等。

在本发明中，在所述方法中所使用的全部或至少一个引物可含有硫代磷酸酯修饰的碱基。在任何给定引物中由硫代磷酸酯取代的磷酸二酯键的数目的范围可以从1个至全部的磷酸二酯键被取代为硫代磷酸酯。引物可含有在5'和/或3'末端的硫代磷酸酯，然而优选的是，作为此类末端修饰的替代或添加，引物内至少一个碱基是硫代磷酸酯。例如10-90％、20-80％、30-70％或40-60％的碱基可以是硫代磷酸酯。在一个实施方式中，硫代磷酸酯修饰的碱基被至少一个(例如1至3个)未修饰的(磷酸二酯)碱基来隔离。在一个优选的实施方式中，引物内可替代的碱基是硫代磷酸酯。

本发明的一个优选实施方式是荧光团标记的引物的可替代的碱基上的硫代磷酸酯修饰(在本文中称作半-S修饰)与未修饰的猝灭剂组合的用途，因为它们给出了PCR的特别增强的差异和信号强度。

可用于本发明的具有不同硫代磷酸酯修饰的实例在下述用荧光团或猝灭剂标记的引物中进行了阐释，其中*代表硫代磷酸酯：

未修饰的FAM Fluor:    5’-FAM-GCGATTAGCCGTTAGGATGA 3’

3’S FAM Fluor:       5’-FAM-GCGATTAGCCGTTAGGATG*A 3’

半S FAM Fluor:              5’-FAM-G*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*A 3’

完全S FAM Fluor:            5’-FAM-G*C*G*A*T*T*A*G*C*C*G*T*T*AG*G*A*T*G*A 3’

未修饰的HEX Fluor:          5’-HEX-GTCGGTGAACAGGTTAGAGA 3’

3’S HEX Fluor:             5’-HEX-GTCGGTGAACAGGTTAGAG*A3’

半S HEX Fluor:              5’-HEX-G*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*A 3’

完全S HEX Fluor:            5’-HEX-G*T*C*G*G*T*G*A*A*C*A*G*G*T*T*A*G*A*G*A 3’

标准FAM猝灭剂:              5’CCTAACGGCTAATCGC-3'Dabsyl

半S FAM猝灭剂V1.0:          5’C*CT*AA*CG*GC*TA*AT*CG*C-3'Dabsyl

半S FAM猝灭剂V2.0:          5’CC*TA*AC*GG*CT*AA*TC*GC-3'Dabsyl

完全S FAM猝灭剂:            5’C*C*T*A*A*C*G*G*C*T*A*A*T*C*G*C-3'Dabsyl

标准HEX猝灭剂:              5’AACCTGTTCACCGAC-3’Dabsyl

半S HEX猝灭剂V1.0:          5’AA*CC*TG*TT*CA*CC*GA*C-3’Dabsyl

半S HEX猝灭剂V2.0:          5’A*AC*CT*GT*TC*AC*CG*AC-3’Dabsyl

完全S HEX猝灭剂:            5’A*A*C*C*T*G*T*T*C*A*C*C*G*A*C-3’Dabsyl

在本发明中所使用的含有至少一个硫代磷酸酯基团的寡核苷酸序列可通过本领域技术人员公知的方法来合成。

本发明发现了在各种不同应用中的用途，并尤其适用于基于PCR的反应，包括SNP检测应用、等位基因变异检测应用、实时PCR等。

如上所述，本发明提供了在模板依赖的引物延伸反应中减少非特异性扩增和/或引物二聚体形成的方法，以及检测引物延伸反应混合物中引物延伸产物的产生(如测定是否在引物延伸反应中产生了引物延伸产物)的方法。引物延伸产物是指从模板依赖的引物延伸反应中产生的核酸分子。模板依赖的引物延伸反应是那些聚合酶延伸杂交到模板核酸分子的核酸引物分子的反应，其中添加到引物核酸分子末端的碱基序列通过模板链上的碱基序列来测定。模板依赖的引物延伸反应包括扩增和非扩增的引物延伸反应。在本发明的一些实施方式中，检测到引物延伸产物的产生的模板依赖的引物延伸反应是扩增反应，如聚合酶链式反应(PCR)。

在本发明中，检测到引物延伸产物的产生的模板依赖的引物延伸反应是含有用硫代磷酸酯基团修饰的引物与缺少3'→5'核酸酶活性的聚合酶组合的反应。

在实施本发明的方法时，第一步骤是产生引物延伸混合物，例如包括对于引物延伸反应发生所必要的所有成分的组合物。例如引物延伸混合物可以包括至少两个单标记的寡核苷酸序列(如具有不同Tm)，其在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对，并且通过引入互补序列到一个或两个序列上来产生可测量的信号，其中例如序列之一具有等于或低于Ta的Tm，(“FET盒引物对”)，其中寡核苷酸序列中的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团。

当合适的荧光能量供体和能量受体部分相互极为接近时，则产生FET。由供体所吸收的激发能量被转移到受体，然后受体可以通过荧光发射(如果是荧光团)或通过非荧光方法(如果是猝灭剂)进一步消散此能量。供体-受体对包括具有重叠光谱的两个荧光团，其中供体发射与受体吸收重叠，使得从激发的荧光团到对的另一个成员存在能量转移。并且激发的荧光团实际发出荧光不是必要的，只要使激发的荧光团能够有效地吸收激发能量并将其有效地转移到发射荧光团就足以了。因此，在本发明的方法中所使用的FET盒是核酸检测物，其在分离的寡核苷酸上包括具有荧光团结构域和具有受体结构域的第二寡核苷酸，其中荧光团结构域中放置了荧光能量供体(即供体))，并且在第二寡核苷酸中放置了荧光能量受体(即受体))。如上所述，供体寡核苷酸包含供体荧光团。供体荧光团可位于核酸检测物上的任何位置，但通常存在于检测物的5'末端。

受体结构域包括荧光能量受体。受体可位于受体结构域上的任何位置，但通常存在于核酸检测物的3'末端。

除了荧光团和受体结构域，FET盒受体寡核苷酸还包括靶核酸结合结构域，其与反应中包括的未标记的加尾的引物所产生的靶核酸序列结合，如在严谨杂交条件下(如下所定义)。

根据寡核苷酸和试验自身的性质，靶结合结构域可以杂交至引物延伸产物的区域上。例如，当试验是SNP基因分型试验，如其中使用通用盒报告系统时，靶结合结构域在严谨条件下杂交至引物延伸产物的靶结合位点。用于FET寡核苷酸对的荧光团可以进行选择，以来自相似的化学家族或不同的化学家族，如花青染料(cyanine dyes)、呫吨(xanthenes)等。感兴趣的荧光团包括但不限于荧光染料(如5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、2',4',1,4,-四氯荧光素(TET)、2',4',5',7',1,4-六氯荧光素(HEX)和2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE))、花青染料如Cy5、丹酰衍生物、罗丹明染料(如四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)和四丙醇-6-羧基罗丹明(ROX))、DABSYL、DABCYL、花青如Cy3、蒽醌、硝基噻唑和硝基咪唑化合物等。令人感兴趣的荧光团还描述于国际专利申请WO 01/42505和WO 01/86001中。

由于在本发明方法的初始步骤中所产生的引物延伸反应混合物是缺少3'→5'核酸外切酶的引物延伸反应混合物，其进一步包括不具有3'→5'核酸外切酶活性的酶。在许多实施方式中，所使用的聚合酶组合包括至少一个家族A，其中术语“家族A”和“家族B”对应于Braithwaite & Ito,Nucleic AcidsRes.(1993)21:787-802中所报道的分类法。令人感兴趣的家族A聚合酶包括：栖热水生菌聚合酶，其包括天然存在的聚合酶(Taq)及其衍生物和同系物如Klentaq(如在Proc.Natl.Acad.Sci USA(1994)91:2216-2220中所述的)；嗜热栖热菌聚合酶，其包括天然存在的聚合酶(Tth)及其衍生物和同系物等。用于本发明的聚合酶可以以纯化或未纯化的形式使用。

在方法的第一步骤中所产生的反应混合物的另一组分是模板核酸。用作模板的核酸可以是单链或双链的核酸，其中核酸通常是脱氧核糖核酸(DNA)。模板核酸的长度可以短至50bp，但通常为至少约100bp长，且更通常为至少约150bp长，且可长至10,000bp或更长，如50,000bp或更长，其包括基因组DNA提取物或其消化物等。核酸在溶液中可以是游离的、在一个或两个末端旁侧具有非模板核酸的、存在于载体如质粒中的等，其唯一的标准就是该核酸可以参与到引物延伸反应中。模板核酸可以以纯化形式存在，或以具有其它非模板核酸的复杂混合物的形式存在，如以细胞DNA制剂形式等。

模板核酸可以来源于各种不同的来源，这取决于进行PCR的应用，其中此类来源包括含有核酸的生物体，即，病毒；原核生物，如细菌、古细菌和蓝藻；以及真核生物，如原生生物界的成员如鞭毛虫、变形虫及其亲缘动物(relative)、变形虫寄生虫、纤毛虫等；真菌界的成员如粘菌、脱细胞粘菌、细胞粘菌、水霉菌、真霉菌、结合真菌(conjugating fungi)、子囊菌、珊瑚菌、半知菌类等；植物如藻类植物、藓类植物、苔类植物、金鱼藻、石松、木贼、蕨类植物、裸子植物和开花植物、单子叶植物和双子叶植物；和动物，动物包括海绵、腔肠动物门的成员如水母、珊瑚等、栉水母、蠕虫、轮虫、线虫、环节动物、软体动物、节肢动物、棘皮动物、橡子蠕虫和脊椎动物，脊椎动物包括爬行类、鱼类、鸟类、蛇和哺乳动物如啮齿类动物、灵长类动物(包括人类)等。所使用的模板核酸可以直接来源于其天然存在的来源和/或用各种不同的方式预处理过的，如本领域已知的。在一些实施方式中，模板核酸可以来自合成来源。

在本发明方法的第一步骤中所产生的反应混合物中的下一个组分是在引物延伸反应中所使用的引物，如PCR引物(如在几何倍数扩增中所使用的正向和反向引物或者在线性扩增中所使用的单个引物)。各个引物延伸反应混合物包含至少两个引物(在线性扩增的情况下)且通常是三个引物且更通常是五或七个引物(在SNP基因分型反应的情况下)。引物延伸反应混合物包括至少一个荧光供体标记的引物和互补受体、猝灭剂标记的引物(在线性扩增的情况下)，其中一个或两个引物包含至少一个硫代磷酸酯基团。

更通常地，在指数扩增的情况下，引物延伸混合物包括至少一个荧光供体标记的引物和互补受体、猝灭剂标记的引物和反向未标记的引物，其中引物中的一个或任意个包含至少一个硫代磷酸酯基团。最通常地，在使用通用报告系统的指数扩增的情况下，引物延伸混合物包括至少一个荧光受体标记的引物和互补供体、猝灭剂标记的引物、反向未标记的引物和加尾的正向引物，其中引物中的一个或任意个包含至少一个硫代磷酸酯修饰。与模板核酸(为了方便起见，在下文中称为模板DNA)接触的寡核苷酸引物具有足够的长度以使其在退火条件下杂交至互补的模板DNA上(在下文中进行更详细地描述)，但其长度不足以在聚合条件下与模板DNA形成稳定的杂交体。引物的长度可以为至少10bp，如至少15bp或16bp。引物的长度可以为30bp或更长，例如引物的长度可以为18至60bp，如约20至35bp。模板DNA可以与单个引物或一组两个引物(正向和反向引物)接触，这取决于引物延伸、模板DNA的线性或指数扩增是否是所需的。当使用单个引物时，通常引物互补于模板DNA的3'末端之一，且当使用两个引物时，通常引物互补于双链模板DNA的两个3'末端。

如本文所用，“核酸”是指DNA、RNA，单链或双链的，和其任何的化学修饰。修饰包括但不限于那些提供了其它的整合另外的电荷、极化性、氢键、静电相互作用和功能性至核酸上的化学基团。这样的修饰包括但不限于2'-位糖修饰、5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰、在环外胺上的修饰、4-硫代尿苷的取代、5-溴-尿嘧啶或5-碘-尿嘧啶的取代；主链修饰、甲基化、稀有碱基配对组合如异碱基、异胞苷和异胍等。修饰还可以包括3'和5'修饰如加帽。

如本文所用，“互补”是指含氮碱基配对，配对是由通过氢键连接至嘧啶的嘌呤所组成，其连接DNA的互补链或连接结合DNA和RNA的杂交分子的互补链。

如本文所用，“荧光基团”是指一种分子，当其被具有所选波长的光激发时，发射具有不同波长的光。荧光基团也可以被称为“荧光团”。

如本文所用，“荧光修饰基团”是指一种分子，其可以以任何方式改变来自荧光基团的荧光发射。通常，荧光修饰基团通过能量转移机制达到此目的。根据荧光修饰基团的特性，荧光发射可以发生各种改变，包括但不限于衰减、完全猝灭、增强、波长漂移、极性漂移、荧光寿命改变。荧光修饰基团的一个实例是猝灭基团。

如本文所用，“能量转移”是指一种过程，荧光修饰基团通过其改变荧光基团的荧光发射。如果荧光修饰基团是猝灭基团，则来自荧光基团的荧光发射被衰减(猝灭)。可以通过荧光共振能量转移或通过直接能量转移实现能量转移。在这两种情况下，精确的能量转移机制是不同的。应当理解的是，在本申请中涉及能量转移的任何参考均包括所有这些机理不同的现象。在本文中能量转移也被称为荧光能量转移或FET。

如本文所用，“能量转移对”是指参与能量转移的任何两个分子。通常，分子之一充当荧光基团，而另一个充当荧光修饰基团。本发明优选的能量转移对包含荧光基团和猝灭基团。在一些情况下，荧光基团和荧光修饰基团之间的区别可能会模糊。例如，在某些情况下，两个相邻的荧光团可通过直接能量转移猝灭对方的荧光发射。因此，在本申请中，对能量转移对的各个成员的特性没有限制。所需的仅是，如果个体成员之间的距离因一些临界量而改变时，能量转移对的光谱性质在一些可测量的方式上作整体变化。

所使用的“能量转移对”是指一组分子，它们形成了其中发生能量转移的单个复合体。此类复合体可包括如两个彼此相互不同的荧光基团和一个猝灭基团、两个猝灭基团和一个荧光基团或多个荧光基团和多个猝灭基团。当有多个荧光基团和/或多个猝灭基团时，各个组可以彼此不同。

如本文所用，“引物”是指当将其置于诱导互补于核酸链的引物延伸产物的合成的条件下(如在严谨杂交条件下)时，能够作为合成起始点的寡核苷酸。在本文中术语“寡核苷酸序列”可以用来指引物，反之亦然。

如本文所用，“猝灭基团”是指任何可以至少部分衰减由荧光基团所发射的光的荧光修饰基团。在本文中，称这种衰减为“猝灭”。因此，在猝灭基团存在的情况下，荧光基团的照明产生了发射信号，其比预期的强度低或甚至完全不存在。通过荧光基团和猝灭基团之间的能量转移发生猝灭。

如本文所用，“荧光共振能量转移”或“FRET”是指一种能量转移现象，其中由激发的荧光基团所发出的光至少部分被荧光修饰基团吸收。如果荧光修饰基团是猝灭基团，则该基团可以以具有不同波长的光的形式辐射所吸收的光或其可以以热量形式将其消散。FRET依赖于荧光基团的发射光谱和猝灭基团的吸收光谱之间的重叠。FRET还依赖于猝灭基团和荧光基团之间的距离。超过某一临界距离时，猝灭基团不能吸收荧光基团所发射的光或可以吸收但很差。

如本文所用，“加尾的引物”是指含有两个域的寡核苷酸，其中一个特异于感兴趣的靶模板DNA，而另外一个是独特序列，其作为每个不同的和独特的PCR反应中利用通用引物产生产物的模板。

如本文所用，“直接能量转移”是指一种能量转移机制，其中不发生荧光基团和荧光修饰基团之间的光子传递。不受单个机制的限制，据认为，在直接能量转移中荧光基团和荧光修饰基团相互干扰电子结构。如果荧光修饰基团是猝灭基团，其将使得猝灭基团阻止荧光基团发射光。

通常，通过直接能量转移的猝灭比通过FRET的猝灭更有效率。实际上，一些猝灭基团不能通过FRET猝灭特定的荧光基团(因为其与荧光基团没有所需的光谱重叠)，但可通过直接能量转移有效地进行猝灭。此外，一些荧光基团自身可以作为猝灭基团(如果其与其它荧光基团足够接近以造成直接能量转移的话)。例如，在这些条件下，两个相邻的荧光素基团可有效地猝灭彼此的荧光。由于这些原因，对用于本发明实践的荧光基团和猝灭基团的性质没有限制。

“严谨杂交条件”的实例是在50℃或更高以及6.0*SSC(900mM NaCl/90mM柠檬酸钠)的条件下杂交。严谨杂交条件的另一个实例是在42℃或更高的条件下在溶液：50％甲酰胺、6*SSC(900mM NaCl、90mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、10％硫酸葡聚糖和20ug/ml变性的剪切的鲑鱼精子DNA中孵育过夜。严谨杂交条件是至少与上述代表性条件同样严谨的杂交条件，其中考虑条件至少与上述具体的严谨条件至少约80％严谨，通常至少约90％严谨。其它的严谨杂交条件在本领域是已知的且也可以使用。

本文中相同的序列是指相同或相互实质上同源的序列。

本发明用途的实例包括以下内容：

直接检测PCR产物：

如图1所示，此实施方式利用寡核苷酸引物起始PCR过程。此常规引物针对于目标模板区域，从而驱动反应的特异性。此寡核苷酸在5'末端也被荧光标记了。存在着一些合适的荧光团，流行的选择是FAM(荧光素的衍生物)。最后，反应中包含反义于FAM标记的寡核苷酸的3'猝灭剂标记的寡核苷酸。存在着许多合适的标记，其中黑洞(Black Hole)猝灭剂系列标记是流行的选择。只要猝灭剂寡核苷酸的长度足够长以使Tm高于反应的Ta，就可以在任何实时PCR仪器(如ABI 7900Prism仪器)中对PCR过程的每个周期的产物生成进行评估。或者，反应可以采用具有低于反应的Ta的Tm的猝灭寡核苷酸。PCR后，将反应冷却至室温，产物可以在任何此类实时仪器和任意荧光板阅读器(如BMG Pherastar)中进行评估。

由于两个标记的寡核苷酸(猝灭剂和荧光团标记的)的互补性，其相互杂交。此杂交使猝灭剂标记非常接近于荧光团，从而使得来自FAM分子的在488nm处(FAM的最佳激发波长)激发的所有荧光信号猝灭。

反应中也包括常用反向引物以创建PCR引物对。然后起始PCR过程且开始产生PCR产物。

在PCR的前几个循环后，产生了荧光引物的反义序列。在此过程中，猝灭剂寡核苷酸不再结合；这产生了含有5'FAM分子的扩增子。一旦发生此种情况，猝灭寡核苷酸不再能够杂交FAM标记的寡核苷酸，因为PCR过程产生了双链的扩增子DNA。由于猝灭寡核苷酸不再能够杂交FAM寡核苷酸，信号将会产生，该信号正比于PCR产物的生成量。

间接(实时)检测PCR产物

如图2所示，本实施方式利用常用的寡核苷酸(引物)起始PCR过程。将未定向于目标扩增子区域的DNA序列加尾至此类常用引物上，借此该尾巴实质上是惰性的。此尾序列位于引物的5'部分。反应中还包含单个荧光标记的寡核苷酸，其与常用引物的尾序列区域相同或实质上同源。存在一些合适的荧光团，流行的选择是FAM(荧光素的衍生物)。最后，反应中包含反义于FAM标记的寡核苷酸的3'猝灭剂标记的寡核苷酸。存在着许多合适的标记，其中黑洞猝灭剂系列标记是流行的选择。

只要猝灭剂寡核苷酸的长度足够长以使Tm高于反应的Ta，就可以在任何实时PCR仪器(如ABI 7900Prism仪器)上对PCR过程的每个周期的产物生成进行评估。或者反应可以采用具有低于反应的Ta的Tm的猝灭寡核苷酸。PCR后，将反应冷却至室温，产物可以在任何此类实时仪器和任何荧光板阅读器(如BMG Pherastar)上进行评估。

由于两个标记的寡核苷酸的互补性，其相互杂交。此杂交使得猝灭剂非常接近于荧光团，从而使得来自FAM分子的在488nm处(FAM的最佳激发波长)被激发的所有荧光信号猝灭。然后起始PCR过程且开始产生PCR产物。在PCR的前几个循环后，产生了荧光引物的反义序列。然后荧光PCR引物能够在PCR过程中起始合成(并且确实如此)。这产生了含有5'FAM分子的扩增子。一旦发生此种情况，猝灭寡核苷酸不再能够与FAM标记的寡核苷酸杂交，因为PCR过程产生了双链扩增子DNA。由于猝灭寡核苷酸不再与FAM寡核苷酸杂交，信号将会产生，其正比于PCR产物的生成量。

加尾引物的尾部区域不必与单个荧光标记的寡核苷酸相同，只要产生的尾部区域的反义序列与单荧光标记的寡核苷酸杂交就行。

间接(终点)检测PCR产物-SNP基因分型：

如图3所示，本实施方式利用与图2所述相同的荧光团标记的和猝灭剂标记的寡核苷酸对。反应模式相同但有一些修改。

为了实现SNP基因分型，需要使用两个荧光标记的引物和相应的猝灭剂标记的寡核苷酸。再次用独特序列对各个引物进行加尾，在反应中此独特序列包括5'荧光标记的引物。两种合适的染料是FAM和HEX，它们相互是可光谱拆分的(spectrally-resolvable)。两个引物(没有加尾的部分；通常称为正向)针对目标DNA。在引物的此部分中，通常其仅在其3'末端碱基的单个核苷酸上有差异。各个引物针对目标DNA的多态碱基。进行PCR且仅仅当3'碱基完全匹配时，两个引物才起始合成。当发生错配时，不进行合成。

在反应过程中，依赖于基因型的特异的尾能起始合成(或在杂合子的情况下，两者均能起始合成)。这再次将引物的荧光尾部分引入到PCR产物中，从而阻碍了猝灭剂寡核苷酸的杂交。从而生成信号(这取决于哪个寡核苷酸起始合成)。然后在荧光板阅读器上读取反应的两个荧光团。然后将所获得的数据进行绘制并产生一个荧光团(在另一个荧光团之上)的集群图(cluster plot)。然后能基于集群图来确定所获得的基因型。

所述荧光团猝灭剂对寡核苷酸系统(fluorophore quencher pair oligosystem)的进一步应用是在使用Taq聚合酶的5'-3'核酸酶活性的PCR产物的同源检测中。

本发明可用于改善也发生在5'核酸酶试验(在不同情形下称为TaqMan)中的特异性和引物二聚体形成。

在本说明书和所附的权利要求书中，单数形式“一”、“一个”和“此”包括复数形式，除非上下文另有明确的说明。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与通常本发明所属技术领域中普通技术人员所理解的具有相同的含义。

当提供了数值范围时，应理解，此范围的上限和下限之间的每个中间值(到下限单位的十分之一，除非上下文另有明确的说明)以及此规定范围内的任何其它所述值或中间值都包含在本发明之内。较小范围中可独立地包括这些较小范围的上限和下限，并且也包含在本发明中，以所述范围中任何特定排除的极限为准(subject to any specifically excluded limit in the stated range)。当所述范围包括一个或两个极限时，本发明也包括排除了一个或两个这些被包括的极限的范围。

本文所提及的所有出版物都通过引用以最大可能程度并入本文，用以描述和公开出版物中所述的这些内容，其可与当前所描述的发明结合使用。

现在，本发明将通过参照下述实施例来进行描述，此实施例用于说明的目的，并不应当解释为对本发明范围的限制。

实施例1

缩写：

FAM：6-羧基荧光素

HEX：2',4',5',7',1,4-六氯荧光素

Dabcyl：非荧光暗猝灭剂(dark quencher)

设计七个寡核苷酸，其序列可以在下述中找到，其中*表示使用了S-修饰：

1)半S FAM荧光标记的寡核苷酸：

5’-FAM-G*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*A3’

2)半S HEX荧光标记的寡核苷酸：

5’-HEX-G*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*A3’

3)标准FAM猝灭剂：5’CCTAACGGCTAATCGC-3'Dabsyl

4)标准HEX猝灭剂：5’AACCTGTTCACCGAC-3’Dabsyl

5)等位基因特异性引物1：

5’GCGATTAGCCGTTAGGATGACTGAGTGCAGGTTCAGACGTCC3’

6)等位基因特异性引物2：

5’GTCGGTGAACAGGTTAGAGACTGAGTGCAGGTTCAGACGTCT3’

7)常规反向引物：5’CTCCCTTCCACCTCCGTACCAT3’

应当注意的是，在本实施例中，FAM标记的猝灭引物具有16mer的寡核苷酸序列，且比FAM标记的引物/报告探针短多于2个核苷酸，并且类似地，HEX标记的猝灭引物具有15mer的寡核苷酸序列，且比HEX标记的引物/报告探针短多于2个核苷酸。因此，较长的FAM标记的或HEX标记的引物/报告探针具有等于或高于PCR过程退火步骤的57℃Ta的Tm且在过程中与模板退火，而较短的猝灭引物等于或低于退火步骤的57℃Ta且不与模板退火。

在10mM Tris/HCl(pH 8.0)中将所有的寡核苷酸稀释至200μM的初始浓度。用此稀释液中进行所有的进一步的稀释。创建一个包含如下组分的试验混合物：

(1)0.16uM等位基因特异性引物1

(2)0.16uM等位基因特异性引物2

(3)0.41uM反向(常规)引物

(4)0.1uM FAM标记的寡核苷酸

(5)0.1uM HEX标记的寡核苷酸

(6)0.5uM猝灭剂标记的寡核苷酸(反义于寡核苷酸4)

(7)0.5uM猝灭剂标记的寡核苷酸(反义于寡核苷酸5)

(8)30-90单位/mL N-末端截短的Taq聚合酶

(9)10mM Tris/HCl pH 8.3

(10)10mM KCl

(11)1.8mM氯化镁

(12)165.2uM dNTP

(13)212.5nM 5-羧基-X-罗丹明，SE(5-ROX，SE)

向384孔微孔板的孔A1-B24分别加入10ng的获取自44个高加索人个体的基因组DNA。剩下的4个孔留空作为阴性对照孔。然后将板在50℃干燥1小时。

向干燥的板的孔A1-B24分别加入5μL的试验混合物，用融合传导二极管激光器板封口器(Fusion transmission diode laser plate sealer)(KBioscienceUK Ltd)将板密封。然后在Hydrocycler(KBioscience UK Ltd)中按下列条件下对板进行热循环：

94℃15分钟，热启动激活

94℃20秒

61-55℃60秒(每个循环降低0.8℃)

上述步骤进行10个循环

94℃20秒

55℃60秒

上述步骤进行26个循环

热循环之后，用BMG Pherastar板阅读器测定与各个孔相关的荧光。在如下波长组合下读取各个孔三次。

FAM激发：485nm，FAM发射：520nm

HEX激发：535nm，HEX发射：556nm

ROX激发：575nm，ROX发射：610nm

然后将所得到的数据绘制为：X轴上为FAM信号除以ROX，Y轴上为HEX信号除以ROX。

从图4所得到的散点图可以看出，可以清楚地看到三个清楚可辨的与相应的基因型相关的组，这证明了该检测技术的有效性。

实施例2

按照与实施例1相似的方案进行试验，以比较使用具有(ⅰ)非-S修饰的、(ⅱ)半-S修饰的(交替的(alternate)硫代磷酸酯的)和(iii)完全-S修饰的配置的荧光标记的寡核苷酸。所产生的数据示于图5。试验1所示的数据证明了使用配置(ⅰ)、(ⅱ)和(ⅲ)(上面的)；试验2的数据证明了配置(ⅰ)和(ⅱ)。在这两个试验中，猝灭剂寡核苷酸均没有硫代磷酸酯修饰。

所有的硫代磷酸酯修饰的荧光剂的变化形式都观察到了增强的特异性和减少的无模板对照扩增(见底部左手侧散点图)。对所有荧光标记的寡核苷酸的碱基使用硫代磷酸酯修饰对PCR速度和信号强度有一定影响。在荧光标记的引物的交替的碱基上使用硫代磷酸酯修饰(指半-S修饰)与未修饰的猝灭剂一起使用被认为是最适合于增强PCR的区分度和信号强度，因此，其代表了本发明的优选实施方式。

Claims (24)

1.一种减少模板依赖的引物延伸反应中的非特异性扩增和/或引物二聚体形成的方法，其包括在缺少3'→5'核酸酶活性的聚合酶存在下进行引物延伸反应，其中一个或多个引物包含至少一个硫代磷酸酯基团。

2.一种检测在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下产生的引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供至少两个在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对并通过引入互补于一个或两个序列的互补序列而产生可测量信号的单标记的寡核苷酸序列，其中寡核苷酸序列中的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团；

b)提供至少一个引物并起始引物延伸反应，从而产生互补于单标记的寡核苷酸序列中的至少一个的序列；和

c)测量所产生的可检测信号。

3.一种检测在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下产生的引物延伸产物的试剂盒，其包含至少两个在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对并通过引入互补于一个或两个序列的互补序列而产生可测量信号的单标记的寡核苷酸序列，其中寡核苷酸序列中的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团。

4.如权利要求2或3所述的方法或试剂盒，其中第一和第二寡核苷酸序列具有不同的Tm。

5.如权利要求4所述的方法或试剂盒，其中第一和第二寡核苷酸序列之一具有等于或低于引物延伸反应的Ta的Tm。

6.如权利要求4或5所述的方法或试剂盒，其中第一和第二寡核苷酸序列之一具有高于引物延伸反应的Ta的Tm。

7.一种检测在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下通过使用PCR产生的引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供第一单标记的寡核苷酸序列和至少一种第二单标记的寡核苷酸序列和至少一种引物，第一和第二寡核苷酸序列具有不同的Tm，其中第一和第二寡核苷酸序列在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对，第一和第二寡核苷酸序列之一具有等于或低于PCR过程的Ta的Tm，其中寡核苷酸序列的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团，所述至少一种引物包含至少一个未标记的加尾的引物，未标记的加尾的引物具有尾部区域，该尾部区域包含互补于第二单标记的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列，第一单标记的寡核苷酸序列是PCR过程中一旦产生互补于第一单标记的寡核苷酸序列的序列就可由其起始DNA合成的引物，因此第二单标记的寡核苷酸序列不再能够与第一单标记的寡核苷酸序列杂交，从而产生可测量的信号；

b)起始引物延伸反应，从而产生互补于单标记的寡核苷酸序列中的至少一个的互补序列；和

c)测量所产生的可检测信号。

8.如权利要求2至7任一项所述的方法或试剂盒，其中单标记的寡核苷酸之一比另一个短多于10个碱基。

9.如权利要求2至6任一项所述的方法或试剂盒，其中在每个循环实时地监测PCR过程，或者在通过降低反应温度以产生杂交而使反应未产生足够的产物来产生可测量信号的情况下，在多个循环后实时地监测PCR过程。

10.如权利要求7至9任一项所述的方法或试剂盒，其中所述其它的单标记的寡核苷酸具有高于Ta的Tm。

11.如权利要求2至10任一项所述的方法或试剂盒，其中所述单标记的寡核苷酸之一具有荧光猝灭对的猝灭剂标记。

12.如前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中含有硫代磷酸酯基团的引物内的碱基中的至少一个是硫代磷酸酯。

13.如前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中含有硫代磷酸酯基团的引物的碱基的20-80％是硫代磷酸酯。

14.如前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其用于基于等位基因特异性PCR的SNP基因分型。

15.如前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其用于通过5'核酸酶试验监控扩增子的产生。

16.如权利要求15所述的方法或试剂盒，其中所述5'核酸酶试验用于进行等位基因区分反应。

17.如前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中通过仅使用杂交来监测引物延伸产物。

18.如前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中通过仅在PCR后使用杂交来监测引物延伸产物。

19.如权利要求2至18任一项所述的方法或试剂盒，其中荧光猝灭寡核苷酸对的范围为6bp至100bp。

20.如权利要求19所述的方法或试剂盒，其中荧光猝灭寡核苷酸对的范围为6bp至100bp，但长度上不匹配。

21.如前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中荧光团标记的引物的碱基中的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团。

22.如前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中荧光猝灭寡核苷酸对被标记，对中的一个具有荧光团，而另一个具有非荧光猝灭分子。

23.如前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中修饰荧光猝灭寡核苷酸对以抵抗核酸酶降解。

24.如前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中荧光猝灭寡核苷酸对用对距离敏感的分子标记。