CN109097456A - 单分子高保真扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于平行高通量单分子高保真扩增方法。PCR引物进行3'末端为磷酸根，对PCR引物3'末端进行修饰，用硫代磷酸取代磷酸根，得到修饰PCR引物。所述基于平行高通量单分子高保真扩增方法，解决了扩增单分子不能使用高保真合成酶的技术缺陷，该方法能够有效的进行单分子扩增，提供足够量的DNA为后续检测使用。相比PCR的方法，该方法降低了误差率，方法操作简便，更便于临床检测采用。

Description

单分子高保真扩增方法

本申请是申请日为2014年11月28日、申请号为201410709579.9、发明名称为一种 PCR引物及其修饰方法及基于平行高通量单分子高保真扩增方法的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及PCR扩增技术领域，具体地，涉及一种PCR引物修饰方法及基于平行高通量单分子高保真扩增方法。

背景技术

过去几十年里，随着DNA技术水平的提高，人类基因工程以及千人基因组计划、癌症基因组计划、Meta-Hit计划等重大国际合作项目的相继开展，基因组研究日渐被推向高潮。单分子DNA扩增在基因组测序中的应用日趋重要，几乎所有的测序技术都需要扩增单分子DNA片段。目前，所有的单分子DNA模板扩增所使用的各种合成酶中，有错误率较高的Taq家族、高保真的Klenow Fragment(DNA Polymerase I)、KAPA HiFi家族、高保真的Phusion家族以及高保真的Q5家族等。

对于普通的酶合成链式反应(PCR)来说，以上DNA合成酶都可以较好的扩增DNA模板，达到大量扩增DNA的作用。但是对于基因组测序来说，对单分子平行高效高保真扩增提出更为严格的要求。目前大部分PCR扩增方法都采用错误率较高的Taq家族合成酶，而对于使用高保真的合成酶来扩增单分子DNA片段，目前仍尚未得到技术解决。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种基于平行高通量单分子高保真扩增方法，解决了扩增单分子不能使用高保真合成酶的技术缺陷，该方法能够有效的进行单分子扩增，提供足够量的DNA为后续检测使用。相比PCR的方法，该方法降低了误差率，方法操作简便，更便于临床检测采用。

本发明的技术方案如下：

一种PCR引物，所述PCR引物的3'末端的碱基具有硫代磷酸根。

所述的PCR引物，具有硫代磷酸根的碱基个数为1-4个。

一种PCR引物修饰方法，对PCR引物3’末端的碱基进行修饰，用硫代磷酸根取代磷酸根。

所述的PCR引物修饰方法，用硫代磷酸根取代磷酸根的方法为：在合成PCR引物时，3'末端的碱基用硫代磷酸根链接的碱基进行合成。

对PCR引物3'末端的硫代磷酸根链接的碱基具有1-4个。

比如，引物序列为NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN(N表示A/T/C/G)，将最后2个碱基用硫代磷酸根保护后，引物为：NNN NNN NNN NNN NNN NNN N＊N＊N(其中＊表示硫代磷酸根修饰)。修饰的方法可以选择修饰至少最后1位，一般建议修饰倒数2-4位。比如：NNNNNN NNN NNN NNN NNN N＊N＊N；或者NNN NNN NNN NNN NNN NNN＊N＊N＊N；或者NNN NNNNNN NNN NNN NN＊N＊N＊N＊N。

一种基于平行高通量单分子高保真扩增方法，对PCR引物3'末端的碱基进行修饰，用硫代磷酸根取代磷酸根，得到修饰PCR引物；用修饰PCR引物，DNA模板和高保真合成酶进行扩增反应。

所述高保真合成酶选自高保真的Klenow Fragment(DNA Polymerase I)、KAPAHiFi家族、高保真的Phusion家族或高保真的Q5家族。

用硫代磷酸根替代核苷酸的磷酸根，可以阻碍高保真酶对模版的外切。比如新英格兰生物实验的热电Phusion高保真DNA聚合酶，具有5'→3'聚合酶活性，3'→5'外切酶活性，并会产生平端产品。将引物3'端碱基中的磷酸根用硫代磷酸根替代，Phusion高保真DNA聚合酶将不再发挥3'→5'外切酶活性将从引物降解3'端降解，从而起到保护引物的作用。该保护在微量模版、单分子模版的PCR反应中至关重要，决定了PCR的成败。

一种用上述PCR引物的emulsion PCR。

Emulsion PCR主要涉及到两相，一相为PCR Mix的水相，该部分包含PCR所需要的各种试剂；另一相为油相，一般有几种油组成。通过两相混合，形成油包水的反应体系。每个液滴都是一个独立的反应室，所以emulsion PCR可以实现高通量平行PCR，而且每个PCR相互隔离互不干扰，不受影响。emulsion PCR广泛用于二代测序的样本制作。在emulsion PCR中，由于反应需要优化趋于单分子模版PCR反应，所以如果利用高保真酶作为反应的合成酶，同样会遇到模版太少时，引物会被错误的当作错误产物被高保真酶切掉的情况。所以，也需要将引物的3'末端进行修饰，将磷酸根替换为硫代磷酸根，从而保护引物，使得反应可以利用高保真酶，提高准确度，降低PCR所引入的错误。

一种用上述PCR引物的ddPCR or dPCR(Digital Droplet PCR)。

在Digital PCR中，由于反应需要优化趋于单分子模版PCR反应，所以如果利用高保真酶作为反应的合成酶，同样会遇到模版太少时，引物会被错误的当作错误产物被酶切掉。因此，如果该反应要使用高保真酶的话，也需要将双向引物的3'末端进行修饰，将磷酸根替换位硫代磷酸根，从而保护引物，使得反应可以利用高保真酶，提高准确度，降低PCR所引入的错误。

本发明的有益效果为：本发明所述扩增方法对平行高通量单分子扩增反应中的引物做了精密设计，在普通的单分子扩增PCR反应中，对其引物进行3'末端修饰，用硫代磷酸取代原有的磷酸根，从而保护3'末端，在DNA模板量非常少的情况下，避免高保真合成酶错误的将引物作为合成错误的片段进行消化碎化，阻止扩增反应的进行。做此修饰之后，以上各种高保真合成酶均可作为单分子扩增的DNA合成酶使用，可以达到超低错误率和足够量的DNA，供后续研究使用。

附图说明：

图1，使用修饰PCR引物和没修饰PCR引物进行ePCR的产物琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

一种PCR引物，所述PCR引物序列如下：

SEQ ID NO.1(5'→3')：CTC TGA ATG TGA CCA GAC CTG＊C＊C

SEQ ID NO.2(5'→3')：CTA CGA GAC GCA ACC GCA ATC＊A＊G

所述PCR引物的修饰方法如下：

上述PCR引物3'末进行修饰，用硫代磷酸根取代磷酸根，其中“＊”表示硫代磷酸根。具体而言，上述PCR引物在合成时，3'末端的碱基用硫代磷酸根链接的碱基替代磷酸根链接的碱基进行合成。

实施例2：

一种PCR引物，所述PCR引物序列如下：

SEQ ID NO.3(5'→3')：CTC TGA ATG TGA CCA GAC CT＊G＊C＊C

SEQ ID NO.4(5'→3')：CTA CGA GAC GCA ACC GCA AT＊C＊A＊G

所述PCR引物的修饰方法如下：

上述PCR引物3'末进行修饰，用硫代磷酸根取代磷酸根，其中“＊”表示硫代磷酸根。具体而言，上述PCR引物在合成时，3'末端的碱基用硫代磷酸根链接的碱基替代磷酸根链接的碱基进行合成。

实施例3

一种基于平行高通量单分子高保真扩增方法，PCR扩增体系为Pusion High-Fidelity PCR Kit，所用修饰PCR引物如下：

硫代磷酸根修饰的引物：

Forward Primer：SEQ ID NO.5(5'→3')：CCGGTAATGAAAAAGGCGAAC＊T＊G

Reverse Primer：SEQ ID NO.6(5'→3')：CGCCGAAGTAGGAAAGC＊T＊C。

同时，以相同序列的没有修饰的PCR引物作为对照进行扩增：

未经硫代磷酸根修饰的引物：

Forward Primer：SEQ ID NO.7(5'→3')：CCGGTAATGAAAAAGGCGAACTG

Reverse Primer：SEQ ID NO.8(5'→3')：CGCCGAAGTAGGAAAGCTC。

PCR扩增体系如下：

PCR循环条件为：98℃，1min,1个循环；98℃，5-10s,45-72℃,10-30s,72℃,15-30s，30个循环；4℃保存。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示。其中泳道M是DNAmarker,泳道1是使用修饰PCR引物的ePCR产物，而泳道2是使用未经修饰引物的ePCR产物。从图中可见，使用未经修饰引物的ePCR未产生正确的产物。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (10)

1.一种单分子高保真扩增方法，其特征在于，

包括：

对PCR引物3'末端的碱基进行修饰，用硫代磷酸根取代磷酸根，得到修饰后的PCR引物；并且

用所述修饰后的PCR引物、DNA模板和高保真合成酶进行扩增反应，

其中，所述高保真合成酶选自高保真的Klenow Fragment(DNA Polymerase I)、KAPAHiFi家族、高保真的Phusion家族或高保真的Q5家族。

2.如权利要求1所述的单分子高保真扩增方法，其特征在于，

所述碱基为所述3'末端的倒数1至4位。

3.如权利要求2所述的单分子高保真扩增方法，其特征在于，

所述碱基为所述3'末端的倒数2至4位。

4.如权利要求1所述的单分子高保真扩增方法，其特征在于，

所述高保真合成酶为高保真的Phusion家族。

5.如权利要求4所述的单分子高保真扩增方法，其特征在于，

所述高保真合成酶为热电Phusion高保真DNA聚合酶。

6.如权利要求1所述的单分子高保真扩增方法，其特征在于，

所述DNA模板为单分子DNA模板。

7.如权利要求2或3所述的单分子高保真扩增方法，其特征在于，

所述修饰后的PCR引物序列为：

SEQ ID NO.1(5'→3')：CTC TGA ATG TGA CCA GAC CTG＊C＊C，

SEQ ID NO.2(5'→3')：CTA CGA GAC GCA ACC GCA ATC＊A＊G，

其中，*表示硫代磷酸根。

8.如权利要求2或3所述的单分子高保真扩增方法，其特征在于，

所述修饰后的PCR引物序列为：

SEQ ID NO.3(5'→3')：CTC TGA ATG TGA CCA GAC CT＊G＊C＊C，

SEQ ID NO.4(5'→3')：CTA CGA GAC GCA ACC GCA AT＊C＊A＊G，

其中，*表示硫代磷酸根。

9.如权利要求1所述的单分子高保真扩增方法，其特征在于，

所述修饰后的PCR引物序列为：

SEQ ID NO.5(5'→3')：CCGGTAATGAAAAAGGCGAAC＊T＊G，

SEQ ID NO.6(5'→3')：CGCCGAAGTAGGAAAGC＊T＊C，

其中，*表示硫代磷酸根。

10.一种PCR扩增体系，其特征在于，

包括：