PT2828399T

PT2828399T - Sistema de deteção de reação em cadeia de polimerase utilizando oligonucleótidos compreendendo um grupo fosforotioato

Info

Publication number: PT2828399T
Application number: PT127109940T
Authority: PT
Inventors: Steven Robinson Philip; Holme John; Jain Nisha
Original assignee: Lgc Genomics Ltd
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2017-04-04
Also published as: CA2867916C; AU2012374566A1; LT2828399T; CY1118903T1; WO2013140107A1; NZ630915A; EP2828399B1; AU2012374566A2; JP6166342B2; RS55868B1; DK2828399T3; HUE032212T2; EP2828399A1; CN104379763B; SG11201502154UA; CA2867916A1; IN2014DN07878A; JP2015512251A; HRP20170569T1; ES2620750T3

Description

DESCRIÇÃO

SISTEMA DE DETEÇÃO DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE UTILIZANDO OLIGONUCLEÓTIDOS COMPREENDENDO UM GRUPO FOSFOROTIOATO

A presente invenção refere-se a métodos e kits para deteção de ácidos nucleicos num sistema de ensaio. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A reação em cadeia de polimerase (PCR) é um poderoso método para a amplificação rápida e exponencial de sequências de ácidos nucleicos alvo. A PCR facilitou o desenvolvimento de tecnologias de caracterização génica e clonagem molecular incluindo a sequenciação direto de ADN amplificado por PCR, a determinação de variação alélica, e a deteção de distúrbios infeciosos e doenças genéticas. A PCR é realizada através de ciclos repetidos de desnaturação por calor de um molde de ADN contendo a sequência alvo, hibridização de iniciadores opostos às cadeias de ADN complementares, e extensão dos iniciadores com uma ADN polimerase. Múltiplos ciclos de PCR resultam na extensão exponencial da sequência nucleotídica delineada pelos iniciadores de amplificação flanqueantes. A incorporação de uma ADN polimerase termicamente estável no protocolo de PCR obvia a necessidade de adições de enzimas repetidas e permite temperaturas de hibridização e extensão de iniciadores elevadas que potenciam a especificidade das associações iniciador:molde. A Taq ADN polimerase serve consequentemente para aumentar a especificidade e simplicidade da PCR.

Em várias reações baseadas em PCR, é empregue um sistema de produção de sinais, por exemplo para detetar a produção de produto amplificado. Um tipo de sistema de produção de sinais que é utilizado em reações baseadas em PCR é o sistema e transferência de energia de fluorescência (FRET), no qual um detetor de ácidos nucleicos inclui grupos doadores e aceitadores de fluorescência. Os sistemas de etiquetagem FRET incluem uma série de vantagens sobre outros sistemas de etiquetagem, incluindo a capacidade de realizar ensaios homogéneos nos quais não é requerida uma etapa de separação de detetor de ácidos nucleicos etiquetados ligado contra não ligado. Um problema principal com muitas técnicas da técnica anterior está relacionada com a síntese de oligonucleótidos fluorescentes etiquetados duplos. 0 Pedido de Patente Europeia EP1726664 divulga um sistema de deteção que supera este problema ao utilizar sequências de oligonucleótidos marcados individualmente com diferentes temperaturas de fusão (Tm) que hibrídam entre si em solução para formar um par extinto fluorescente, que após introdução de uma sequência complementar com uma ou ambas sequências gera um sinal mensurável, uma das sequências sendo de uma Tm que está por debaixo da temperatura de hibridização (Ta) do processo de PCR.

Nos sistemas de deteção utilizando um detetor de ácidos nucleicos etiquetados, é crítica amplificação de alta fidelidade. Devido à natureza do processo de PCR e Taq ADN polimerase tais métodos podem sofrer reações secundárias alternativas à reação de polimerização desejada. Por exemplo, a PCR pode sofrer de amplificação não específica quando a reação é montada à temperatura ambiente. A temperaturas sub-PCR, a Taq polimerase retém uma fração da sua atividade e pode como tal amplificar iniciadores que não estão hibridizados por complementaridade, levando à formação de produtos indesejáveis. A região recém-sintetizada atua então como um molde para extensão adicional de iniciadores e síntese de produtos de amplificação indesejáveis. Contudo, se a reação for aquecida até temperaturas de cerca de 50°C ou superiores antes do início da polimerização, a restringência da hibridização de iniciadores é aumentada, e a síntese de produtos de PCR indesejáveis é evitada ou reduzida.

Iniciadores diméricos é também uma reação secundária comum afetando a PCR, A acumulação de iniciadores diméricos ocorre devido à hibridização e extensão dos iniciadores entre si. A formação de iniciadores diméricos resulta no esgotamento dos reagentes e como tal redução global da eficácia da PCR. PCR com início a quente é um método para reduzir a amplificação não específica e como tal limitar a formação de iniciadores diméricos e foram desenvolvidas várias abordagens para alcançar isto, veja-se, por exemplo, Moretti, T. et ai. Enhancement of PCR amplification yield and specificity using AmpliTaq Gold DNA polymerase . BioTechniques 25, 716-22 (1998) e Hot Start PCR with heat-activatable primers: a novel approach for improved PCR performance Nucleic Acids Res (2008) 36 (20) : el31. Contudo, tais técnicas somente alcançam alívio parcial de tais problemas. Dado que qualquer erro das sequências, reações baseadas em não polimerização ou iniciação errónea de iniciadores tais com dimerização de iniciadores podem causar a produção de sinal débil ou a produção do sinal erróneo, particularmente em PCR específica de alelos, seria desejável melhoria adicional destes sinais débeis ou incorretos.

Os fosforotioatos (ou S-oligos) são uma variante do ADN normal nas quais um dos oxigénios não formadores de pontes é substituído com enxofre. São mostrados abaixo exemplos de ligações internucleotídicas fosfodiéster e fosforotioato:

A ligação fosforotioato substitui um átomo de enxofre por um oxigénio não formador de pontes na cadeia principal de fosfato de um oligonucleótido, tornando a ligação internucleotídica resistente a degradação por nucleases . Podem ser introduzidos fosforotioatos no terminal 5' ou 3' do oligo para exibir degradação por exonucleases. Em oligonucleótidos anti sentido, são também introduzidos fosforotioatos internamente para limitar o ataque por endonucleases. É descrita a síntese de oligonucleótidos contendo fosforotioato, por exemplo em Verma S. e Eckstein, F. (1998) . MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES : Synthesis and Strategy for Users . Annu. Rev. Biochem. 1998. 67:99-134 e Curr Protoc Nucleic Acid Chem. Mar 2009 ; Capítulo 4 :Unidade 4.34. DNA oligonucleotides containing stereodefined phosphorothioate linkages in selected positions. Nawrot B, Rebowska B.

Conforme mencionado acima a sulfurização da ligação internucleotídica reduz a ação de endo e exonucleases 2 incluindo ADN POL 1 exonuclease 5' ->3' e 3' 5', nucleases SI e PI, ARNases, nucleases do soro e fosfodiesterase de veneno de serpente. 0 atributo resistente a nuclease do S-oligo em conjunto com PCR de alta fidelidade empregando a utilização de exo + ADN polimerases foi demonstrada, veja-se, por exemplo, Nucl. Acids Res . (2003) 31 (3): e7 . doi: 10.1093/nar/gng007. Taq DNA polymerase possesses no 3' -> 5' Exonuclease (Kenneth R. Tindall, Thomas A. Kunkel, Biochemistry, 1988,27 (16), p 6008-6013) . Foi também relatada discriminação potenciada de polimorfismos de nucleótidos individuais através de modificação por fosforotioato na presença de uma polimerase de revisão de provas, A fosforotioação aumenta a especificidade, reduzindo incidências de interações de iniciadores diméricos, contudo é relatado que é requerida funcionalidade de nuclease 3' para a melhoria de PCR e foi demonstrado que em conjunto com PCR específica de alelo a utilização de S-oligos não oferece qualquer benefício quando utilizada em conjunto com Taq ADN polimerase, veja-se, por exemplo, Zhang, J. e Li, K. (2003) Single-Base Discrimination Mediated by Proofreading 3' Phosphorothioate-Modified Primers. Molecular Biotechnology 25, 223-227.

Existe uma necessidade de sistemas de deteção fáceis de sintetizar, de baixo custo e fiáveis para utilização na deteção de produtos de extensão de iniciadores, por exemplo em ensaios de PCR homogéneos, que abordam os problemas encontrados com os sistemas de deteção existentes para PCR. Ao contrário do conhecimento científico convencional a presente invenção é baseada na constatação de que os S-oligos podem ser utilizados com êxito, e resultar em melhorias, em sistemas de ensaio de deteção de ácidos nucleicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é definida nas reivindicações anexas 1 a 15. A presente divulgação proporciona um método para reduzir a amplificação não específica e/ou formação de iniciadores diméricos numa reação de extensão de iniciadores dependente de molde compreendendo levar a cabo uma primeira reação de extensão de iniciadores na presença de uma polimerase carecendo de atividade nuclease 3' -> 5' , em que um ou mais dos iniciadores contém pelo menos um grupo fosforotioato. São também proporcionados kits e composições para utilização em tais métodos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um esquema de reação simples para deteção direta de uma sequência de ADN incorporando o método da presente invenção. A Figura 2 é um esquema de reação simples para deteção indireta (tempo real) de uma sequência de ADN incorporando o método da presente invenção. A Figura 3 é um esquema de reação simples para deteção indireta (ponto final) de uma sequência de ADN em genotipagem SNP incorporando o método da presente invenção. A Figura 4 mostra dados gerados utilizando o ensaio descrito no Exemplo 1 abaixo. A Figura 5 mostra uma comparação de dados gerados em sistemas de ensaio utilizando sequências de oligonucleotídicas contendo grupos fosforotioato e oligonucleõtidos não contendo fosforotioato conforme descrito no Exemplo 2 abaixo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com a divulgação é proporcionado um método para reduzir a amplificação não específica e/ou formação de iniciadores diméricos numa reação de extensão de iniciadores dependente de molde compreendendo levar a cabo uma primeira reação de extensão de iniciadores na presença de uma polimerase carecendo de atividade nuclease 3' 5', em que um ou mais dos iniciadores contém pelo menos um grupo fosforotioato. 0 método da divulgação compreende preferentemente a utilização de pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente que hibridam entre si em solução livre para formar um par extinto fluorescente, que após introdução de uma sequência complementar com uma ou ambas sequências gera um sinal mensurável, em que um ou mais dos iniciadores é modificado com pelo menos um grupo fosforotioato.

Noutra forma de realização da divulgação as duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente têm Tm diferentes . Quando as sequências de oligonucleótidos têm Tm diferentes então uma das sequências pode ter uma Tm que é a mesma ou inferior à Ta da reação de extensão de iniciadores, por exemplo, processo de PCR. A outra pode ter uma Tm que não estej a adequadamente por debaixo da Ta mas preferentemente por cima da mesma e mais preferentemente substancialmente por cima da mesma. Numa forma de realização o oligonucleótido de extinção tem uma Tm superior à Ta.

Uma fórmula utilizada habitualmente para determinar a Tm de uma sequência é Tm=4(G+C)+2(A+T), e consequentemente a Tm baixa de uma sequência pode, em princípio, ser obtida através de um comprimento mais curto e/ou uma razão (G+C)/(A+T) reduzida em relação à outra sequência do par repórter.

Nalguns aspetos da divulgação é preferido que uma das sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente seja mais de 10 bases mais longa do que a outra e preferentemente pelo menos 15 bases mais longa. A invenção proporciona um método para a deteção de um produto de extensão de iniciadores produzido na presença de uma polimerase carecendo de atividade exonuclease 3' -> 5' , o método compreendendo as etapas de: a) proporcionar pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente, por exemplo com Tm diferente, que hibridam entre si em solução livre para formar um par extinto fluorescente, que após introdução de uma sequência complementar com uma ou ambas sequências gera um sinal mensurável, quando a sequência complementar é hibridada com uma das pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente, em que pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos contém pelo menos um grupo fosforotioato; b) proporcionar pelo menos um iniciador e iniciar a reação de extensão de iniciadores gerando desta forma uma sequência complementar a pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente; e c) medir o sinal detetável que é gerado quando a sequência complementar é hibridada com uma das pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente.

Num aspeto adicional da invenção o método compreende um método para a deteção de um produto de extensão de iniciadores produzido na presença de uma polimerase carecendo de atividade exonuclease 3' -> 5'PCR, o método compreendendo as etapas de: a) proporcionar uma primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente e pelo menos uma segunda sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente, por exemplo onde a primeira e segunda sequências de oligonucleótidos têm Tm diferentes, nas quais a primeira e segunda sequências de oligonucleótidos hibridam entre si em solução livre para formar um par extinto fluorescente e pelo menos um iniciador, e por exemplo onde uma da primeira e segunda sequências de oligonucleótidos tem uma Tm que é igual ou inferior à Ta do processo de PCR, em que pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos contém pelo menos um grupo fosforotioato, o pelo menos um iniciador compreendendo pelo menos um iniciador com cauda não etiquetada, o iniciador com cauda não etiquetada tendo uma região de cauda, a região de cauda compreendendo uma sequência de oligonucleótidos complementar com uma sequência de oligonucleótidos da segunda sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente, a primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente sendo uma forma de iniciador cuja síntese de ADN é iniciada após uma sequência complementar à primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente ter sido gerada durante o processo de PCR, tal que a segunda sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente jã não seja capaz de hibridar com a primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente, pelo qual é gerado um sinal mensurável; b) iniciar a reação de extensão de iniciadores gerando desta forma uma sequência complementar a pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente; e c) medir o sinal detetável que é gerado quando a sequência complementar é hibridada com a primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente.

Num aspeto preferido adicional da invenção o método compreende um método para a deteção de um produto de extensão de iniciadores produzido na presença de uma polimerase carecendo de atividade exonuclease 3' 5'PCR, o método compreendendo as etapas de: a) proporcionar uma primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente e pelo menos uma segunda sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente, por exemplo onde a primeira e segunda sequências de oligonucleótidos têm Tm diferentes, nas quais a primeira e segunda sequências de oligonucleótidos hibridam entre si em solução livre para formar um par extinto fluorescente e pelo menos um iniciador, e por exemplo onde uma da primeira e segunda sequências de oligonucleótidos tem uma Tm que é igual ou inferior à Ta do processo de PCR, em que pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos contém pelo menos um grupo fosforotioato, o pelo menos um iniciador compreendendo pelo menos um iniciador com cauda não etiquetada, o iniciador com cauda não etiquetada tendo uma região de cauda, a região de cauda compreendendo uma sequência de oligonucleótidos idêntica ou substancialmente homóloga com uma sequência de oligonucleótidos da primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente, a primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente sendo uma iniciador a partir do qual é iniciada síntese de ADN após uma sequência complementar à primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente ter sido gerada durante o processo de PCR, tal que a segunda sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente já não seja capaz de hibridar com a primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente, pelo qual é gerado um sinal mensurável: b) iniciar a reação de extensão de iniciadores gerando desta forma uma sequência complementar a pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente; e c) medir o sinal detetável que é gerado quando a sequência de complemento é hibridada com uma das pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente. A invenção também proporciona um kit para a deteção de um produto de extensão de iniciadores produzido na presença de uma polimerase carecendo de atividade exonuclease 3' 5', que compreende 1) pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente por exemplo com Tm diferente, que hibridam entre si em solução livre para formar um par extinto fluorescente, que após introdução de uma sequência complementar com uma ou ambas sequências gera um sinal mensurável quando a sequência complementar é hibridada com uma das pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente; e 2) uma polimerase carecendo de atividade exonuclease 3' a 5'; em que pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos contém pelo menos um grupo fosforotioato em que pelo menos uma das bases internas da pelo menos uma sequência de oligonucleótidos contém um grupo fosforotioato e em que a pelo menos uma sequência de oligonucleótidos que contém pelo menos um grupo fosforotioato tem 20-80%, opcionalmente 30-70%, das bases modificadas por um grupo fosforotioato; e opcionalmente em que as bases modificadas são separadas por pelo menos uma base não modificada, e/ou em que bases alternativas são fosforotioatos.

Os kits de acordo com a invenção podem também conter outros componentes adequados para utilização em reações de extensão de iniciadores tais como sais de magnésio, dNTPs etc.

Na presente invenção, todos ou pelo menos um dos iniciadores utilizados nos métodos podem conter bases modificadas por fosforotioato. 0 número de ligações fosfodiêster substituídas por fosforotioatos em qualquer determinado iniciador pode variar desde uma até todas as ligações fosfodiêster sendo substituídas por fosforotioatos. 0 (s) iniciador (es) pode (m) conter fosforotioatos nos terminais 5' e/ou 3' , contudo é preferido que, como uma alternativa a ou para além de tais modificações terminais, pelo menos uma das bases internas do iniciador é um fosforotioato. Por exemplo 10-90%, 20-80%, 30-70% ou 40-60% das bases podem ser fosforotioatos. Numa forma de realização as bases modificadas por fosforotioato são separadas por pelo menos uma, por exemplo uma a três, bases (fosfodiêster) não modificadas. Numa forma de realização preferida bases alternadas dentro do (s) iniciador(es) são fosforotioatos. A utilização de modificação por fosforotioato de bases alternadas de iniciadores etiquetados com fluoróforo (referida no presente documento como modificação semi-S) em conjunto com agentes de extinção não modificados representa uma forma de realização preferida da invenção dado que estes dão discriminação e intensidade de sinal particularmente potenciados da PCR. São ilustrados exemplos de modificações por fosforotioato diferentes que podem ser utilizadas na invenção abaixo em iniciadores etiquetados com fluoróforos ou agentes de extinção, onde " denota um fosforotioato:

Flúor FAM não modificado: 5'-FAM- GCGATT- AGCCGTTAGGATGA 3' Flúor FAM S3': 5'-FAM- CGATTAGCCGTTAG- GATG"A 3' Flúor FAM Semi S : 5' -FAM- G"CG"AT"TA"GC"CG"TT"AG"GA"TG"A 3'

Flúor FAM S Completo: 5'-FAM- G"c"G"A"T"T"A"G"C"C"G"T"T"AG"G"A"T"G"A 3'

Flúor HEX modificado: 5'-HEX- GTCGGT- GAACAGGTTAGAGA 3' Flúor HEX S3': 5'-HEX- GTCGGTGAACAGGTTA- GAG"A 3' Flúor HEX Semi S : 5' -HEX- G"TC"GG"TG"AA"CA"GG"TT"AG"AG"A 3'

Flúor HEX S Completo: 5'-HEX- G"t"c"G"G"T"G"A"A"C"A"G"G"T"T"A"G"A"G"A 3'

Agente de Extinção FAM Padrão: 5' CCTAACG- GCTAATCGC -Dabsilo 3'

Agente de Extinção FAM Semi S VI.0: 5' C"CT"AA"CG"GC"TA"AT"CG"C -Dabsilo 3'

Agente de Extinção FAM Semi S V2.0: 5' CC"TA"AC"GG"CT"AA"TC"GC -Dabsilo 3'

Agente de Extinção FAM S Completo: 5' C"c"t"A"A"C"G"G"C"T"A"A"T"C"G"C -Dabsilo 3'

Agente de Extinção HEX Padrão: 5' AACCTGTTCAC- CGAC-Dabsilo 3'

Agente de Extinção HEX Semi S VI.0: 5' AA"CC"TG"TT"CA"CC"GA"C-Dabsilo 3'

Agente de Extinção HEX Semi S V2.0: 5' A"AC"CT"GT"TC"AC"CG"AC-Dabsilo 3'

Agente de Extinção HEX S Completo: 5' A"A"C"C"T"G"T"T"C"A"C"C"G"A"C-Dabsilo 3'

Podem ser sintetizadas sequência de oligonucleótidos contendo pelo menos um grupo fosforotioato para utilização na presente invenção através de métodos conhecidos para os peritos na especialidade. A presente invenção encontra utilidade numa variedade de diferentes aplicações, e é particularmente adequada para utilização em reações baseadas em PCR, incluindo aplicações de deteção de SNP, aplicações de deteção de variação alélica, PCR em tempo real e semelhantes.

Conforme indicado acima, a presente divulgação proporciona métodos de redução de ampliação não específica e/ou formação de iniciadores diméricos numa reação de extensão de iniciadores dependente de molde e para detetar a produção de produtos de extensão de iniciadores numa mistura de reação de extensão de iniciadores, por exemplo determinar se são produzidos produtos de extensão de iniciadores numa reação de extensão de iniciadores. Produto de extensão de iniciadores significa uma molécula de ácido nucleico que resulta a partir de uma reação de extensão de iniciadores dependente de molde. Reações de extensão de iniciadores dependentes de molde são aquelas reações nas quais uma polimerase amplia uma molécula de iniciador de ácidos nucleicos que é hibridada com uma molécula de ácidos nucleicos molde, onde a sequência de bases que é adicionada ao terminal da primeira molécula de ácidos nucleicos é determinada pela sequência de bases na cadeia de molde. As reações de extensão de iniciadores dependentes de molde incluem reações de extensão de iniciadores tanto de amplificação como de não amplificação. Nalgumas formas de realização da invenção em questão, a reação de extensão de iniciadores dependente de molde na qual a produção de produtos de extensão de iniciadores é detetada é uma reação de amplificação, por exemplo uma reação em cadeia de polimerase (PCR).

Na presente divulgação a reação de extensão de iniciadores dependente de molde na qual a produção de produtos de extensão de iniciadores é detetada é uma reação contendo iniciadores modificados com grupos fosforotioato em conjunto com polimerases carecendo de atividade nuclease 3' -> 5'.

Na prática dos métodos da divulgação a primeira etapa é produzir uma mistura de extensão de iniciadores, por exemplo uma composição que inclui todos os elementos necessários para que a reação de extensão de iniciadores ocorra. Por exemplo a mistura de extensão de iniciadores pode incluir pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente, por exemplo com Tm diferente, que hibridam entre si em solução livre para formar um par extinto fluorescente e que após introdução de uma sequência complementar com uma ou ambas sequências gera um sinal mensurável, em que uma das sequências por exemplo tem uma Tm que é igual ou inferior à Ta, (um "par de iniciadores de cassete FET"), em que pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos contém pelo menos um grupo fosforotioato. FET ocorre quando uma fração doadora de energia e uma aceitadora de energia fluorescente se encontram em proximidade estreita entre si . A energia de excitação absorvida pelo doador é transferida ao aceitador que pode então dissipar adicionalmente esta energia ou através de emissão de fluorescência no case de um fluoróforo, ou através de métodos de não fluorescência no caso de um agente de extinção. Um par doador-aceitador compreende dois fluoróforos tendo espetros sobrepostos, onde a emissão do doador sobrepõe a absorção do aceitador, de modo a que ocorra transferência de energia a partir do fluoróforo excitado para o outro membro do par. Não é essencial que o fluoróforo excitado emita realmente fluorescência, sendo suficiente que o fluoróforo excitado seja capaz de absorver eficazmente a energia de excitação e transferi-la eficazmente para o fluoróforo de emissão.

Como tal, a (s) cassete (s) FET empregue (s) nos métodos em questão são detetores de ácidos nucleicos que incluem em oligonucleótidos separados um domínio de fluoróforo onde o doador de energia de fluorescência, isto é, doador, está posicionado e um segundo oligonucleótido com um domínio aceitador onde o aceitador de energia de fluorescência, isto é, aceitador, está posicionado. Conforme mencionado acima, o oligonucleótido doador inclui o fluoróforo doador. 0 fluoróforo doador pode estar posicionado em qualquer sítio no detetor de ácidos nucleicos, mas está tipicamente presente no terminal 5' do detetor. 0 domínio aceitador inclui o aceitador de energia de fluorescência. 0 aceitador pode estar posicionado em qualquer sítio no domínio aceitador, mas está tipicamente presente no terminal 3' do detetor de ácidos nucleicos.

Para além dos domínios de fluoróforo e aceitador, os oligonucleótidos aceitadores da cassete FET também incluem um domínio de ligação a ácidos nucleicos alvo, que liga a uma sequência de ácidos nucleicos alvo que é criada a partir dos iniciadores com cauda não etiquetados incluídos na reação, por exemplo sob condições restringentes de hibridação (conforme definido abaixo).

Dependendo da natureza do oligonucleótido e do próprio ensaio, o domínio de ligação alvo pode hibridar com uma região do produto de extensão de iniciadores. Por exemplo, onde o ensaio é um ensaio de genotipagem de SNP, por exemplo no qual é empregue um sistema repórter de cassete universal, o domínio de ligação alvo híbrida sob condições restringentes com um sítio de ligação alvo do primeiro produto de extensão. Os fluoróforos para pares de oligonucleótidos FET podem ser selecionados de modo a originar a partir de uma família química semelhante ou uma diferente, tais como corantes de cianina, xantenos ou semelhantes. Fluoróforos de interesse incluem, mas não estão limitados a corantes de fluoresceína (por exemplo 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',4',1,4,-tetraclorofluoresceína (TET), 2',4',5',7',1,4-hexaclorofluoresceína (HEX), e 2',7'dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE)), corantes de cianina tais como Cy5, derivados de dansilo, corantes de rodamina (por exemplo tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), e tetrapropano-6-carboxirrodamina (ROX)), DABSYL, DABCYL, compostos de cianina, tal como Cy3, antraquinona, nitrotiazol, e nitroimidazol, e semelhantes. São adicionalmente descritos fluorõforos de interesse nos Pedidos de Patente Internacional WO 01/42505 e WO 01/86001.

Dado que a primeira mistura de reação de extensão de iniciadores produzida na etapa inicial dos métodos em questão é uma mistura de reação de extensão de iniciadores deficiente em exonuclease 3' 5' , inclui adicionalmente uma enzima não tendo atividade exonuclease 3' -> 5'. Em muitas formas de realização, a combinação de polimerases empregue inclui pelo menos uma Família A, onde os termos "Família A" e "Família B" correspondem ao esquema de classificação relatado em Braithwaite e Ito, Nucleic Acids Res. (1993) 21:787-802. Polimerases da Família A de interesse incluem: polimerases de Thermus aquaticus, incluindo a polimerase de ocorrência natural (Taq) e derivados e homólogos da mesma, tais como Klentaq (confirme descrito em Proc. Natl. Acad. Sei USA (1994) 91:2216-2220); polimerases de Thermus thermophilus, incluindo a polimerase de ocorrência natural (Tth) e derivados e homólogos da mesma, e semelhantes.A polimerase para utilização na invenção pode ser utilizada em forma purificada ou não purificada.

Outro componente da mistura de reação produzida na primeira etapa dos métodos é o ácido nucleico molde. O ácido nucleico que serve como molde pode ser de cadeia simples ou cadeia dupla, onde o ácido nucleico é tipicamente ácido desoxirribonucleico (ADN). O comprimento do ácido nucleico molde pode ser tão curto como 50 pb, mas habitualmente ter pelo menos 100 pb de comprimento, e mais habitualmente pelo menos 150 pb de comprimento, e pode ter tanto como 10.000 pb de comprimento ou mais, por exemplo 50.000 pb de comprimento ou mais, incluindo um extrato de ADN genómico, ou digestão do mesmo, etc. 0 ácido nucleico pode ser livre em solução, flanqueado num ou em ambos terminais com ácido nucleico não molde, presente num vetor, por exemplo plasmídeo e semelhante, com o único critério sendo que o ácido nucleico esteja disponível para participação na reação de extensão de iniciadores. 0 ácido nucleico molde pode estar presente em forma purificada, ou numa mistura complexa com outros ácidos nucleicos não molde, por exemplo em preparação de ADN celular, etc. 0 ácido nucleico molde pode ser derivado a partir de uma variedade de fontes diferentes, dependendo da aplicação para a qual a PCR está a ser realizada, onde tais fontes incluem organismos que compreendem ácidos nucleicos, isto é, vírus; procariotas, por exemplo bactérias, arqueias e cianobactérias; e eucariotas, por exemplo membros do reino protista, tais como flagelados, amebas e os seus parentes, parasitas ameboides, ciliados e semelhantes; membros do reino dos fungos, tais como bolores mucilaginosos, bolores mucilaginosos acelulares, bolores mucilaginosos celulares, bolores aquáticos, bolores verdadeiros, fungos conjugados, ascomicetes, basidiomicetes, fungos imperfeitos e semelhantes; plantas, tais como algas, musgos, marchantiófitas, anterocerõfitas, licopodiópsidas, equisetos, pteridõfitas, gimnospermas e angiospermas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas; e animais, incluindo esponjas, membros do filo dos cnidários, por exemplo alforreca, corais e semelhantes, ctenóforos, helmintos, rotíferos, nematodes, anelídeos, moluscos, artrópodes, equinodermos, enteropneustos, e vertebrados, incluindo répteis, peixes, aves, serpentes, e mamíferos, por exemplo roedores, primatas, incluindo seres humanos, e semelhantes. 0 ácido nucleico molde pode ser utilizado diretamente a partir da sua fonte de ocorrência natural e/ou pré-processado numa série de diferentes formas, conforme é conhecido na técnica. Nalgumas formas de realização, o ácido nucleico molde pode ser a partir de uma fonte sintética. 0 seguinte componente da mistura de reação produzida na primeira etapa dos métodos em questão são os iniciadores empregues na reação de extensão de iniciadores, por exemplo os iniciadores de PCR (tais como iniciadores de sentido direto e reverso empregues em amplificação geométrica ou um único iniciador empregue numa amplificação linear). Cada mistura de reação de extensão de iniciadores irá compreender pelo menos dois iniciadores (no caso de amplificação linear) e habitualmente três iniciadores e mais habitualmente cinco ou sete iniciadores no caso de uma reação de genotipagem de SNP. Uma mistura de reação de amplificação de iniciadores irá compreender pelo menos um iniciador doador etiquetado por fluorescência e um aceitador complementar, iniciador etiquetado com agente de extinção no caso de amplificação linear onde um ou ambos iniciadores conterão pelo menos um grupo fosforotioato.

Mais habitualmente no caso de amplificação exponencial a mistura de extensão de iniciadores irá compreender pelo menos um iniciador doador etiquetado por fluorescência e um aceitador complementar, iniciador etiquetado com agente de extinção, e um iniciador de sentido reverso não etiquetado, onde um ou qualquer dos iniciadores conterá pelo menos um grupo fosforotioato. Mais habitualmente, no caso de amplificação exponencial utilizando um sistema repórter universal a mistura de extensão de iniciadores irã compreender pelo menos um iniciador aceitador etiquetado por fluorescência e um doador complementar, iniciador etiquetado com agente de extinção, um iniciador de sentido reverso não etiquetado e um iniciador de sentido direto com cauda, onde um ou qualquer dos iniciadores conterá pelo menos uma modificação fosforotioato. Os iniciadores de oligonucleótidos com os quais o ácido nucleico molde (doravante referido como o ADN molde para conveniência) é colocado em contacto terão comprimento suficiente para proporcionar hibridação com ADN molde complementar sob condições de hibridização (descritas em maior detalhe abaixo) mas não terão comprimento suficiente para formar híbridos estáveis com ADN molde sob condições de polimerização. Os iniciadores podem ter pelo menos 10 pb de comprimento, por exemplo pelo menos 15 pb de comprimento. Os iniciadores podem ter 30 pb de comprimento ou mais, por exemplo, o comprimento dos iniciadores pode ser desde 18 até 60 pb, tal como desde cerca de 2 0 até 3 5 pb de comprimento. O ADN molde pode ser colocado em contacto com um único iniciador ou um conjunto de dois iniciadores (iniciadores de sentido direto e reverso), dependendo de se a extensão de iniciadores, amplificação linear ou exponenciar do ADN molde for desejada. Quando é empregue um único iniciador, o iniciador será tipicamente complementar a um dos terminais 3' do ADN molde e quando são empregues dois iniciadores, os iniciadores serão tipicamente complementares aos dois terminais 3' do ADN molde de cadeia dupla.

Conforme utilizado no presente documento, "ácido nucleico" significa ou ADN, ARN, de cadeia simples ou de cadeia dupla, e quaisquer modificações químicas dos mesmos. As modificações incluem, mas não estão limitadas a, aquelas que proporcionam outros grupo químicos que incorporam carga, polarizabilidade, ligações de hidrogénio, interação eletrostática, e funcionalidade adicional ao ácido nucleico. Tais modificações incluem, mas não estão limitados a, modificações de açúcar na posição 2', modificações de pirimidina na posição 5' , modificações de purina na posição 8, modificações em aminas exocíclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo- ou 5-iodo-uracilo; modificações da cadeia principal, metilações, combinações não habituais de emparelhamento de bases tais como as isobases isocitidina e isoguanidina e semelhantes. As modificações também podem incluir modificações 3' e 5' tais como capeamento.

Conforme utilizado no presente documento, "complementar" refere-se ao par de bases nitrogenadas, consistindo numa purina ligada por ligações de hidrogénio a uma pirimidina, que une as cadeias complementares de ADN ou de moléculas híbridas unindo ADN e ARN.

Conforme utilizado no presente documento, "grupo fluorescente" refere-se a uma molécula que, quando excitada com luz tendo um comprimento de onda selecionado, emite luz de um comprimento de onda diferente. Os grupos fluorescentes também podem ser referidos como "fluoróforos".

Conforme utilizado no presente documento, "grupo de modificação de fluorescência" refere-se a uma molécula que pode alterar de qualquer forma a emissão de fluorescência a partir de um grupo fluorescente. Um grupo de modificação de fluorescência cumpre isto geralmente através de um mecanismo de transferência de energia. Dependendo da identidade do grupo de modificação de fluorescência, a emissão de fluorescência pode ser submetida a uma série de alterações, incluindo, mas não limitada a, atenuação, extinção completa, potenciamento, um deslocamento do comprimento de onda, um deslocamento da polaridade, uma alteração do período de vida da fluorescência. Um exemplo de um grupo de modificação de fluorescência é um grupo de extinção.

Conforme utilizado no presente documento, "transferência de energia" regere-se ao processo através do qual a emissão de fluorescência de um grupo fluorescente é alterada por um grupo de modificação de fluorescência. Se o grupo de modificação de fluorescência é um grupo de extinção, então a emissão de fluorescência a partir do grupo fluorescente é atenuada (extinta). A transferência de energia pode ocorrer através de transferência de energia por ressonância de fluorescência, ou através de transferência de energia direta. Os mecanismos de transferência de energia exatos nestes dois casos são diferentes. Deve ser entendido que qualquer referência a transferência de energia no presente pedido abrange todos estes fenómenos mecanisticamente diferentes. A transferência de energia é também referida no presente documento como transferência de energia fluorescente ou FET.

Conforme utilizado no presente documento, "par de transferência de energia" refere-se a quaisquer duas moléculas que participam em transferência de energia. Tipicamente, uma das moléculas atua como um grupo fluorescente, e a outra atua como um grupo de modificação da fluorescência. 0 par de transferência de energia preferido da presente invenção compreende um grupo fluorescente e um grupo de extinção. Nalguns casos, a distinção entre o grupo fluorescente e o grupo de modificação da fluorescência pode não ser clara. Por exemplo, sob determinadas circunstâncias, dois grupos fluorescentes adjacentes podem extinguir a emissão de fluorescência um do outro através de transferência de energia direta. Por este motivo, não existe limite sobre a identidade dos membros individuais do par de transferência de energia neste pedido. Tudo que é requerido é que as propriedades espetroscópicas do par de transferência de energia como um todo sejam alterados de alguma forma mensurável se a distância entre os membros individuais for alterada nalguma quantidade crítica. "Par de transferência de energia" é utilizado para referir um grupo de moléculas que formam um único complexo dentro do qual ocorre a transferência de energia. Tais complexos podem compreender, por exemplo, dois grupos fluorescentes que podem ser diferentes entre si e um grupo de extinção, dois grupos de extinção e um grupo fluorescente, ou múltiplos grupos fluorescentes e múltiplos grupos de extinção. Em casos onde existem múltiplos grupos fluorescentes e/ou múltiplos grupos de extinção, os grupos individuais podem ser diferentes entre si.

Conforme utilizado no presente documento, "iniciador" refere-se a um oligonucleótido que é capaz de atuar como um ponto de iniciação de síntese quando colocado sob condições nas quais a síntese de um produto de extensão de iniciador que é complementar a uma cadeia de ácido nucleico são induzidas (por exemplo sob condições de hibridação restringentes). O termo "sequência de oligonucleótidos" pode ser utilizado no presente documento para referir um iniciador e vice-versa.

Conforme utilizado no presente documento, "grupo de extinção" refere-se a qualquer grupo de modificação de fluorescência que possa atenuar pelo menos parcialmente a luz emitida por um grupo fluorescente. Esta atenuação é referida no presente documento como "extinção". Como tal, a iluminação do grupo fluorescente na presença do grupo de extinção leva a um sinal de emissão que é menos intenso do que o esperado, ou inclusive completamente ausente. A extinção ocorre através de transferência de energia entre o grupo fluorescente e o grupo de extinção.

Conforme utilizado no presente documento, "transferência de energia por ressonância de fluorescência" ou "FRET" refere-se a um fenómeno de transferência de energia no qual a luz emitida pelo grupo fluorescente excitado é absorvida pelo menos parcialmente por um grupo de modificação de fluorescência. Se o grupo de modificação de fluorescência é um grupo de extinção, então esse grupo pode ou radiar a luz absorvida como luz de um comprimento de onda diferente, ou pode dissipá-la como calor. FRET depende de uma sobreposição entre o espetro de emissão do grupo fluorescente e o espetro de absorção do grupo de extinção. FRET também depende da distância entre o grupo de extinção e o grupo fluorescente. Por cima de uma determinada distância crítica, o grupo de extinção é incapaz de absorver a luz emitida pelo grupo fluorescente, ou somente o pode realizar de forma pobre.

Conforme é utilizado no presente documento "iniciador com cauda" refere-se a um oligonucleótido contendo dois domínios, um específico do ADN molde alvo de interesse e o outro uma sequência única servindo como um molde para produção de produto a partir de iniciadores universais presentes em cada reação de PCR diferente e distinta.

Conforme é utilizado no presente documento "transferência de energia direta" refere-se a um mecanismo de transferência de energia no qual a passagem de um fotão entre o grupo fluorescente e o grupo de modificação não ocorre. Sem estar limitado por um único mecanismo, é acreditado que na transferência de energia direta, o grupo fluorescente e o grupo de modificação de fluorescência interferem com a estrutura eletrónica um do outro. Se o grupo de modificação de fluorescência é um grupo de extinção, isto irá resultar no grupo de extinção prevenindo que o grupo fluorescente emita sequer luz .

Geralmente, a extinção através de transferência de energia direta é mais eficaz do que a extinção por FRET. Com efeito, alguns grupos de extinção que não extinguem grupos fluorescentes particulares através de FRET (dado que não têm a sobreposição espetral necessária com o grupo fluorescente) podem realizá-lo eficazmente através de transferência de energia direta. Além disso, alguns grupos fluorescentes podem eles mesmos atuar como grupos de extinção se estiverem suficientemente próximos a outros grupos fluorescentes para causar transferência de energia direta. Por exemplo, sob estas condições, dois grupos fluorescentes adjacentes podem extinguir a emissão de fluorescência um do outro de forma eficaz. Por estes motivos, não existe limite sobre a natureza dos grupos fluorescentes e grupos de extinção úteis para a prática desta invenção.

Um exemplo de "condições de hibridação restringentes" é a hibridação a 50 °C ou superior e SSC 6,0 x (NaCl 900 mM /citrato de sódio 90 mM) . Outro exemplo de condições de hibridação restringentes é incubação durante a noite a 42°C ou superior numa solução: formamida a 50%, SSC 6 x (NaCl a 900 mM, citrato trissódico a 90 mM) , fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6) , sulfato de dextrano a 10%, e ADN de esperma de salmão a 20 ug/ml desnaturado e cortado. Condições de hibridação restringentes são condições de hibridação que são pelo menos tão restringentes como as condições representativas acima, onde as condições são consideradas como sendo pelo menos tão restringentes se foram pelo menos cerca de 80% tão restringentes, tipicamente pelo menos cerca de 90% tão restringentes como as condições restringentes específicas acima. São conhecidas outras condições de hibridação restringentes na técnica e podem também ser empregues.

As referências a sequências sendo idênticas no presente documento podem ser interpretadas como significando sequências que são idênticas ou substancialmente homologas entre si.

Exemplos da utilização da presente invenção incluem os seguintes:

Deteção Direta de Produtos de PCR:

Esta forma de realização, ilustrada na FIG. 1 utiliza um iniciador de oligonucleótido para iniciar o processo de PCR. Este iniciador convencional é dirigido à região de molde de interesse e como tal conduz a especificidade da reação. Este oligonucleótido é também etiquetado com fluorescência no terminal 5'. Existem uma série de fluorõforos adequados, com uma eleição popular sendo FAM (um derivado de fluoresceína) . Finalmente, é incluído na reação um oligonucleótido etiquetado com agente de extinção a 3' anti sentido ao oligonucleótido etiquetado com FAM. Existem uma série de etiquetas adequadas das quais a série de etiquetas do agente de extinção Black Hole são uma eleição popular. Contanto que o comprimento do oligonucleótido de extinção seja suficientemente longo para dar uma Tm por cima da Ta da reação a geração de produto pode ser avaliada em cada ciclo do processo de PCR em qualquer instrumento de PCR m tempo real (tal como um instrumento ABI 7900 Prism). Alternativamente a reação pode empregar um oligonucleótido de extinção que tenha uma Tm inferior à Ta da reação. Após a PCR a reação é arrefecida até à temperatura ambiente e os produtos podem ser avaliados em qualquer instrumento em tempo real e adicionalmente qualquer leitor de placa de fluorescência (tal como um BMG Pherastar).

Devido à complementaridade dos dois oligonucleótidos etiquetados (etiquetados com agente de extinção e fluoróforo), hibridam entre si. Esta hibridação coloca a etiqueta de agente de extinção em proximidade muito estreita com o fluoróforo, tornando como tal todo o sinal fluorescente a partir da molécula FAM extinta, quando excitado a 488 nm (o comprimento de onda de excitação ótimo de FAM).

Também é incluído na reação um iniciador de sentido reverso convencional para criar um par de iniciadores de PCR. 0 processo de PCR é então iniciado e o produto de PCR começa a ser gerado.

Após os primeiros ciclos de PCR é gerada a sequência anti sentido para o iniciador fluorescente. Durante este processo o oligonucleótido de extinção já não liga; isto produz um amplicão contendo uma molécula FAM a 5' . Após ocorrer isto o oligo de extinção jã não é capaz de hibridar com o oligonucleótido etiquetado com FAM, dado que o processo de PCR produz ADN de amplicão de cadeia dupla. Dado que o oligonucleótido de extinção já não pode hibridar com o oligonucleótido FAM, é então gerado um sinal que é diretamente proporcional à quantidade de produto de PCR gerado.

Deteção Indireta (tempo real) de Produtos de PCR

Esta forma de realização, ilustrada na FIG. 2, utiliza um oligonucleótido (iniciador) convencional para iniciar o processo de PCR. Este iniciador convencional é dotado de uma cauda com uma sequência de ADN que não é dirigida à região de amplicão de interesse, pelo qual esta cauda é essencialmente inerte. Esta sequência de cauda está posicionada na porção 5' do iniciador. É também incluído na reação um único oligonucleótido etiquetado com fluorescência que é idêntico a ou substancialmente homólogo à região de sequência de cauda do iniciador convencional. Existem uma série de fluoróforos adequados, com uma eleição popular sendo FAM (um derivado de fluoresceína). Finalmente, é incluído na reação um oligonucleótido etiquetado com agente de extinção a 3' anti sentido ao oligonucleótido etiquetado com FAM. Existem uma série de etiquetas adequadas das quais a série de etiquetas do agente de extinção Black Hole são uma eleição popular.

Contanto que o comprimento do oligonucleótido de extinção seja suficientemente longo para dar uma Tm por cima da Ta da reação a geração de produto pode ser avaliada em cada ciclo do processo de PCR em qualquer instrumento de PCR m tempo real (tal como um instrumento ABI 7 900 Prism) . Alternativamente a reação pode empregar um oligonucleótido de extinção que tenha uma Tm inferior à Ta da reação. Após a PCR a reação é arrefecida até à temperatura ambiente e os produtos podem ser avaliados em qualquer instrumento em tempo real e adicionalmente qualquer leitor de placa de fluorescência (tal como um BMG Pherastar).

Devido à complementaridade dos dois oligonucleótidos etiquetados, estes hibridam entre si. Esta hibridação coloca a etiqueta de agente de extinção em proximidade muito estreita com o fluoróforo, tornando como tal todo o sinal fluorescente a partir da molécula FAM extinta, quando excitado a 488 nm (o comprimento de onda de excitação ótimo de FAM) . 0 processo de PCR é então iniciado e o produto de PCR começa a ser gerado. Após os primeiros ciclos de PCR é gerada a sequência anti sentido para o iniciador fluorescente. 0 iniciador de PCR fluorescente é então capaz de iniciar a síntese durante a PCR, e fá-lo. Isto produz um amplicão contendo uma molécula FAM a 5'. Após ocorrer isto o oligo de extinção já não é capaz de hibridar com o oligonucleótido etiquetado com FAM, dado que o processo de PCR produz ADN de amplicão de cadeia dupla. Dado que o oligonucleótido de extinção jã não pode hibridar com o oligonucleótido FAM, é então gerado um sinal que é diretamente proporcional à quantidade de produto de PCR gerado. A região de cauda do iniciador com cauda não necessita ser idêntica ao oligonucleótido etiquetado com fluorescência único, contanto que uma sequência anti sentido da região de cauda hibride com o oligonucleótido etiquetado com fluorescência único.

Deteção Indireta (ponto final) de Produtos de PCR - Genotipagem por SNP: A forma de realização, ilustrada na FIG. 3, utiliza o mesmo par de oligonucleótidos etiquetados com fluoróforo e agente de extinção conforme descrito na FIG. 2. 0 esquema de reação é idêntico exceto por algumas modificações.

Alcançar a genotipagem por SNP requer a utilização de dois iniciadores etiquetados com fluorescência e oligonucleótidos etiquetados com agente e extinção correspondentes. Cada iniciador é novamente dotado de cauda com uma sequência única, à qual na reação é incluído um iniciador etiquetado por fluorescência a 5' . Dois corantes adequados são FAM e HEX, que são resolúveis espetralmente entre si. Os dois iniciadores (porção sem cauda; geralmente denominada de sentido direto) são orientados ao ADN de interesse. Nesta porção do iniciador estes diferem tipicamente somente por um único nucleõtido na sua base terminal 3' . Cada iniciador é orientado à base polimórfica no ADN de interesse. É levada a cabo PCR e os dois iniciadores somente iniciam a síntese quando a base 3' está perfeitamente emparelhada. Quando ocorre um emparelhamento erróneo a síntese não prossegue.

Durante a reação, a causa específica dependendo do genótipo é capaz de iniciar a síntese (ou ambas o são, no caso de um heterozigoto) . Isto incorpora novamente a porção de cauda fluorescente do iniciador no produto de PCR impedindo como tal a hibridação do oligonucleótido de extinção. É como tal gerado um sinal de acordo com qual dos oligonucleótidos iniciou a síntese. A reação é então lida num leitor de placa fluorescente para ambos fluoróforos. Os seus dados resultantes são então representados graficamente e é gerado um gráfico de agrupamento de um fluoróforo sobre o outro. Os genótipos resultantes são então capazes de ser determinados com base nos seus gráficos de agrupamento.

Uma utilização adicional do sistema oligo de par de extinção de fluoróforos descrito está na deteção homogénea de produtos de PCR com a utilização de atividade nuclease 5'-3' da Taq polimerase. A presente divulgação e invenção podem ser empregues para melhorar adicionalmente a especificidade e formação de iniciadores diméricos que também ocorre no ensaio de nuclease a 5', conhecido de outra forma como taqman.

Nesta memória descritiva e nas reivindicações anexas, as formas singulares °uma°, °um° e °o/a° incluem os respetivos plurais a não ser que o contexto claramente dite o contrário. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento possuem o mesmo significado conforme habitualmente entendido por um perito na especialidade ao qual esta invenção pertence.

Onde é proporcionado um intervalo de valores, deve ser entendido que cada valor interveniente, até à décima da unidade do limite inferior a menos que o contexto claramente indique o contrário, entre o limite superior e inferior desse intervalo, e qualquer outro valor mencionado ou interveniente nesse limite indicado, está englobado na presente invenção. Os limites superior e inferior destes intervalos mais pequenos podem independentemente ser incluídos nos limites mais pequenos, e são também abrangidos dentro da invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo estabelecido. Onde o intervalo estabelecido inclui um ou ambos os limites, intervalos que excluam um ou ambos daqueles limites incluídos estão também incluídos na invenção.

Esta união será agora descrita por referência aos seguintes exemplos que se destinam a fins ilustrativos e não devem ser interpretados como uma limitação do âmbito da presente invenção. EXEMPLO 1 Abreviaturas: FAM: 6-Carboxi-Fluoresceína HEX: 2',4',5',7',1,4-hexaclorofluoresceína

Dabcilo: agente de extinção escuro não fluorescente

Foram desenhados sete oligonucleótidos e as suas sequências podem ser encontradas abaixo, onde ' denota a utilização de modificação S:

1) Oligonucleótido etiquetado com fluorescência FAM

Semi S: 5'-FAM-G"CG"AT"TA"GC"CG"TT"AG"GA"TG"A3'

2) Oligonucleótido etiquetado com fluorescência HEX

Semi S: 5'-HEX-G"TC"GG"TG"AA"CA"GG"TT"AG"AG"A3' 3) Agente de Extinção FAM Padrão: 5' CCTAACG- GCTAATCGC -3'Dabsilo 4) Agente de Extinção HEX Padrão: 5'AACCTGTTCAC-CGAC-3'Dab silo 5) Iniciador específico de alelo 1: 5'GCGATTAGCCGTTAGGATGACTGAGTGCAG GTTCAGACGTCC3' 6) Iniciador específico de alelo 2: 5'GTCGGTGAACAGGTTAGAGACTGAGTGCAG GTTCAGACGTCT3' 7) Iniciador reverso comum: 5'CTCCCTTCCACCTCCGTACCAT3'

Será notado que neste exemplo o iniciador de extinção etiquetado com FAM tem uma sequência de oligonucleõtidos 16mera e é mais de 2 nucleótidos mais curta do que o iniciador/sonda repórter etiquetado com FAM e de forma semelhante o iniciador de extinção etiquetado com HEX tem uma sequência de oligonucleótidos ISmera e é mais de 2 nucleótidos mais curta que o iniciador/sonda repórter etiquetado com HEX. Consequentemente, os iniciadores/sondas repórter etiquetados com FAM ou HEX mais longos têm uma Tm que é igual ou superior à Ta de 57°C da etapa de hibridização do processo de PCR e irão hibridizar com o molde no processo, enquanto os iniciadores de extensão mais curtos são iguais ou inferiores à Ta de 57°C da etapa de hibridização e não irão hibridar com o molde.

Todos os oligonucleótidos foram diluídos a concentrações iniciais de 200uuM em Tris/HCl 10 mM pH 8,0. Todas as posteriores diluições foram levadas a cabo neste diluente. Foi criada uma mistura de ensaio que incluiu os seguintes componentes:

(1) Iniciador específico de alelo 1 0,16 uM

(2) Iniciador específico de alelo 2 0,16 uM

(3) Iniciador (comum) reverso 0,41 uM

(4) Oligonucleótido etiquetado com FAM 0,luM

(5) Oligonucleótido etiquetado com HEX 0,luM

(6) Oligonucleótido etiquetado com agente de extinção (anti sentido ao oligonucleótido 4) 0,5uM

(7) Oligonucleótido etiquetado com agente de extinção (anti sentido ao oligonucleótido 5) 0,5uM (8) Taq polimerase com truncamento N-terminal 30-90 Unidades/ml (9) Tris / HC1 pH lOmM 8,3

(10) KC1 lOmM

(11) Cloreto de magnésio l,8mM

(12) dNTPs 165,2uM

(13) 5-carboxi-X-rodamina, SE (5 -ROX, SE) 212,5nM

Aos poços A1-B24 de uma placa de microtitulação de 384 poços foram adicionados 10 ng de ADN genómico a partir de 44 indivíduos caucásicos. Os restantes 4 poços foram deixados vazios servindo como poços de controlo negativo. Esta placa foi então seca a 50°C durante um período de 1 hora.

Aos poços A1-B24 da placa seca foram adicionados 5 ml de mistura de ensaio e a placa selada utilizando um selante de placa a laser de díodo de transmissão Fusion (KBioscience UK Ltd) . A placa foi então submetida a ciclo térmico sob as seguintes condições num Hidrocycler (KBioscience UK Ltd): 94°C durante 15 minutos ativação de início a quente 94°C durante 20 segundos 61- 55°C durante 60 segundos (diminuindo 0,8°C por ciclo) 10 ciclos do processo acima 94°C durante 20 segundos 55 °C durante 60 segundos 26 ciclos do processo acima

Após o ciclo térmico a fluorescência associada com cada poço foi determinada utilizando um leitor de placas BMG Pherastar. Cada poço foi lido três vezes às seguintes combinações de comprimentos de onda. excitação FAM: 485nm, emissão FAM: 520nm excitação HEX: 535nm, emissão HEX: 556nm excitação ROX: 575nm, emissão ROX: 610nm

Os dados resultantes foram então representados graficamente como sinal FAM dividido por ROX no eixo X, e sinal HEX dividido por ROX no eixo Y.

Conforme pode ser observado a partir do gráfico de dispersão da FIG. 4, são visíveis três grupos discerníveis associados com os respetivos genótipos demonstrando claramente a eficácia da tecnologia de deteção. EXEMPLO 2

Seguindo um protocolo semelhante ao descrito no Exemplo 1, foram levados a cabo ensaios para comparar a utilização de oligonucleótidos etiquetados com fluorescência das configurações (i) sem modificação S, (ii) modificação semi-S (fosforotioatos alternativos) e (iii) modificação S total. Os dados gerados são apresentados na FIG. 5. Os dados mostrados para o Ensaio 1 demonstram a utilização das configurações (i) , (ii) e (iii) (acima); os dados para o Ensaio 2 demonstram as configurações (i) e (ii) . Em ambos ensaios os oligonucleótidos de extinção não tiveram modificação com fosforotioato.

Foi observada especificidade potenciada e amplificação por controlo sem molde reduzida (veja-se o gráfico de dispersão na parte inferior esquerda) com todas as variantes de flúores modificados com fosforotioato. A utilização de modificação por fosforotioato em todas as bases do oligonucleótido modificado por fluorescência teve algum efeito sobre a velocidade de PCR e a intensidade do sinal. A utilização de modificação por fosforotioato de bases alternadas dos iniciadores etiquetados com flúor (referida como modificação semi-S) em conjunto com agentes de extinção não modificados foi constatada como sendo ótima para discriminação e intensidade de sinal potenciadas da PCR.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • EP 1726664 A [0003] • WO 0142505 A [0037] • WO 0186001 A [0037]

Documentos de não patente citados na descrição • MORETTI, T. et al. Enhancement of PCR amplification yield and specificity using AmpliTaq Gold DNA polymerase. BioTechniques, 1998, vol. 25, 716-22 [0006] • Nucleic Acids Res, 2008, vol. 36 (20), el31 [0006] • VERMA S. ; ECKSTEIN, F. MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES: Synthesis and Strategy for Users. Annu. Rev. Biochem., 1998, vol. 67, 99-134 [0008] • Curr Protoc Nucleic Acid Chem., March 2009 [0008] • NAWROT B ; REBOWSKA B. Unit 4.34. DNA oligonucleotides containing stereodefined phosphorothioate linkages in selected positions [0008] • Nucl. Acids Res., 2003, vol. 31 (3), el [0009] • KENNETH R. TINDALL ; THOMAS A. KUNKEL. Biochemistry, 1988, vol. 27 (16), 6008-6013 [0009] • ZHANG, J. ; LI, K. Single-Base Discrimination Mediated by Proofreading 3' Phosphorothioate-Modified Primers . Molecular Biotechnology, 2003, vol. 25, 223-227 [0009] • BRAITHWAITE ; ITO. Nucleic Acids Res. , 1993, vol. 21, 787-802 [0038] • Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1994, vol. 91, 2216-2220 [0038]

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um método para a deteção de um produto de extensão de iniciadores produzido na presença de uma polimerase carecendo de atividade exonuclease 3' -> 5', o método compreendendo as etapas de: a) proporcionar pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente que hibridam entre si em solução livre para formar um par extinto fluorescente, que após introdução de uma sequência complementar com uma ou ambas sequências gera um sinal mensurável quando a sequência complementar é hibridada com uma das pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas, em que pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos contém pelo menos um grupo fosforotioato; b) proporcionar pelo menos um iniciador e iniciar a reação de extensão de iniciadores a partir do pelo menos um iniciador utilizando uma polimerase carecendo de atividade exonuclease 3' a 5' gerando desta forma uma sequência complementar a pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente; e c) medir o sinal detetável que é gerado quando a sequência complementar é hibridada com uma das pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente.
2. Um kit para a deteção de um produto de extensão de iniciadores produzido na presença de uma polimerase carecendo de atividade exonuclease 3' -> 5', que compreende 1) pelo menos duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente que hibridam entre si em solução livre para formar um par extinto fluorescente, que após introdução de uma sequência complementar com uma ou ambas sequências gera um sinal mensurável quando a sequência complementar é hibridada com uma das duas sequências de oligonucleótidos etiquetadas individualmente; e 2) uma polimerase carecendo de atividade exonuclease 3' a 5'; em que pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos contém pelo menos um grupo fosforotioato, em que pelo menos uma das bases internas da pelo menos uma sequência de oligonucleótidos contém um grupo fosforotioato e em que a pelo menos uma sequência de oligonucleótidos que contém pelo menos um grupo fosforotioato tem 20-80%, opcionalmente 30-70%, das bases modificadas por um grupo fosforotioato; e opcionalmente em que as bases modificadas são separadas por pelo menos uma base não modificada, e/ou em que bases alternativas são fosforotioatos. 3. 0 método ou kit de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a primeira e segunda sequências de oligonucleótidos têm Tm (temperatura de fusão) diferente, opcionalmente a) em que uma da primeira e segunda sequências de oligonucleótidos tem uma Tm que é igual ou inferior à Ta (temperatura de hibridização) da reação de extensão de iniciadores, ou b) em que uma da primeira e segunda sequências de oligonucleótidos tem uma Tm que é superior à Ta da reação de extensão de iniciadores.
4. Um método para a deteção de um produto de extensão de iniciadores produzido na presença de uma polimerase carecendo de atividade exonuclease 3' 5' utilizando PCR, o método compreendendo as etapas de: a) proporcionar uma primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente e pelo menos uma segunda sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente, a primeira e segunda sequências de oligonucleótidos tendo Tm diferentes, nas quais a primeira e segunda sequências de oligonucleótidos hibridam entre si em solução livre para formar um par extinto fluorescente e pelo menos um iniciador, uma da primeira e segunda sequências de oligonucleótidos tendo uma Tm que é igual ou inferior à Ta do processo de PCR, em que pelo menos uma das sequências de oligonucleótidos contém pelo menos um grupo fosforotioato, o pelo menos um iniciador compreendendo pelo menos um iniciador com cauda não etiquetada, o iniciador com cauda não etiquetada tendo uma região de cauda, a região de cauda compreendendo uma sequência de oligonucleótidos complementar com uma sequência de oligonucleótidos da segunda sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente, a primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente sendo uma iniciador a partir do qual é iniciada síntese de ADN após uma sequência complementar à primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente ter sido gerada durante o processo de PCR, tal que a segunda sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente já não seja capaz de hibridar com a primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente, pelo qual é gerado um sinal mensurável; b) iniciar a reação de extensão de iniciadores a partir do pelo menos um iniciador utilizando uma polimerase carecendo de atividade exonuclease 3' a 5' gerando desta forma uma sequência complementar à primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente; e c) medir o sinal detetável que é gerado quando a sequência complementar é hibridada com a primeira sequência de oligonucleótidos etiquetada individualmente.
5. Um método ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que um dos oligonucleótidos etiquetados individualmente é mais de 10 bases mais curto do que o outro.
6. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que o processo de PCR é monitorizado em tempo real em cada ciclo ou após uma série de ciclos onde a reação não gerou ainda de outra forma produto suficiente para criar um sinal mensurável através de diminuição da temperatura da reação para permitir que ocorra hibridação.
7. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que o dito outro dos oligonucleótidos com etiqueta única tem uma Tm que é superior à Ta.
8. Um método ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o dito um dos oligonucleótidos com etiqueta única tem a etiqueta de agente de extinção do par extinto fluorescente.
9. Um método de acordo com quaisquer reivindicações 1, 3a 8 em que pelo menos uma das bases internas do (s) oligonucleótido(s) contendo grupo fosforotioato é um fosforotioato, e/ou em que 20-80%, opcionalmente 30-70%, das bases do(s) oligonucleótido(s) contendo grupo fosforotioato são fosforotioatos.
10. Um método ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para utilização em genotipagem por SNP com base em PCR específica de alelo.
11. Um método ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para monitorizar a produção de um amplicão através do ensaio de nuclease 5' , em que o ensaio de nuclease 5' é empregue para realizar reações de discriminação alelica.
12 . Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 a 11, em que o produto de extensão de iniciadores é monitorizado através da utilização unicamente de hibridação, opcionalmente em que o produto de extensão de iniciadores é monitorizado através da utilização de hibridação somente após a PCR.
13. Um método ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que os pares oligo de extinção fluorescentes variam desde 6 pb até 100 pb, opcionalmente variam desde 6 pb até 100 pb mas não coincidem em comprimento.
14. Um método ou um kit de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que pelo menos uma das bases de um oligonucleótido etiquetado com f luoróforo contém pelo menos um grupo fosforotioato.
15. Um método ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os pares oligo de extinção fluorescentes são: a) um do par etiquetado com um fluoróforo e o outro com uma molécula de extinção não fluorescente; e/ou b) modificados para serem resistentes à degradação por nucleases; e/ou são etiquetados com moléculas que são sensíveis à distância.