RS55868B1 - Sistem za detekciju lančane reakcije polimeraze pomoću oligonukleotida koji sadrže fosforotioatnu grupu - Google Patents

Description

(0001] Pronalazak se odnosi na postupke i kitove za detekciju nuklesnske kiseline u test sistemu.

STANJE TEHNIKE

[0002] Lančana reakcija poiimeraze {PCR} je moćna metodazabrzo i eksponencijalno umnožavanje ciljnih sekvenci nukleimke kiseline. PCR omogućava razvoj karakterjzacije gena i tehnologija molekularnog kloniranja koje uključuju direktno sekvenciranje DNK koja se umnožava PCR-om, određivanje varijacija u alelima, i detektovanje poremećaja infektivnih i genetskih boiesti. PCR se izvodi u ciklusima koji se ponavljaju, gde se topiotorn denaturiše DNK matrica koja sadrži ciljnu sekvencu, spajanje suprotnih prajmera sa komplementarnim DNK lancima,, i efongacija sjedinjenih prajmera DNK polimerazom, Višestruki ciklusi PCR-a imaju23mzuftat eksponencijalno umnožavanje nukleotiđne sekvence koja je obeležena bočnim prajmerima za umnožavanje. Ugrađivanje termostabilne DNK poiimeraze u PCR protokol otklanja potrebu za uzastopnim dodavanjima enzima i dozvoljava povećane temperature za spajanje i eiongađju prajmera koje pojačavaju specifičnost spajanja prajmenmatrica* Taq DNK poiimeraza stoga ima ulogu da poveća specifičnost, i jednostavnost PCR-a.

[0003] U mnogim reakcijama koje imaju osnovu u PCR-u, koristi se sistem23proizvodnju signala, na prirner, da bi se detefctovato dobijanje umnoženog proizvoda. Jedan tip sistema koji proizvodi signal kojt se koristi u reakcijama koje imaju osnovu u PCR-u je sistem fluorescentnog transfera energije {FRET} pd Čemu detektor nukteinskih kiseiina uključuje donorske i akceptorske grupe. FftET sistemObeležavanja ima brojne prednosti u odnosu na druge sisteme2a obelezavanje.. uključuje mogućnost izvođenja homogenih testova pri čemu nije neophodan korak odvajanja vezanog u odnosu na nevezano obeleženš detektor nukleinskih kiselina. U mnogo poznatih tehnika osnovni problem je vezan za sintezu fluorescentnih oifgonukJeotida koji su dvostruko obeiezent. Evropska prijava patenta EP1726S64 prikazuje sistem detekcije koji prevazilazl ovaj problem pomoću oiigonukleotiđrob sekvenci koje su jednom obeležene, koje imaju različite temperature topljenja (Tro) koje hibridizuju jedna sa drugom slobodno u rastvoru da bi se obrazovao fluorescentno prigušeni par koji nakon uvođenja komplementarne sekvence za jednu ili obe sekvence proizvodi signal koji mole da se izmeri, gde jedna od sekvenci sadrži Trn ispod temperature spajanja (Ta) u PCR procesu. {0004}U sistemima detekcije, korištenje obeleženog detektora nuktemsfcih kiselina, sa visokom preciznošću umnožavanja je od ključnog značaja. Zbog prirode PCR procesa i Taq poiimeraze takvi postupci mogu da razviju altenativne sporedne reakcije do željene reakcije poiimerizađje. Na primer, PCR mole da razvije nespecifično umnožavanje kada se reakcija odvija na sobnoj temperaturi. Na sub-PCR temperaturama, Taq poiimeraza zadržava deo svoje aktivnosti i stoga prajmeri u elongaciji koji nisu spojeni po komplementarnosti, dovode do stvaranja neželjenih proizvoda. Novi regšon koji se sintetiše onda služi kao DNK matrica za dalju eiongaciju prajmera i sintezu neželjenih proizvoda umnožavanja. Međutim, ukoliko se reakcija zagreva do temperatura od približno 5GT ili preko, pre nego Sto poltmerizađja počne, strogost spajanja prajmera se povećava i sinteza neželjenih PCR proizvoda se izbegava ili je smanjena.

[0005]Prajmer-dimer je takođe uobičajena sporedna reakcija koja pogađa PCR. Nakupljanje prajmer-dimera se događa zbog hibridizacije i elongacije prajmera jednog sa drugim. Formiranje prajmer-dimera dovodi do smanjenja reagenasa i stoga do sveukupnog smanjenja PCR efikasnosti.

{0006!PCR sa 'vrućim početkom' je postupak kojom se smanjuje nespecifično umnožavanje i stoga ograničava formiranje prajmer-dimera i mnogi različiti pristupi su razvijeni da se ovo postigne, vtdeti, na primer, Moretti, T. et al.Enhancement of PCR amplifkatšon yielđ and specificitv using AmpliTaq Gotd DNA poivmerase, BioTecbniques 25,716-22 (1998} i Hot Start PCR with beat-activa table primers: a novef approach for improved PCfi performance Nucieic Acids Res {2008} 36{20}: e!3i. Međutim, takve tehnike postižu samo delimično ublažavanje probiema, Kao biio koja greška u sekvencama, reakcije koje imaju osnovu u nepoiimerizaciji ili pogrešnom vezivanju prajmera kao što je dlmeršzacija prajmera mogu da uzrokuju proizvodnju slabog signala iii pogrešnog signaia koji se proizvodi, posebno u aie! specifičnom PCR-u, pa je poželjno dodatno poboljšanje ovih slabih ili netačnih signala.

[0007}Fosforotioati (ili S-oligotidi) su varijanta normalne DNK pri Čemu je jedan od kiseonika koji ne stvaraju vezu zamenjen sumporom. Primeri fosfodfestarskth i fosforotioatnih intermikleotidnih veza su dole prikazani:

[0008JFosforotioatna veza zamenjuje sa atomom sumpora kiseonik koji ne uspostava veze u bočnom fosfatnom lancu oligonukleotida, čime intemukleotldna veza postaje otporna na degradaciju proteazom. Fosforotioati se uvode na ili 5'- ili 3'-kraju oliga da se spreći degradacija egzonukleazoro. U antisens oltgonukleotidima, fosforotioati se takođe interno uvode da ograniče napad endonukieaza, Sinteza oiigonukleotida koji sadrže fosforotioate se opisuje, na primer, u Verma S.and Eckstein, f.(1998).

MOOIRB) OUGONUCLEOTtDES; Synthesis and Strategy for Users. Annu. Rev. Biochem. 1998. 67:99-134 and Curr Protoc Nucieic Acid Chem.2009 Mar; Chapter 4:linrt 4.34.ĐHAoiigonucleotiđes containing stereodefined phosphorothioate linkages in selecteđ positions. Nawrot B, Rebowska 8.

|0009]Kako je gore pomenuto, sulfurizacija internukleotidne veze smanjuje đelovanje endo-i-egzonukleaza2 uključujući S' ->3' i 3'~3>5' DNK POL i egzonukleaze, nukieaza SIfPl, RNKaza, nukieaza iz seruma, i fosfodiesteraze iz otrova zmije. Pokazana je osobina rezistentnosti na nukieazu S-ofšga zajedno sa PCR-om sa visokom preciznošću sa upotrebom egzo4DNK poiimeraza, vidi, na primer, Nucl. Acids Res, (2003) 31 (3): e7. doi;10.1093/nar/gngGO7. Taq ONA polymerase possesses no 3'-»5' Exonuclease (Kenneth R. Ttndali, Thomas A.Kunkel, Biochemistry, 19S8,,27 (16), p 6008-6013}. Takođe je zabeleženo unapređeno razlikovanje poltmorftzarna u jednom nukleotidu pomoću fosforotioatnih modifikacija u prisustvu polimeraze koja ispravlja greške. Fosforottoaeija povećava specifičnost, smanjuje učestalost prajmer-dimer interakcija, međutim, zabeieženo je da je funkcionalnost 3'nuklesze neophodna za poboljšanje PCR-a i pokazano je da zajedno sa alel specifičnim PCR-om upotreba S-oiiga ne daje prednost kada se koristi zajedno sa Taq 0NK poltmerazom, videti, na primer, Zhang, J. and Li, K. {2003} Singie-Base Discrimination Mediateđ by Proofreading 3' Phosphorothioate-Modifted Primers. Molecuiar Biotechnofogy 25,223-227.

{0010]Postoji potreba za lakom sintezom., niskim troškovima, i pouzdanim sistemima za detekciju za upotrebu u detekciji proizvoda elongacije prajmera, npr. homogenim PCR testovima, koji rešavaju probleme na koje nailaze postojeći sistemi za detekciju za PCR. Suprotno, konvencionalnim naučnim saznanjima, predmetni pronalazak je zasnovan na saznanju da se S-oiigozt mogu koristiti uspešno, i dovode do poboljšanja, u test sistemima za detekciju nukleinskih kiselina.

SAŽETAK PRONALASKA

[OOlljPredmetni pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima od 1 do 15.

[0012]Ovaj opis pronalaska obezbeđuje postupak za smanjenje nespecifičnog umnožavanja i/iil obrazovanje prajmer-dimera u reakciji elongacije prajmera zavisnoj od matrice koja obuhvata odvijanje reakcije elongacije prajmera u prisustvu polimeraze koja nema 3' ->5' nukleaznu aktivnost, u kome jedan ili više prajmera sadrži najmanje jednu fosforotioatnu grupu.

(0013] Takođe su obezbeđeni kitovi i kompozicije za upotrebu u takvim postupcima.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0014]1) Slika 1 je jednostavna šema reakcije za direktnu detekciju DNKsekversce koja se izvodi u postupku prema pronalasku. 2) Slika 2 je jednostavna šema reakcije za indirektnu (realno-vremej detekciju DNK sekvence koja se izvodi u postupku prema pronalasku. 3) Slika 3 je jednostavna šema reakcije za indirektnu {krajnja tačkaj detekciju DNK sekvence u SNP genotipizaciji koja se izvodi u postupku prema pronalasku.

4) Slika 4 pokazuje podatke koji nastaju korištenjem testa koji se opisuje do!e u prime rit 1.

5} Slika 5 pokazuje poređenje podataka koji nastaju u test sistemima u kojima se koriste oligonukleotidne sekvence koje sadrže fosforotioatne grupe I ollgonukieotide koji sadrže ne-fosforotioatne grupe kao što se opisuje dole u prime ru 2.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0015]U skladu sa izlaganjem, obezbeđen je postupak za smanjenje nespecifičnog umnožavanja i/iii

formiranja prajmer-dimera u reakciji elongacije prajmera koja je zavisna od matrice i koja obuhvata odvijanje reakcije elongacije prajmera u prisustvu polimeraze koja nema 3'~>5' nuMeaznu aktivnost, u kojoj jedan ili više prajmera sadrži najmanje jednu fosforotioatnu grupu.

[0016]Prikazani postupak poželjno obuhvata upotrebu najmanje dve oligonukieotidne sekvence koje su

jednom obeležene koje hibridizuju jedna sa drugom slobodno u rastvoru da bi se formirao fluorescentno prigušeni par, koji nakon uvođenja komplementanre sekvence prema jednoj iii obe sekvence daje signai koji mole da se izmeri, gde su jedan ili vsse prajmera modifikovani sa najmanje jednom fosforotšoatnom grupom.

[0017]U jednom izvođenju iziaganja>dve sekvence oligonukleotida koje su jednom obeležene imaju

različite Tm. Kada sekvence oligonukleotida imaju različite Trn onda jedna od sekvenci mole da ima Tm koji je na ili ispod Ta reakcije elongacije prajmera npr,, PCR procesa. Druga može da ima Tm koji je pogodno ne ispod Tm već poželjno iznad i poželjnije znatno iznad njega. U jednom izvođenju prigušeni ("quenched") ofigonukleotid ima Tm iznad Ta.

[0018]Formula koja se uobičajeno koristi za određivanje Tm sekvence je Tm~4{G+C}+2(A+T), i stoga

niska Tm jedne sekvence može, u principu, da se postigne kraćom dužinom i/ili smanjenim odnosom (G*C}/{A+T) u odnosu na drugu sekvencu zabeleženog para.

[0019]U nekim aspektima izlaganja poželjno je da jedna od sekvenci oligonukleotida koje su jednom obeležene bude više od 10 baza duža od druge i poželjno najmanje 15 baza duža.

[0020]Pronalazak obezbeđuje postupak za detekciju proizvoda elongacije prajmera koji se proizvodi u prisustvu polimeraze koja nema 3'->5' egzonukleaznu aktivnost, postupak se sastoji iz koraka: a} obezbeđivanja najmanje dve sekvence oligonukleotida koje su jednom obeležene, npr., sa razlikama u Tm, koje hibridizuju jedna sa drugom u slobodnom rastvoru da bi se formirao fluorescentno prigušeni par, koji nakon uvođenja komplementarne sekvence prema jednoj ili obe sekvence, stvara signal koji može da se izmeri, kada komplementarna szkvmcs bibriđizuje sa jednom od najmanje dve sekvence oligonukleotida koje su jednom obeležene, u kojima najmanje jedna od sekvenci oligonukleotida sadrži najmanje jednu fosforotioatnu grupu;

b) obezbeđivanja najmanje jednog prajmeratzapočinjanje reakcije elongacije prajmera čime se stvara komplementarna sekvenca najmanje jednoj od sekvenci oligonukleotida koje su jednom

obeležene; i

c) merenja uočljivog signala koji se stvara kada komplementarna sekvenca bibriđizuje sa jednom od najmanje dve oligonukleotidne

sekvence koje su jednom obeležene.

[0021] U daljem aspektu pronalaska postupak obuhvata postupak za detekciju proizvoda elongacije prajmera koji se dobija u prisustvu polimeraze koja nema 3'->5"' egzonukleaznu aktivnost korištenjem PCR-a, postupak obuhvata sledeće korake;

a) obezbeđivanje prve sekvence oligonukleotida koja je jednom obeiežena i najmanje druge sekvence koja je jednom obeiežena npr., gde su prva i druga oligonukleotidna sekvenca sa

različitim Tm, pri čemu prva i druga oligonukleotidna sekvenca hibridizuju jedna sa drugom u slobodnom rastvoru da bi se obrazovao fluorescentno prigušeni par i najmanje jedan prajmer, i npr,., gde najmanje jedna od prve i druge oligonukleotidne sekvence ima Tm koji je na ili ispod Ta PCR procesa, gde najmanje jedna od ollgonukleotiđnih sekvenci sadrži najmanje jednu fosforotiaotnu grupu, najmanje jedan prajmer koji obuhvata najmanje jedan neobeleženi krajnji prajmer, neobeleženi krajnji prajmer koji Ima krajnji region, krajnji region koji se sastoji iz oligonukleotidne sekvence koja je komplementarna sa oiigonukleotidnom sekvencom druge oligonukleotidne sekvence koja je jednom obeiežena, prva oligonukleotidna sekvenca koja je jednom obeiežena je forma prajmera sa kojom započinje DNK sinteza jednom kada nastane komplementarna sekvenca prema prvoj ofigonukleotidnoj sekvenci koja je jednom obeiežena u toku PCR procesa, tako da druga oligonukleotidna sekvenca koja je jednom obeiežena više ne može da bibriđizuje sa prvom oiigonukleotidnom sekvencom koja je jednom obeiežena, pri čemu se detektuje signal koji može đa se izmeri.

b) iniciranje reakcije elongacije prajmera čime se stvara komplementarna sekvenca sa/prema najmanje jednoj od ollgonukleotiđnih sekvenci koje su jednom obeležene; i

cj metenje uočljivog signala koji nastaje kada komplementana sekvenca hiforiđizuje sa prvom oiigonukleotidnom sekvencom koja je jednom obeiežena.

[0022] U daljem poželjnom aspektu pronalaska postupak obuhvata postupak za detekciju proizvoda eiongađje prajmera koji se proizvodi u prisustvu polimerazekojanema 3'->5' egzonukleaznu aktivnost korištenjem PCR-a, postupak obuhvata korake: a} obezbeđivanje prve oligonukleotidne sekvence koja je jednom obeiežena i najmanje druge oligonukleotidne sekvence koja je jednom obeiežena, npr. gde su prva i druga oligonukleotidna sekvenca sa različitim Tm, pri čemu prva i druga oligonukleotidna sekvenca hibridizuju jedna sa drugom u slobodnom rastvoru da bi se obrazovao fluorescentno prigušeni par i najmanje jedan prajmer, i npr., gde jedna od prve ili druge oligonukleotidne sekvence jma Tm koji je na ili ispod Ta PCR procesa, u kojima najmanje jedna od oligonukleotidnih sekvenci sadrži najmanje jednu fosfortioatnu grupu, najmanje jedan prajmer sadrži najmanje jedan neobeleženi krajnji prajmer, neobeleženi krajnji prajmer koji ima krajnji region, krajnji region koji sadrži oligonukleotiđnu sekvencu koja je identična ili u osnovi hornoioga sa oiigonukleotidnom sekvencom prve oligonukleotidne sekvence koja je jednom obeiežena, gde je prva oligonukleotidna sekvenca koja je jednom obeiežena prajmer kojim se inicira DNK sinteza jednom kada komplementarna sekvenca prema prvoj oligonukleotidnoj sekvenci koja je jednom obeiežena nastane u toku PCR procesa, tako da druga oligonukleotidna sekvenca koja je jednom obeiežena ne može više da bibriđizuje sa prvom oiigonukleotidnom sekvencom koja je jednom obeiežena, pri Čemu se stvara signal koji može da se izmeri.

bj iniciranje reakcije elongacije prajmera čime se stvara komplementarna sekvenca sa najmanje

jednom od oligonukleotidnih sekvenci koje su jednom obeležene; i

c) merenje uočljivog signala koji se detektuje kada komplementarna sekvenca hibridizuje sa prvom oiigonukleotidnom sekvencom koja je jednom obeiežena.

j0023]Pronalazak dodatno obezbeđuje kit za detekciju proizvoda elongacije prajmera koji se proizvodi u prisustvu polimeraze koja nema 3'?5' egzonukleaznu aktivnost, koja obuhvata 1} najmanje dve oligonukleotidne sekvence koje su jednom obeležene npr., sa različitim Tm, koje hibridizuju jedna sa drugom u slobodnom rastvoru i obrazuju fluorescentno prigušeni par, gde se nakon uvođenja komplementarne sekvence sa jednom ili obe sekvence stvara signal koji može da se izmeri kada komplementarna sekvenca hibridizuje sa jednom od najmanje dve oligonukleotidne sekvence koje su jednom obeležene; s 2} poiimeraza koja nema 3' ka 5' egzonukleaznu aktivnost; u kojoj najmanje jedna od oligonukleotidnih sekvenci sadrži najmanje jednu fosforottatnu grupu u kojoj najmanje jedna od unutrašnjih baza od najmanje jedne oligonukleotidne sekvence sadrži fosforotloatnu grupu i u kojoj najmanje jedna oligonukleotidna sekvenca koja sadrži najmanje jednu fosforotloatnu grupu ima 20-80%, opciono 30-70% baza koje su izmenjene sa fosforotioatnom grupom; i opciono u kojima su izmenjene baze odvojene sa najmanje jednom bazom koja nije izmenjena, i/ifi u kojima su naizmenične baze fosforotioati.

[0024]Kitovi prema pronalasku mogu takođe da sadrže druge komponente koje su pogodne za upotrebu u reakcijama ekstenzije prajmera kao što su sofi magnezijuma, dNTP-s itd.

[0025]U predmetnom pronalasku, svi ili najmanje jedan od prajmera koji se koristi u postupcima može da sadrži baze koje su izmenjene fosforotioatom. Broj fosfođiestarsk'th veza koji je zamenjen sa fosforotioatima u svakom datom prajmeru može đa ima opseg od jedne do svih fosfori iestarskih veza koje su zamenjene fosforotioatima. Prajmer(i) mogu da sadrže fosforotioate na 5' i/ili 3' krajevima, međutim poželjno je da, kao alternativa ili dodatak takvim modifikacijama na krajevima, najmanje je jedna od unutrašnjih baza prajmera fosforotioat. Naprimer10-9096, 20-80%, 30-70% ili 40-60% baza mogu da budu fosforotioati. U jednom izvođenju baze koje su modifikovane fosforotioatima su odvojene sa najmanje jednom, npr., jednom do tri, nemođifikovanoro {fosfodtestarskom} bazom. U poželjnom izvođenju naizmenične baze u prajmerufjma) su fosforotioati.

[0026] Upotreba fosforotioatnih modifikacija na alternativnim bazama prajmera koji su obeleženi fluoroforom (ovde se označava kao polu-S rnođifkacija) u kombinaciji sa nemođifi kovan im prigušivačima predstavlja poželjno izvođenje pronalaska kako oni daju posebno poboljšano razlikovanje i intenzitet signala u PCR-u.

[0027] Primeri razlikovanja fosforotioatnih-mođifikacija koji mogu da se koriste u pronalasku su dole predstavljeni u prajmerirna koji su obeieženi fluoroforama ili prigušivačima, gde<*>označava fosforotioat:

10028] Oligonukleotidne sekvence koje sadrže najmanje jednu fosforotioatnu grupu za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu da se sintetišu postupcima koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.

[0029] Predmetni pronalazak ima upotrebu u brojnim različitim prsmenama, i posebno je pogodanzaupotrebu u reakcijama koje se zasnivaju na PCR-u, uključujući primenu za detekciju 5NP, za detekciju varijacije u alelima, PCR u realnom vremenu i slično.

[0030] Kako je gore navedeno, predmetni prikaz obezbeđuje postupke pomoću kojih se smanjuje nespecifično umnožavanje i/Hi obrazovanje prajmer-dimera u reakciji elongacije prajmera koja zavist od matrice i za detektovanje stvaranja proizvoda elongacije prajmera u reakcionoj smeši za eSongaciju prajmera, npr,, određivanje da li se proizvodi elongacije prajmera dobijaju u reakciji elongacije prajmera. Proizvodom reakcije elongacije prajmera smatra se mofekul nuklešnske kiseline koji nastaje u reakciji elongacije prajmera koja zavisi od matrice. Reakcije elongacije prajmera koje zavise od matrice su reakcije pri kojima poiimeraza prođužava molekul prajmera nukleinske kiseline koji bibriđizuje sa matricom molekula nukleinske kiseline, gde se redosled baza koje se dodaju na kraj molekula prajmera nukleinske kiseline određuje redosledom baza u matričnom tancu. Reakcije elongacije prajmera koje zavise od matrice obuhvataju zajedno i reakcije umnožavanja i neumnožavanja elongacije prajmera, U nekim izvođenjima predmetnog pronalaska, reakcija elongacije prajmera koja zavisi od matrice u kojoj se stvaranje proizvoda elongacije prajmera detektuje, je reakcija umnožavanja, npr,, reakcija lančane polimeraze (PCR).

[0031] U predmetnom prikazu reakcija elongacije prajmera koja zavisi od matrice u kome se stvaranje proizvoda elongacije prajmera detektuje je reakcija koja sadrži prajmere koji su modifikovani fosforotioatnim grupama u sprezi sa polimerazama koje nemaju 3'->5' nukleaznu aktivnost.

[0032] U primeni postupaka izvođenja prvi korak je da se proizvede smelaprometaza ebngaciju, npr., kompozicija koja uključuje sve elemente koji su neophodni da se dogodi reakcija elongacije prajmera. Na primer sroeša za elongaciju prajmera uključuje najmanje dve oligonukleotidne sekvence koje su jednom obeležene npr., sa različitim Tm, koje hibridizuju jedna sa drugom u slobodnom rastvoru da obrazuju fluorescentno prigušeni par i koji nakon uvođenja komplementarne sekvence prema jednoj Ili obe sekvence stvara signal koji može da se izmeri, gde jedna od sekvenci na primer ima Tm koji je na ili ispod Ta ("FET kasetni par prajmera"), gde najmanje jedna od oligonukleotidnih sekvenci sadrži najmanje jednu fosforotioatnu grupu.

[0033] FET se događa kada su odgovarajući donor fluorescentne energije i akceptor energije blizu jedan u odnosu na drugi. Energija ekscitacije apsorbovana donorom se prebacuje na akceptor koji može da rasipa ovu energiju ili pomoću fluorescentne emisije ukoliko je fluomfora, ili pomoću nefluorescentnih sredstava ukoliko je prigušivač. Donor-akceptorski parsadržidve ffuorofofe koje imaju sprektar koji se preklapa, gde se đonorska emisija preklapa sa akceptorskom apsorpcijom, tako da postoji transfer energije od pobuđene ff uorofore ka drugom Članupara.Nije bitno da pobuđena ffuorofora stvarno fiuoresđra, dovoljno je da pobuđena fluorofora može da efikasno apsorfeuje ekscitacionu energiju i efikasno prebaci na ftuoroforu koja emituje.

[0034] Kao takve FET kaseta|e} koje se koriste u predmetnim postupcima su detektori nukieinskih kiselina u koje spadaju razdvojeni oligonukleotidi sa domenom fiuorofore, gde je pozicioniran donor fluorescentne energije, tj. donor, i drugi oligonukiectiđ sa akceptorskim domenom, gde je pozicioniran akceptor fluorescentne energije, tj, akceptor. Kao što se gore pominje, donor olfgonukieotid uključuje donor ffuoroforu. Oonor fluorofora može da bude postavljena faifo gde u detektoru nukleinske kiseline, ali je tipično prisutna na 5' kraju detektora,

{0035} Akceptorski domen uključuje akceptor fluorescentne energije. Akceptor može da bude postavljen bilo gde u akceptorskom domenu, ali je uobičajeno prisutan na 3' kraju detektora nukleinske kiseline.

{00361 Pored domena fiuorofore i akceptora, akceptorski oligonukleotidi FET kaseta takođe uključuju ciljni vezujući domen nukleinske kiseline, koji se vezuje za ciljnu sekvencu nukleinske kiseline koja nastaje od neobelezenih krajnjih prajmera koji se uključuju u reakciju, npr., pod strogim uslovima hshridizarije (kao što se definiše u daljem tekstu).

{00371 U zavisnosti od prirode oligonukleotida i samog testa, đijni vezujući domen može da bibriđizuje sa regionom proizvoda elongacije prajmera. Na primer, gđe je testSUPtest genotipizacije npr,, gde se koristi univerzalni sistem univerzalne kasetezaprijavljivanje, ciljni vezujući domen bibriđizuje pođ strogim uslovima za ciljno vezujuće mesto proizvoda elongacije prajmera. Fiuorofore za FET oligonukleotidne parove, mogu da se odaberu tako da budu iz slične bemijske familije Ili različite, kao što su cijanin boje, ksanteni ili slično. Fiuorofore od interesa uključuju, alt bez ograničenja boje fluorescetna (npr, 5-karboksifiuorescein (S-FAM), 6~karboksifluorescein (6-FAM}, 2',4',1,4,-tetrahlorofluoresce'tn (TET), 2',4',5',7M,4-heksahlorofluorescefn {HEX), i S'J'-dimetoksi^^S'-dihloro-e-karboksšfluorescein (iO£j), boje cijanina kao što su Cy5, đanzif derivati, boje rođantma (npr,, tetrametil-6-karboksirodamin (TAMRA), i tetrapropano-S-karboksirodamin (ROXj), ĐABSYL, DABCVL, cijanin, kao stoje Cy3, antrahinon, nltrotiazo! i jedinjenja nitroimidazola i slično. Fiuorofore od interesa su opisane u međunarodnim patentnim prijavama WO 01/42505 i VVO 01/86001.

[0038j Pošto je reakciona smešazaelongaciju prajmera proizvedena u inicijalnom koraku predmetnog postupka reakciona smeša za elongaciju prajmera bez 3'->5' egzonukleaze, dalje uključuje enzim koji nema 3'~»5' egzonukleaznu aktivnost. U mnogim izvođenjima, kombinacija polimeraze koja se koristi uključuje najmanje jednu Familiju A, gde termini „Familija A" i „Familija 8", odgovaraju šemi klasifikacije koja se nalazi u Braithwaite & Ito, Nucleic Acids Res. (1993) 21:787-802. Familija A poiimeraza od interesa uključuje: Polimeraze iz Thermus aquaticu$, uključujući poltmerazu koja se javlja u prirodi (Tth) i njene derivate i bomologe. Poiimeraza za upotrebu u pronalasku mole da se koristi u prečišćenom Hi neprečišćenom obliku.

|0039J Druga komponenta reakcione smeše koja se proizvodi u prvom koraku postupaka je matrica ONK. Nukleinska kiselina koja služi kao matrica može da bude jeđnolančana ili dvolančana, gde je nukleinska kiselina tipično dezoksinbonuleinska kiselina (DNK). Oulma matrične nukleinske kiseline može da bude kratka od 50 bp, ali obično je najmanje duzine 100 bp, i često najmanje duzine oko 150 bp, 1 može da bude dužine od 10000 bp ili duža, npr., dužine 50000 bp ili duža, uključujući ekstrakt genomske ONK ili njegov proizvod razgradnje, itd. Nukleinska kiselina može da bude slobodna u rastvoru, okružena sa

jedne ili obe strane nukleinskom kiselinom koja nije matrica, koja se nalazi u vektoru, npr., plazmid i slično, sa jedinim kriterijumom da nukleinska kiselina bude dostupna da učestvuje u reakciji elongacije prajmera. Matrična nukleinska kiselina može da bude prisutna u prečišćenom obliku, Hi u kompleksnoj smest sa drugim nukleinskim kiselinama koje nisu matrice, npr., u pripremi ćelijske DNK.

{00401 Matrična nukleinska kiselina može poticati iz velikog broja različitih izvora u zavisnosti od primene za koju se PCR izvodi, gde takvi izvori uključuju organizme koji sadrže nukleinske kiseline, tj., viruse; prokariote, npr., bakterije arheje,?đjarsobakterije; i eukadote, npr., članove carstva protista, kao sto su fiagelate, amebe i njihovi srodnici, ameboiđni paraziti, cilijate i slično, članove carstva gljiva, kao što su sluzave plesni, acelularne sluzave plesni, celulame sluzave plesni, vođene plesni, prave plesni, konjugacije gljiva, kesaste gljive, zemljišne gljive, nepotpune gljive i slično; biljke kao što su alge, mahovine, jetrenke, rogovnjaci, mahovine, rastavići, paprati, gimnosperme i biljke koje cvetaju zajedno monpkotile i dtkotiie; i životinje uključujući sunđere, članove razdeia kniđarija, npr., meduze, korale i slično, češalj-meduze, crve, rotifere, valjkaste crve, anelide, moluske, artropode, ehinoderme, iirotikecrve, ivertehrate, uključujući reptile, ribe, ptice, zmije i sisare, npr., glodare, primate, uključujući jjude i slično. Matrica nukleinske kiseline može da se koristi direktno iz svojih prirodnih izvora i/ili može da bude prerađena brojnim različitim načinima, kao što je poznato u tehnici. U nekim izvođenjima, matrica nukleinske kiseline mole da bude iz sintetičkog izvora.

{0041]Sfedeća komponenta rsakcione smeše koja se proizvodi u prvom koraku predmetnih postupaka je prajmer koji se koristi u reakciji elongacije prajmera npr., PCR prajmeri (kao što su prednji i reverzni koji se koriste u geometrijskom umnožavanju ili jedan prajmer koji se koristi u linearnom umnožavanju). Svaka reakciona smeša za elongaciju prajmera se sastoji od najmanje dva prajmera {u slučaju linearnog umnožavanja) i obično tri prajmera i češće pet & sedam prajmera u slučaju reakcije SMP genotlpizacije. Reakciona smeša za elongaciju prajmera ima najmanje fluorescentno obeleženi donorski prajmerikomplementarni akceptor, prajmer koji je obeležen prigušivačem u slučaju linearnog umnožavanja gde jedan ili oba prajmera sadrže najmanje jednu fosforotioatnu grupu.

[0042]češće u slučaju eksponenđjainog umnožavanja smeša za elongaciju prajmera sadrži najmanje fluorecentno obeleleni donorski prajmer i komplementarni akceptor, prajmer koji je obeležen prigušivačem I reverzni neobeleženi prajmer, gde jedan od ili bilo koji od prajmera sadrži najmanje jednu fosforotioatnu grupu. Često, u slučaju eksponencijalneg umnožavanja upotrebom univerzalnog reporter sistema, smeša za elongaciju prajmera sadrži najmanje fluorecentno obeieženi prajmer i komplementarni donor, prajmer koji je obeležen prigušivačem, reverzni neobeleženi prajmer i krajnji prednji prajmer, gde jedan od ili bilo koji od prajmera sadrži najmanje jednu modifikaciju fosforotioatom. Gligonukieotiđni prajmeri sa kojima je matrica nukleinske kiseline (u daljem tekstu se naziva matrica DNK radi razumevanja) u kontaktu su dovoljne dužine da omoguće hibridlzaciju sa komplementarnom DNK matricom pod uslovima za spajanje (dole detaljnije opisanoj, alt su nedovoljne dužine da formiraju stabilne hšbridesamatricom DNK u uslovima za poiimerizaciju. Prajmeri mogu da budu najmanje dužine 10 bp, npr., najmanje dužine 15 bp ili 16 bp. Prajmeri mogu da budu dužine 30 bp ili duži, na primer, dužina prajmera može da bude dužine 18 do 60 bp, kao što je približno duzine 20 do 35 bp. Matrica DNK može da bude u kontaktu sa jednim prajrnerom ili setom oddvaprajmera {prednji i reverzni prajmeri), u zavisnosti odtoga da (i je poželjna elongacija prajmera u linearnom ili eksponencijalnom umnožavanju matrice DNK.Gdese koristi jedan prajmer, prajmer je obično komplementaran sa jednim od 3' krajeva matrice DNK, I gde se koriste dva prajmera., prajmeri su obično komplementarni sa dva 3' kraja dvoiančane matrice ONK,

[00433 Kao što se ovde koristi, "nukleinska kiselina" označava ili DNK, RNK, jednolančanu ili dvoiančanu i!1 njihove hemijske modifikacije. Modifikacije uključuju, ali bez ograničenja one koje obezbeđuju druge hemijske grupe koje uključuju dodatno naelekt risa nje, pola riza bilnost, vezivanje vodonika, elektrostatičke interakcije, i funkcionalnost nukleinske kiseline, Takve modifikacije uključuju ali bez ograničenja, modifikacije šećera na 2'-poz(Ciji, modifikacije pirimtđina na poziciji 5, modifikacije purina na poziciji 8, modifikacije na egzociklfčnim aminima, zamenu 4-tlouridina, zamenu 5-bromo ili 5-jodo uracila, modifikaciju osnovnog lanca, metilacije, neuobičajene kombinacije sparivanja baz3 kao što su izobaze izođtidin 5 izoguaniđin, i slično. Modifikacije takođe uključuju 3' i 5' modifikacije kao što je „capping" {modifikacije na krajevima).

[00443 Kao što se ovde koristi, ''komplementarni" se odnosi na par azotnih baza, koje se sastoje od purina koji je vezan vodoničnim vezama za pirimidin. Što vezuje komplementarne lance DNK ili hibridnih molekula spajanjem DNK i RNK.

[0045] Kao što se ovde koristi, "fluorescentna grupa" se odnosi na molekuf koji kada se ekscitira svetiošću koja ima odabranu talasnu dužinu, emituje svetlost druge talasne dužine. Fluorescente grupe se nazivaju S "fiuorofore",

[0046} Kao sto se ovde koristi, "grupa koja modtfikuje fluorescenciju" se odnosi na motekui koji može da promeni na bilo koji način emisiju fluorescencije iz fluorescentne grupe. Grupa koja modtfikuje fluorescenciju ovo postiže pomoću mehanizma transfera energije. U zavisnosti od vrste grupe koja modifikuje fluorescenciju, emisija fluorescencije podleže brojnim promenama, uključujući, ali bez ograničenja, atenuactju, kompletno gašenje, povećanje, pramenu u talasnoj dužini,, promenu u polaritetu, promenu u trajanju fluorescencije. Jedan primer grupe koja modifikuje fluorescenciju je grupa koja prigušuje.

[0047) Kao što se ovde koristi, "transfer energije" se odnosi na proces pomoću koga se emisija fluorescencije od fluorescentne grupe mercja grupom koja modifikuje fluorescenciju. Ukoliko je grupa koja modifikuje fluorescenciju grupa koja prigušuje, onda je emisija fluorescencije od fluorescentne grupe atenuirana (ugašena). Transfer energije može da se dogodi fluorescentno rezonantnim transferom energije, ili direktnim transferom energije. T'ačni mehanizmi transfera energije u ova dva slučaja su različiti. Potrebno je razurnerj da svako pominjanje energetskog transfera u trenutnoj primeni obuhvata sve ove fenomene koji se mehanistićki razlikuju. Transfer energije se ovde naziva i fluorescentni transfer energije ilif RET.

[0048] Kao što se ovde koristi, "par transfera energije" se odnosi na bilo koja dva molekula koja učestvuju u transferu energije. Obično, jedan od molekula deiuje kao fluorescentna grupa i drugi deluje kao grupa koja modifikuje fluorescenciju. Poželjni par za transfer energije pronalaska sadrži fluorescentnu grupu i grupu koja prigušuje. U nekim slučajevima, razlika između fluorescentne grupe t grupe koja modifikuje fluorescenciju nije jasna. Na primer, pod određenim uslovima dve susedne fluorescentne grupe utišavaju jedna drugoj fluorescentnu emisiju pomoću direktnog transfera energije. Zbog toga ne postoji ograničenje u identitetu pojedinačnih članova u paru transfera energije u ovoj prijavi. Sve sto je potrebno je da se speklroskopska svojstva para energetskog transfera kao cei!ne menjaju na neki način koji može da se izmeri ukoliko se razdaljina između pojedinačnih članova menja nekom kritičnom veličinom.

[0049}"Par transfera energije" se odnosi na grupu molekula koja obrazuje jedan kompleks u kome se dešava transfer energije. Neki kompleksi mogu da sadrže, na primer, dve fluorescentne grupe koje se razlikuju jedna u odnosu na drugu I jednu grupu koja prigušuje, dve grupe koje prigušuju i jednu fluorescentnu grupu, i!« više fluorescentnih grupa i više grupa koje prigušuju. U slučajevima gde je više fluorescentnih grupa i/ili više grupa koje prigušuju, pojedinačne grupe mogu da se razlikuju jedna u odnosu na drugu.

[0050}Kao što se ovde koristi, "prajmer" se odnosi na oligonukieotiđ koji def uje kao početna tačka za inicijaciju sinteze kada se nalazi u uslovima u kojima je sinteza proizvoda elongacije prajmera komplementarna sa inđukovanim lancem nukleinske kiseline (npr,, pod strogim uslovima hibridizađjej. Termin "oligonukleotidna sekvenca*' ovde označava prajmer i obrnuto.

[0051]Kao što se ovde koristi, " grupa koja prigušuje" se odnosi na bilo koju grupu koja modifikuje fluorescenciju koja atenuira najmanje deiimično svetlost koju emituje fluorescentna grupa. Atenuacija se ovde odnosi na "prigušivanje". Stoga, iluminacija fluorescentne grupe u prisustvu grupe koja prigušava vodi do emisionog signala koji je manji nego što se očekuje, ili u potpunosti odsutan. Prlgušavanje se dešava transferom energije između fluorescentne grupe i grupe koja prigušuje.

[00S2JKao što se ovde koristi, "transfer energije fluorescentnom rezonancijom" ili "f RET" se odnosi na fenomen transfera energije pri Čemu svetlost koju emituje ekscitlrana fluorescentna grupa najmanje deiimično apsorbuje grupa koja modifikuje fluorescenciju. Ukoliko je grupa koja modifikuje fluorescenciju grupa koja prigušuje, onda takva grupa ili emituje apsorbovanu svetlost kao svetlost različite tatasne dužine, ili je rasipa u vidu topfote. FRET zavisi od preklapanja u emisonom spektru fluorescentnih grupa i apsorpcionom spektru grupa koje prigušuju. FRET dodatno zavisi od udaljenosti između grupe koja prigušuje i fluorecentne grupe. Iznad određene kritične udaljenosti, grupa koja prigušuje ne može da apsorbuje svetlost koju emituje fluorescentna grupa, ili može ali slabije,

(0053]Kao Što se ovde koristi, "krajnji prajmer" se odnosi na oligonukieotiđ koji sadrži dva domena, jedan koji je specifičan za ciljnu matricu DNK od interesa i drogi sa jedinstvenom sekvencom koja služi kao matrica za đobijanje proizvoda iz univerzalnih prajmera koji su prisutni u svakoj drugačijoj I posebnoj PCR reakciji.

[6054]Kao što se ovde koristi, "direktni transfer energije" se odnosi na mehanizam transfera energije pri čemu se prelaz fotona između fluorescentnih grupa I grupa koje modifikuju fluorescenciju ne dešava. Bez da je vezan jednim mehanizmom, veruje se da u direktnom transferu energije fluorescentna grupa i grupa koja modifikuje fluorescenciju interferiraju jedna sa drugom u elektronskim strukturama. Ukoliko je grupa koja modifikuje fluorescenciju grupa koja prigušuje, kao rezultat, grupa koja prigušuje će sprečiti fluorescentnu grupu u emitovanju svetlostt.

[0055] Opite, prigušivanje direktnim transferom energije je efikasnije nego prigušivanje pomoću FRET. Zaista, neke grupe koje prigušuju, koje ne prigušuju posebne fluorescentne grupe pomoću FRET (zato što nemaju neophodno preklapanje u spektru sa fluorescentnom grupom) mogu to da efikasno urade direktnim transferom energije. Osim toga, neke fluorescentne grupe, mogu same da đeluju kao grupe koje prigušuju ukoliko su dovoljno blizu drugim fluorescentnim grupama tako da prouzrokuju direktni transfer energije. Na primer, u ovakvim uslovima dve suseđne fluorescentne grupe mogu da efikasno prigušuju jedna drugoj fluorescenciju. Zbog ovih razioga nema ograničenja u prirodi fluorescentnih grupa i grupa koje prigušuju koje su korisne u praksi ovog pronalaska,

[0056] Primer "strogih uslova za hibridizaciju" je hibridizacija na 50°C Sit više i 6.0<*>SSC (9G0mM NaCI/90 mM natrijum citrat). Drugi primer strogih uslova hibridizacije je inkubacija u toku noći na 42"C ili više u rastvoru; 50% formamid, 6<*>SSC {900 mM NaCl, 90 mM trinatrijum citrat), 50 mM natrijum fosfat (pH7,6),10% dekstran sulfat, i 20 yg/ml denaturisane, izvađene DNK izspermelososa. Stogi uslovi hibridizacije su uslovi za hibridizaciju koji su bar toiiko strogi, kao gore navedeni uslovi, gde se uslovi smatraju bar toliko strogim ako su bar 80% strogi., bar približno 90% strogi kao specifični gornji strogi usiovi. Koriste se drugi strogi uslovi za hibridizaciju koji su poznati u tehnici.

[00S7] Pozivanja na sekvence koje su ovde identične mogu da se tumače kao sekvence koje su identične ili u suštini homologne Jedna sa drugom.

{0058] Primeri upotrebe predmetnog pronalaska uključuju sledeče:

Direktna detek cija PCR proizvoda;

(0059] U izvođenju prikazanom na si.l koristi se oligonukleotiđni prajmer da bi se inicirao PCR proces. Ovaj konvencionalni prajmer je usmeren na region matrice od interesa i prema tome određuje specifičnost reakcije. Ovaj oligonukieotiđ je takođe fluorescentno obeležen na 5' kraju. Postoje brojne fiuorofore koje odgovaraju, a kao popularni izbor je FAM (derivat fiuorescemaj. Konačno, u reakciju je uključen 3<r>oligonukieotiđ obeležen prigušivačem koji je antlsens za oligonukieotiđ koji je obeležen FAM-om. Postoje brojni pogodni obeleživači među kojima je popularan Izbor serija Black Hole obeleživača za prigušivanje. Pod uslovom da je dužina oligonukleotida za prigušivanje dovoljno duga da obezbedi Tm iznad Ta reakcije, stvaranje proizvoda reakcije može da se proceni u svakom ciklusu PCR procesa ili na btlo kom instrumentu PCR-a u realnom vremenu (kao što je AB1 7900 Prism instrument}. Alternativno reakcija može đa koristi oligonukieotiđ za prigušivanje koji ima niži Tm od Ta reakcije. Posle PCR-a reakcija se hladi na sobnoj temperaturi i proizvodi mogu da se proeene na bilo kom instrumentu u realnom vremenu I dodatno na bilo kom fluorescentnom čitaču ploča {kao što je BMG Pherastar).

{0060] 2bog komplementarnosti dva obeiežena oligonukleotida (obeleženi prigušivač i fiuoroforaj, oni hibridizuju jedan sa drugim. Hibridizacija dovodi obeleženi prigušivač u neposrednu blizinu fiuorofore, čime se fluorescentni signal f AM molekula učini utišanim, kada se ekscitira na 488nm (optimalna talasna dužina za ekscitaciju FAM-a),

{0061} Takođe je u reakciju uključen konvencionalni reverzni prajmer đa se napravi par PCR prajmera. Tada se Inicira PCR postupak i počinju da se stvaraju proizvodi PCR-a.

[0062]Nakon nekoliko prvih ciklusa PCR-a stvara se antisens sekvenca fluorecentnog prajmera, U toku ovog procesa, oligonukieotiđ?. sprigušivanje više nije vezan; proizvodi se amplikon koji sadrži 5' FAM molekul. Jednom kada se ovo dogodi molekul za prigušivanje više ne može đa hibriđizuje sa oiigonukieotiđom koji je obeležen FAM-orn, kako PCR proces proizvodi dvolančani DNK amplikon. Kako oligonukieotiđ za prigušivanje više ne može da hibriđizuje sa FAM oiigonukieotiđom, stvara se signal koji je direktno proporcionalan količini nastalog PCR proizvoda.

Indi rektna (u realnom vremenu) detekcija PCR proizvoda

[0063]U izvođenju, prikazanom na sl.2 koristi se konvencionalni oligonukieotiđ (prajmer) da bi se inicirao PCR proces. Ovaj konvencionalni prajmer na kraju sadrži DNK sekvencu koja se ne usmerava na region od interesa u amplikonu, pri čemu je ovaj kraj u suštini Inertan. Ovaj kraj sekvence je poziconiran na 5' delu prajmera, Takođe je u reakciju uključen jedan fluorescentno obeleženi oligonukieotiđ koji je identičan ili dosta homoiog sa krajnjom sekvencom regiona konvencionalnog prajmera. Postoje brojne fiuorofore koje odgovaraju, a kao popularni izbor je FAM (derivat fiuoresceina). Konačno, u reakciju je uključen 3' oligonukieotiđ obeležen prigušivačem koji je antisenszaoligonukieotiđ koji je obeležen FAM-om. Postoje brojni pogodni obeleživači među kojima je popularan izbor serija Black Hole obeieživača za prigušivanje.

(00643Pod uslovom da je duzina oligonukleotida za prigušivanje dovoljno duga da obezbeđš Tm iznad Ta reakcije, stvaranje proizvoda reakcije može da se proceni u svakom ciklusu PCR procesa ili na bilo kom instrumentu PCR-a u realnom vremenu (kao što je ABl 7900 Prtsm instrument). Alternativno reakcija može da koristi oligonukieotiđ za prigušivanje koji ima niži Tm u odnosu na Ta reakcije. Posle PCR-a reakcija se hladi na sobnoj temperaturi i proizvodi mogu đa se procene na bilo kom instrumentu u realnom vremenu i dodatno bilo kom fluorescentnom čitaču ploča {kao sto je BMG Pherastar),

[00653Zbog komplementarnosti dva obeiežena oligonukleotida (obeleženi prigušivač i fluorofora), oni hibridizuju jedan sa drugim. Hibridizacija dovodi obeleženi prigušivač u neposrednu blizinu fiuorofore, čime se fluorescentni signal FAM molekula učini utišanim, kada se ekscitira na 488nm (optimalna talasna dužina za efcscitaciju FAM-a), PCR proces se inicira i počinju da se stvaraju proizvodi PCR. Nakon nekoliko prvih ciklusa PCR-a stvara se antisens sekvenca fluorecentnog prajmera. Fluorescentni PCR prajmer onda može da inicira sintezu u toku PCR-a i to i čini. Ovo proizvodi amplikon koji sadrži 5' FAM molekul. Jednom kada se ovo dogodi oligonukieotiđ za prigušivanje više ne može đa hibriđizuje sa FA oiigonukieotiđom, zatim nastaje signal koji je direktno proporcionalan količini PCR proizvoda koja se stvara.

[0066]Krajnji region krajnjeg prajmera ne mora đa bude identičan jednom fluorescentnom oheleženorn oiigonukleotidu, sve dok antisens sekvenca krajnjeg regiona koji nastaje hibriđizuje sa jednim fluorescentno obeleženim ofigonukieotiđom.

indirektna (krajnja tačka) detekcije PCR proizvoda - genoti<p>izacija SNP

[0067]U izvođenju ilustrovanom na sl.3, koriščena je ista fluorofora i prigušivačem-obeleženi oligonukieotiđni par kako je opisano na sl,2. Reakciona Šema je identična ali za nekoliko modifikacija.

[0068]Da bi se postigla genotipizađja SNP potrebna su dva fluorescentno obeiežena prajmera i odgovarajući oligonukleotidi koji su obeleženi prigušivačem. Svaki prajmer ponovo sadrži krajnju jedinstvenu sekvencu, za koju je u reakciji ukijučujen prajmer fluorecentno obeležen na S<f>, Dve pogodne boje su FAM i HEX, koje se spektrafno razlikuju jedna od druge. Dva prajmera (deo koji nije krajnji; generalno se naziva prednji) su usmerena na DNK od interesa. U ovom delu prajmera oni se obično razlikuju u jednom nukfeotiđu na njihovoj 3<*>krajnjoj bazi. Svaki prajmer je usmeren na polimorfnu bazu DNK od interesa. PCR se izvodi i samo dva prajmera iniciraju sintezu kada 3' baza prefektno odgovara. Kada se pogrešno sparivanje dogodi ne dolazi do dalje sinteze.

(0069]Tokom reakcije, specifični kraj zavisi od genotipa koji može da Inicira sintezu (ili su oba, u slučaju beterozigoti). Ovo opet inkorporira fluorescentni krajnji deo prajmera u PCR proizvod i na taj način ometa hibridizaciju oligonukleotida za prigušivanje. Signal se prema tome stvara u zavisnosti od toga koji od oligonukleotida je inicirao sintezu. Reakcija se zatim očitava na fluorescentnom čitaču za obe fiuorofore, Dobijeni podaci se zatim predstavljaju i stvara se dijagram klastera jedne fiuorofore preko druge. Nastali genotipovi mogu da se odrede na osnovu dijagrama klastera.

[0070]Dalja upotreba oligo sistema para fluorofora prigušivač se opisuje kod homogene detekcije PCR proizvoda koriščenjem 5'~3' m/kleazne aktivnosti Taq polimeraze,

{0071] Trenutni prikaz pronalaska može da se primeni da poboljša specifičnost i obrazovanje dimera prajmera koje se takođe događja u 5' nukleaznom testu inače poznatom kao Takman.

{0072]U ovom opisu i priloženim zahtevima, oblici jednine se odnose na množinu ukoliko kontekst ne ukazuje drugačije. Ukoliko nije drugačije đefinisano, svi tehniički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje koje je opšte prihvaćeno prosečnom stručnjaku u oblasti tehnike u koju ovaj pronalazak spada.

{0073]Gde jedat opseg vrednosti podrazumeva se da je svaka vređnost do desetog dela jedinice donje granice ukoliko kontekst jasno ne pokazuje drugačije, između gornje I donje granice tog opsega, i bilo koja druga vređnost u navedenom opsegu obuhvaćena ovim pronalaskom, Gornje i donje granice ovih manjih opsega, mogu nezavisno da se uključe u manje opsege, i takođe su obuhvaćeni pronalaskom, izloženi bilo kojoj specifično izuzetoj granici u navedenom opsegu. Gde navedeni opseg uključuje jednu Hi obe granice, opsezi koji izuzimaju jednu ili ove obe uključene granice su takođe obuhvaćeni pronalaskom.

{0074]Pronalazak se sada opisuje pozivanjem na sleđeće prtmere koji su dati u ilustrativne svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničenja obima predmetnog pronalaska.

PRiMER 1

Skraćenice;

{00751

FAM: 6-Karboksš Fiuorescein

HEX; 2V4',5',7J'yl/4-heksahioroffuorescein

Dabcy1: ne~fiuorescentni tamni prigušivač

[0076] Sedam oligonukleotida koji su dizajnirani i njihove sekvence se nalaze ispod, gđe * označava upotrebu S- modifikacije:

£00771Treba primetiti da u ovom primeru prajmer za prigušivanje koji je obeležen FAM-om ima 16mernu oiigonukleotidnu sekvencu i kraći je za više od 2 nukieotida u odnosu na prajmer koji je obeležen sa FAM-om /reporter proba i slično prajmeru za prigušivanje koji je obeležen H£X-om ima ISmernu oiigonukleotidnu sekvencu koja je kraća za više od 2 nukieotida od prajmera koji je obeležen t-t£X-om /reporter probe. Prema tome, duži prajmeri koji su obeleženi FAM-om ili HEX-om /reporter probe imaju Trn koji je na ili iznad S7*e Ta u koraku vezivanja prajmera u PCR procesu, gde se kraći prajmeri za prigušivanje u koraku vezivanja na ili ispod S7°C Ta neće vezati za matricu.

[0078]Svi oligonukleotidi su razblaleni do početne koncentracije 200 pM u i0 mM Trts/HC! pH 8.0. Sva dalja razbiaženja su izvedena u ovom razblaživaču- Napravljena je smeša za testiranje koja uključuje sledeće komponente:

{ 1}0,16 pM Alei specifični prajmer 1

(2j 0,16 pM Ale'l specifični prajmer 2

(3) 0,41 uM Reverzni (opšti} prajmer

(4) CluM F AM-obeleženi oligonukieotiđ (5) 0,lpM M£X-obeieženi oligonukieotiđ

(6) 0,5uJvt Prigušivačem-obeleženi oligonukieotiđ (antisens za oligonukieotiđ 4)

(7} G,5uM Prigušivačem- obeleženi oligonukieotiđ (antisens za oligonukieotiđ 5}

{ 8}3G-90Jeđimca/rot N-terminalno skraćene Taq polimeraze

(9} lOmM Tris /HCIpH 8,3

(10) lQmM KCI

(U) l,8mM Magnezijum hloriđ

(12) 165,2uM dNTPs

(13) 212,5nM $-karboksi-X~rodaminfSE (5-R0X, SE)

10079} U bunariće Al-824 u mikrotitarskoj ploči ođ 384 bunarića dodaje se lOng DNK genomske DNK od 44 individua Kavkazijan tipa, Peostafa 4 bunarića se ostavljaju prazna i služe kao bunarići za negativne kontrole. Nakon toga ploča se suši na SQX uperioćvod lb.

(0080}U bunariće Al-824 osušene ploče se dodaje 5 ui smeše za test i ploča se zapečati pomoću Fusion transmission diode laser plate sealer (KBioscIence UK Ltd). Floča je zatim u termo-ciklusu pod sleđećlm uslovima u Hydrocyc!er~u (KBIoscience UK ltd):

94Tza 15 minuta aktivacije vrućim startom

94"Cza20 sekundi

61- 55<*>C za 60 sekundi (opadajući 0,S<*>C po ciklusu)

10 gore navedenih ciklusa

94' Cza 20 sekundi

SS'C za 60 sekundi

26 gore navedenih ciklusa

(0O81JNakon termalnog ciklusa ffuorescenca koja je udružena sa svakim bunarićem se određuje pomoću BM6 Pherastar čitača pioce. Svaki bunarčić se čita tri puta na siedećim kombinacijama talasnih dužina.

FAM ekscitaclja: 485nm, FAM emisija: 520nm

H£X ekscitacija: 535nm, H£X emisija: 556nm

RQX ekscitacija: $75nm, ROK emisija; 610nm

(0082)Pobijeni podaci se predstavljaju kao FAM signal podeljen sa ROK na X-osi i HF.X signal podeljen sa ROXnaY-osl,

[0083}Kao što se može videti sa đlagrama rasejanja, na si.4 tri grupe koje se jasno uočavaju su udružene sa odgovarajućim genotipovima vidljive su i jasno pokazuju delotvornost tehologije za detekciju,

PRIMER 2

[0084]Prateći protokol koji je sličan onom koji se opisuje u primeru 1, obavljaju se testovi za poređenje upotrebe fluorescentno obeleženih oligonukleotida (i) ne- S mođifikovanih, (ii) poiu-S modifskovanib (naizmenični fosforotioati) i (iii) cele-S modifikovane konfiguracije. Podaci koji se dobijaju prikazuju se na sl.S. Prikazani podatak za test 1 pokazuje upotrebu konfiguracija (i),(ii)' 0}(gore); podatakzatest 2 pokazuje konfiguracije (i) i {»}. Kod oba testa oligonukleotidi za prigušivanje nemaju fosforotioatnu modifikaciju.

[0085]Pojačana specifičnostI smanjeno umnožavanje van kontrole matrice (vidi donji ievi dijagram rasejanja) je primečeno sa svim varijantama fluora koje su modifikovane fosforotioatom. Upotreba modifikacija fosforotioata na svim bazama fluorescentno obeieženog oligonukleotida ima određeni efekat na brzinu PCR-a i intenzitet, signala. Upotreba fosforotioatne modifikacije na alternativnim bazama prajmera koji su obeleženi bojom (odnosi se na polu-S modifikaciju} zajedno sa nemodifikovanim prigušivačima ustanovljeno je da je optimalno za poboljšano razlikovanje i intenzitet signala u PCR-u,

Claims (15)

1. Postupak za detekciju proizvoda elongacije prajmera koji se proizvodi u prisustvu polimeraze koja nema 3'~>5' egzonukleaznu aktivnost, gde<p>omenutf postupak obuhvata korake: a) obezbeđivanja najmanje dve oligonukleotidne sekvence koje su jednom obeležene,kojehibridizuju jedna sa drugom slobodno u rastvoru da bi se obrazovao fluorescentno prigušeni par, koji nakon uvođenja komplementarne sekvence sa jednom ili obe sekvence, stvara signal koji se može izmeriti kada komplementarna sekvenca hibriđizuje sa jednom od najmanje dve oligonukleotidne sekvence koje su jednom obeležene, gde najmanje jedna od oligonukleotidnih sekvenci sadrži najmanje jednu fosforotioatnu grupu; b) obezbeđivanja najmanje jednog prajmera i započinjanje reakcije elongacije prajmera od najmanje jednog prajmera pomoću polimeraze koja nema 3' ka 5' egzonukleaznu aktivnost, čime se stvara komplementarna sekvenca sa najmanje jednom od oligonukleotidnih sekvenci koje su jednom obeležene; i e) merenja uočljivog signala koji se stvara kada komplemetama sekvenca hibriđizuje sa jednom od najmanje dve oligonukleotidne sekvence koje su jednom obeležene.

2. Ktt za detekciju proizvoda elongacije prajmera koji se proizvodi u prisustvu polimeraze koja nema 3'45' egzonukleaznu aktivnost, koji sadrži: 1) najmanje dve oligonukleotidne sekvence koje su jednom obeležene koje hibridizuju jedna sa drugom slobodno u rastvoru da bi obrazovale fluorescentni prigušeni par, koji nakon uvođenja komplementarne sekvence sa jednom ili obe sekvence stvara signal koji se može izmeriti kada komplemetama sekvenca hibriđizuje sa jednom od dve oligonukleotidne sekvence koje su jednom obeležene; i 2} polimerazu koja nema 3' ka 5' egzonukleaznu aktivnost; gde najmanje jedna od oligonukleotidnih sekvenci sadrži najmanje jednu fosforotioatnu grupu, gde najmanje jedna od unutrašnjih baza najmanje jedne oligonukleotidne sekvence sadrži fosforotioatnu grupu i gde najmanje jedna oligonukleotidna sekvencakoja sadržinajmanje jednu fosforotioatnu grupu ima 20-80%, opciono 30-70%, baza koje su mođifikovane fošforotioatnom grupom; i opciono gde su mođifikovane baze odvojene najmanje jednom nemođtfikovanom bazom i/ili gde su naizmenične baze fosforotioati.

3. Postupak ili kit prema žabtevu 1 ili 2, gde su prva i druga oligonukleotidna sekvenca sa različitom Tm (temperaturom topljenja}., opciono a) gde jedna od prve i druge oligonukleotidne sekvence ima Tm koja je na ili ispod Ta (temperature spajanja) reakcije elongacije prajmera, ili b) gde jedna od prve i druge oligonukleotidne sekvence ima Tm koja je iznad Ta reakcije elongacije prajmera.

4. Postupak za detekciju proizvoda ekstenzsje prajmera koji se proizvodi u prisustvu polimeraze koja nema 3'->5' egzonukleaznu aktivnost pomoću PCR-a, gde postupak obuhvata korake: a) obezbeđivanja prve oligonukleotidne sekvence koja je jednom obeiežena i najmanje druge oligonukleotidne sekvence koja je jednom obeiežena, pri čemu prva i druga oligonukleotidna sekvenca imaju različite Tm, gde prva I druga oligonukleotidna sekvenca hibridizuju jedna sa drugom slobodno u rastvoru da bi se obrazovao fluorescentni prigušeni par i najmanje jedan prajmer, gđe jedna od prve i druge oligonukleotidne sekvence ima Tm koji je na ili ispod Ta procesa PCR, pri čemu najmanje jedna od oligonukleotidnih sekvenci sadrži najmanje jednu fosforotioatnu grupu, najmanje jedan prajmer koji se sastoji od najmanje jednog neobeležnog krajnjeg prajmera, gde neobeleženi krajnji prajmer ima krajnji region, gde krajnji region obuhvata oiigonukleotidnu sekvencu komplementarnu sa oiigonukleotidnom sekvencom druge oligonukleotidne sekvence koja je jednom obeiežena, gde je prva oligonukleotidna sekvenca koja je jednom obeiežena prajmer od koga se inicira DNK sinteza kada nastane komplementarna sekvenca sa prvom oiigonukleotidnom sekvencom koja je jednom obeiežena u toku PCR procesa, pri Čemu druga oligonukleotidna sekvenca koja je jednom obeiežena više ne može da hibriđizuje sa prvom oifgonukleatfdnom sekvencom koja je jednom obeiežena,pričemu nastaje signal koji može da se izmeri; b) iniciranja reakcije elongacije prajmera od najmanje jednog prajmera pomoću polimeraze koja nema 3' ka 5' egzonukleaznu aktivnost čime se stvara komplementarna sekvenca sa prvom oiigonukleotidnom sekvencom koja je jednom obeiežena; i c) merenja uočljivog signala koji se stvara kada komplementarna sekvenca hibriđizuje sa prvom oiigonukleotidnom sekvencom koja je jednom obeiežena.

5. Postupak ili kit prema bifo kom od zahteva 1 do 4, gde je jedan od oligonukleotida koji je jednom obeležen kraći od drugog za više od 10 baza. S.

Postupak prema bilo kom od zahteva 1 i 3, gđe se PCR proces prati u realnom vremenu za svaki ciklus ili posle više ciklusa, gde reakcija još uvek nije stvorila dovoljno proizvoda da nastane signal koji može đa se meri snižavanjem temperature reakcije đa se omogući hibridizacija.

7, Postupak prema bilo kom ođ zahteva 4 do 6, pri čemu pomenuti drugi oiignukleotiđ koji je jednom obeležen ima Tm koji je iznad Ta.

8. Postupak ili kitpremabilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu pomenuti jedan od oligonukleotida koji je jednom obeležen ima obeleživač za prigušivanje u fluorescentnom paru za prigušivanje.

9. Postupak prema bio kom zahtevu 1, 3 do 8, gde najmanje Jedna od unutrašnjih baza oligonukfeotiđ(a) koji sadrže fosforotioatnu grupu je fosforotioat, i/Hi gde su 20-80%, opciono 30-70%, baza oligonukieotiđ f a) koji sadrže fosforotioatnu grupu fosforotioati

10. Postupak ili kit prema bilo kom od prethodnih zahteva, za upete bu u SNP genotiplzacšjikoja se zasniva na afei specifičnom PCR-u,

11. Postupak ili kit prema- bilo kom od prethodnih zahteva, za prstenje proizvodnje amplikona pomotu 5' nuMeaznog testa, pri čemu se 5<*>nuMeazni test koristi za izvođenje reakcija razlikovanja aieia.

12. Postupak prema bilo kom od zahteva 1,3 do 11, gde se proizvod eioogađje prajmera prati samopomoćuhibridizacije, opciono, gde se proizvod elongacije prajmera prati hihridizacijom posle PCR-a,

13. Postupak Ili kit prema prema bilo kom od zahteva 1 do 12, gde su fluorescentni oiigo parovi za prigušivanje u opsegu od 6 bp do 100 bp, opciono u opsegu od 6 bp do 100 bp afi se ne poklapaju u duzini,

14. Postupak ili kit prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde najmanje jedna od baza "fluorescentno obeieženog oligon uleotida Ima najmanje jed n u fosforotioatnu -grupu.

15. Postupak ili kit prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde su fluorescentni oligo parovi za prigušivanje: s) jedan od para obiežen fluoroforom i drugi sa neftUorescentim molekulom za prigušivanje; t/ili bj modifi kovani da budu otporni na degradaciju nukleazom; i/il! su obeleženi roolekulima koji su osetljivi na udaljenost.