ES2620750T3

ES2620750T3 - Sistema de detección de reacción en cadena de la polimerasa utilizando oligonucleótidos que comprenden un grupo fosforotioato

Info

Publication number: ES2620750T3
Application number: ES12710994.0T
Authority: ES
Inventors: Philip Steven Robinson; John Holme; Nisha JAIN
Original assignee: LGC Genomics Ltd
Current assignee: LGC Genomics Ltd
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2017-06-29
Anticipated expiration: 2032-03-22
Also published as: WO2013140107A1; LT2828399T; PT2828399T; RS55868B1; CA2867916A1; AU2012374566A2; HUE032212T2; SI2828399T1; CN104379763B; PL2828399T3; EP2828399A1; JP2015512251A; HRP20170569T1; CY1118903T1; CN104379763A; AU2012374566B2; JP6166342B2; DK2828399T3; HK1204015A1; NZ630915A

Abstract

Un método para la detección de un producto de extensión de cebador producido en presencia de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3'H5', comprendiendo el método las etapas de: a) proporcionar al menos dos secuencias de oligonucleótido de marcado simple que se hibridan entre sí en solución libre para formar un par desactivado fluorescente que, tras la introducción de una secuencia complementaria para una o ambas secuencias genera una señal medible cuando la secuencia complementaria se hibrida con una de las al menos dos secuencias de oligonucleótido de marcado simple, conteniendo al menos una de las secuencias de oligonucleótido al menos un grupo fosforotioato; b) proporcionar al menos un cebador e iniciar la reacción de extensión de cebador a partir de al menos un cebador utilizando una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3' a 5' generando en virtud de ello una secuencia complementaria para al menos una de las secuencias de nucleótido de marcado simple; y c) medir la señal detectable que se genera cuando se hibrida la secuencia complementaria con una de las al menos dos secuencias de oligonucleótido de marcado simple.

Description

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DESCRIPCION

Sistema de deteccion de reaccion en cadena de la polimerasa utilizando oligonucleotidos que comprenden un grupo fosforotioato

La presente invencion se refiere a metodos y kits para la deteccion de acido nucleico en un sistema de ensayo. Antecedentes de la invencion

La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) es un potente metodo para realizar una amplificacion rapida y exponencial de secuencias de acidos nucleicos diana. La PCR ha facilitado el desarrollo de las tecnologias de caracterizacion genica y clonacion molecular, incluyendo la secuenciacion directa de ADN amplificado por PCR, la determinacion de variacion alelica y la deteccion de patologias infecciosas y geneticas. PCR se realiza a traves de ciclos repetidos de desnaturalizacion termica de un molde de ADN que contiene la secuencia diana, por hibridacion de los cebadores contrarios con las cadenas de ADN complementarias y la extension de los cebadores hibridados con ADN polimerasa. Los multiples ciclos de PCR tienen como resultado la amplificacion exponencial de la secuencia de nucleotidos delineada por los cebadores de amplificacion flanqueantes. La incorporacion de una ADN polimerasa termoestable en el protocolo de PCR obvia la necesidad de repetidas adiciones de enzima y permite unas temperaturas de hibridacion y extension del cebador que potencian la especificidad de las asociaciones cebador : molde. Taq ADN polimerasa sirve por tanto para aumentar la especificidad y simplicidad de PCR.

En muchas reacciones basadas en PCR, se emplea un sistema de production de senal, p.ej. para detectar la production de producto amplificado. Un tipo de sistema de produccion de senal que se utiliza en las reacciones basadas en PCR es el sistema de transferencia de energia fluorescente (FRET), en el que un detector de acido nucleico incluye grupos dador y aceptor de la fluorescencia. Los sistemas de marcado FRET incluyen una serie de ventajas con respecto a otros sistemas de marcado, incluyendo la capacidad para llevar a cabo ensayos homogeneos en los que no se requiere una etapa de separation del detector de acido nucleico marcado unido del no unido. Un problema primordial de muchas de las tecnicas de la tecnica anterior esta asociado con la sintesis de oligonucleotidos fluorescentes marcados dualmente. En la Solicitud de patente europea EP1726664, se describe un sistema de deteccion que resuelve este problema mediante el uso de secuencias de oligonucleotido de marcado simple de diferentes temperaturas de fusion (Tf) que se hibridan entre si en solution libre para formar un par fluorescente desactivado, que tras la introduction de una secuencia complementaria para una o ambas secuencias genera una senal medible, teniendo una de las secuencias una Tf que esta por debajo de la temperatura de hibridacion (Th) del proceso PCR.

En los sistemas de deteccion en los que se utiliza un detector de acido nucleico marcado, es critica una amplificacion de alta fidelidad. Dada la naturaleza del proceso PCR y Taq ADN polimerasa, dichos metodos pueden sufrir reacciones secundarias alternativas a la reaccion de polimerizacion deseada. Por ejemplo, PCR puede sufrir una amplificacion no especifica cuando se ensambla la reaccion a temperatura ambiente. A temperaturas por debajo de las de PCR, Taq polimerasa retiene una fraction de su actividad y puede por tanto extender cebadores que no se hibridan por complementariedad, llevando a la formation de productos no deseados. La region recien sintetizada actua entonces como molde para la posterior extension de cebador y sintesis de productos de amplificacion no deseados. Sin embargo, si se calienta la reaccion a temperaturas en torno a 50 °C o superiores antes de que comience la polimerizacion, aumenta la rigurosidad de la hibridacion de cebador y se evita o se reduce la sintesis de productos de PCR no deseados.

La union cebador-dimero es tambien una reaccion secundaria habitual que afecta a la PCR. La acumulacion de cebador-dimero tiene lugar por la hibridacion y extension de los cebadores entre si. La formacion de cebador-dimero tiene como resultado la supresion de los reactivos y, en consecuencia, una reduction global de la eficacia de la PCR.

La PCR de arranque en caliente es un metodo para reducir la amplificacion no especifica y limitar asi la formacion de cebadores-dimeros, habiendose desarrollado muchos enfoques diferentes para conseguirlo, vease por ejemplo, Moretti, T. et al. Enhancement of PCR amplification yield and specificity using AmpliTaq Gold DNA polymerase. BioTechniques 25, 716-22 (1998) and Hot Start PCR with heat-activatable primers: a novel approach for improved PCR performance Nucleic Acids Res (2008) 36(20): e131. Sin embargo, dichas tecnicas unicamente consiguen un alivio parcial de estos problemas. Dado que cualquier error en las secuencias, las reacciones no basadas en la polimerizacion o un cebado incorrecto del cebador, como por ejemplo dimerization de cebador, pueden causar la produccion de una senal debil o una senal erronea, seria deseable, sobre todo en PCR especifica de alelo, una mayor mejora de estas senales debiles o incorrectas.

Los fosforotioatos (o S-oligos) son una variante de ADN normal en la que uno de los oxigenos sin puente se reemplaza por azufre. A continuation, se exponen ejemplos de uniones de internucleotido de fosfodiester y fosforotioato:

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imagen1

El enlace fosforotioato sustituye por un atomo de azufre el oxigeno sin puente en la cadena principal de fosfato del oligonucleotido, haciendo que la union de internucleotido sea resistente a la degradacion de nucleasa. Se puede introducir fosforotioatos tanto en el extremo 5' como 3' del oligo para inhibir la degradacion de exonucleasa. En los oligonucleotidos antisentido, se introducen tambien los fosforotioatos internamente para limitar el ataque de endonucleasas. La sintesis de oligonucleotidos que contienen fosforotioato se describe por ejemplo en Verma S. and Eckstein, F.(1998). MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES: Synthesis and Strategy for Users. Annu. Rev. Biochem. 1998. 67:99-134 y Curr Protoc Nucleic Acid Chem. Mar 2009;Capitulo 4:Unidad 4.34. DNA oligonucleotides containing stereodefined phosphorothioate linkages in selected positions. Nawrot B, Rebowska B.

Tal como se ha mencionado antes, la sulfuracion del enlace internucleotido reduce la accion de endo- y exonucleasas incluyendo 5' ^3' y 3'^5' ADN POL 1 exonucleasa, nucleasas S1 y P1, ARNasas, nucleasas en suero y fosfodiestearasa en el veneno de serpiente. El atributo de resistencia a nucleasa del S-oligo en combinacion con la PCR de alta fidelidad empleando exo + ADN polimerasas ha sido demostrado, vease por ejemplo, Nucl. Acids Res. (2003) 31 (3): e7. doi: 10.1093/nar/gng007. Taq DNA polymerase possesses no 3'^5' Exonuclease (Kenneth R. Tindall, Thomas A.Kunkel, Biochemistry, 1988,27 (16), p 6008-6013). Se ha notificado asimismo una mejor discriminacion de polimorfismos de un solo nucleotido mediante modificacion con fosforotioato en presencia de una polimerasa de correccion de pruebas. La modificacion con fosforotioato aumenta la especificidad, reduciendo las incidencias de interaccion cebador-dimero, si bien, se ha notificado que se necesita la funcionalidad 3'-nucleasa para mejorar la PCR y se ha demostrado que en combinacion con la PCR especifica de alelo, el uso de S-oligos no ofrece ningun beneficio cuando se utiliza en combinacion con Taq ADN polimerasa, vease por ejemplo Zhang, J. and Li, K. (2003) Single-Base Discrimination Mediated by Proofreading 3' Phosphorothioate-Modified Primers. Molecular Biotechnology 25, 223-227.

Existe la necesidad de sistemas de detection especificos, economicos, fiables y faciles de sintetizar para su uso en la deteccion de productos de extension de cebador, p.ej. en ensayos de PCR homogeneos, que aborden los problemas con los que se topan los sistemas de deteccion para PCR existentes. En contraposition con el conocimiento cientifico convencional, la presente invention se basa en el hallazgo de que se pueden utilizar satisfactoriamente S-oligos con el resultado de mejoras en los sistemas de ensayo de deteccion de acidos nucleicos.

Sumario de la invencion

La presente invencion se define en las reivindicaciones 1 a 15 adjuntas.

La presente divulgation proporciona un metodo para reducir la amplification no especifica y/o la formation de cebadores-dimeros en una reaction de extension de cebador dependiente de molde que comprende llevar a cabo una reaccion de extension de cebador en presencia de una polimerasa que carece de actividad nucleasa 3'^5' conteniendo uno o mas de los cebadores al menos un grupo fosforotioato.

Se proporcionan asimismo kits y composiciones para su uso en dichos metodos.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es un esquema de reaccion simple para la deteccion directa de una secuencia de ADN empleando el metodo que engloba el metodo de la presente invencion

La Figura 2 es un esquema de reaccion simple para la deteccion indirecta (tiempo real) de una secuencia de ADN que engloba el metodo de la presente invencion.

La Figura 3 es un esquema de reaccion simple para la deteccion indirecta (de punto final) de la secuencia de ADN en genotipificacion de SNP que engloba el metodo de la presente invencion.

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La Figura 4 muestra los datos generados utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 1, mas adelante.

La Figura 5 muestra una comparacion de los datos generados en los sistemas de ensayo empleando secuencias de oligonucleotido que contienen grupos fosforotioato y oligonucleotidos que no contiene fosforotioato, tal como se describe en Ejemplo 2, mas adelante.

Descripcion detallada de la invencion

De acuerdo con la presente divulgacion se proporciona un metodo para reducir la amplification no espetifica y/o la formation de cebadores-d^eros en una reaction de extension de cebador dependiente de molde que comprende llevar a cabo la reaccion de extension de cebador en presencia de una polimerasa que carece de actividad nucleasa 3’^5’, conteniendo uno o mas de los cebadores al menos un grupo fosforotioato.

El metodo de la presente divulgacion comprende preferiblemente el uso de al menos dos secuencias de oligonucleotido de marcado simple que se hibridan entre si en solution libre para formar un par desactivado fluorescente, que tras la introduction de una secuencia complementaria para una o ambas secuencias genera una senal medible, estando modificado uno o mas de los cebadores con al menos un grupo fosforotioato.

En un modo de realizacion de la presente divulgacion, las dos secuencias de oligonucleotido de marcado simple tienen diferente Tf. Cuando las secuencias de oligonucleotido tienen diferente Tf, entonces una de las secuencias puede tener una Tf que esta a la Th de la reaccion de extension del cebador, p.ej. proceso de PCR, o por debajo de ella. La otra secuencia puede tener una Tf que no esta adecuadamente por debajo de la Th, sino, preferiblemente, por encima de ella y, mas preferiblemente, sustancialmente por encima de ella. En un modo de realization, el oligonucleotido desactivador tiene una Tf por encima de la Th.

Una de las formulas que se utiliza habitualmente para determinar la Tf de una secuencia es Tf=4(G+C)+2(A+T), segun la cual la Tf baja de una secuencia se puede conseguir en principio por una longitud mas corta y/o una menor relation (G+C)/(A+T) con respecto a la otra secuencia del par indicador.

En algunos de los aspectos de la presente divulgacion es preferible que una de las secuencias de oligonucleotido de marcado simple sea 10 bases mas larga que la otra, y preferiblemente al menos 15 bases mas larga.

La invencion proporciona un metodo para la detection de un producto de extension de cebador producido en presencia de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3’^5’, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

a) proporcionar al menos dos secuencias de oligonucleotido de marcado simple, p.ej. de diferente Tf, que se hibridan entre si en solucion libre para formar un par desactivado fluorescente que, tras la introduccion de una secuencia complementaria para una o ambas secuencias genera una senal medible cuando la secuencia complementaria se hibrida con una de las al menos dos secuencias de oligonucleotido de marcado simple, conteniendo al menos una de las secuencias de oligonucleotido al menos un grupo fosforotioato;

b) proporcionar al menos un cebador e iniciar la reaccion de extension de cebador generando en virtud de ello una secuencia complementaria para al menos una de las secuencias de nucleotido de marcado simple; y

c) medir la senal detectable que se genera

cuando se hibrida la secuencia complementaria con una de las al menos dos secuencias de oligonucleotido de marcado simple.

En otro aspecto mas de la presente invencion, el metodo comprende un metodo para la deteccion de un producto de extension de cebador producido en presencia de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3’^5’ utilizando PCR, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

a) proporcionar al menos una primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple y al menos una segunda secuencia de oligonucleotidos de marcado simple, p.ej. siendo la primera y la segunda secuencia de oligonucleotidos de diferente Tf, en la que se hibridan las secuencias de oligonucleotido primera y segunda entre si en solucion libre para formar un par desactivado fluorescente y al menos un cebador y p.ej., teniendo una entre la primera y segunda secuencia de nucleotido una Tf a la Th del proceso de PCR, o por debajo de ella, conteniendo al menos una de las secuencias de oligonucleotido al menos un grupo fosforotioato, comprendiendo el al menos un cebador al menos un cebador de cola sin marcar, teniendo el cebador de cola sin marcar una region de cola, comprendiendo la region de cola una secuencia de oligonucleotidos complementaria con una secuencia de oligonucleotidos de la segunda secuencia de oligonucleotidos de marcado simple, siendo la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple un cebador a partir del cual se inicia la sintesis de ADN una vez generada la secuencia complementaria de la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple durante el proceso de PCR, de manea que la segunda secuencia de oligonucleotidos de marcado simple deja de ser capaz de hibridarse con la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple, en virtud de lo cual se genera una senal medible.

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b) iniciar la reaccion de extension de cebador en virtud de lo cual se genera una secuencia complementaria para al menos una de las secuencias de oligonucleotidos de marcado simple; y

c) medir la senal detectable que se genera cuando se hibrida la secuencia complementaria con la primera secuencia de nucleotidos de marcado simple.

En un aspecto de la invencion aun mas preferible, el metodo comprende un metodo para la deteccion de un producto de extension de cebador producido en presencia de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3'^5' utilizando PCR, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

a) proporcionar una primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple y al menos una segunda secuencia de oligonucleotidos de marcado simple, p.ej. teniendo una Tf diferente la primera y la segunda secuencia de oligonucleotidos, en la que se hibridan la primera y la segunda secuencia de oligonucleotidos entre si en solucion libre para formar un par desactivado fluorescente y al menos un cebador y, p.ej., teniendo una entre la primera y la segunda secuencias de nucleotidos una Tf que esta a la Th del proceso de PCR, o por debajo de ella, conteniendo al menos una de las secuencias de oligonucleotido al menos un grupo fosforotioato, comprendiendo el al menos un cebador al menos un cebador de cola sin marcar, teniendo el cebador de cola sin marcar una region de cola, comprendiendo la region de cola una secuencia de oligonucleotidos identica o sustancialmente homologa a la secuencia de oligonucleotidos de la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple, siendo la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple un cebador a partir del cual se inicia la sintesis de ADN una vez generada una secuencia complementaria para la primera secuencia de nucleotidos de marcado simple durante el proceso de PCR, de manera que la segunda secuencia de oligonucleotidos de marcado simple deja de ser capaz de hibridarse con la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple, generando en virtud de ello una senal medible;

c) medir la senal detectable que se genera cuando se hibrida la secuencia complementaria con la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple.

La invencion proporciona asimismo un kit para la deteccion de un producto de extension de cebador producido en presencia de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3'^5', que comprende 1) al menos dos secuencias de oligonucleotidos de marcado simple, p.ej. de diferente Tf, que se hibridan entre si en solucion libre para formar un par desactivado fluorescente que, tras la introduccion de una secuencia complementaria para una o ambas secuencias genera una senal medible cuando se hibrida la secuencia complementaria con una de las al menos dos secuencias de oligonucleotidos de marcado simple; y 2) una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3' a 5'; conteniendo al menos una de las secuencias de oligonucleotidos al menos un grupo fosforotioato, conteniendo al menos una de las bases internas de la al menos una secuencia de oligonucleotidos un grupo fosforotioato y teniendo la al menos una secuencia de oligonucleotidos que contiene el al menos un grupo fosforotioato de 20 a 80 %, opcionalmente, de 30 a 70 % de las bases modificadas con el grupo fosforotioato; y opcionalmente, estando separadas las bases modificadas por al menos una base sin modificar y/o siendo fosforotioatos bases alternas.

Los kit de acuerdo con la invencion tambien pueden contener otros componentes adecuados para su uso en reacciones de extension de cebador, tales como sales de magnesio, dNTP, etc.

En la presente invencion, todos o al menos un cebador utilizado en los cebadores utilizados en los metodos puede contener bases modificadas con fosforotioato. El numero de uniones fosfodiester reemplazadas por fosforotioatos en cualquier cebador dado puede oscilar entre uno y todos los enlaces fosfodiester reemplazados por fosforotioatos. El (los) cebador(es) puede(n) contener fosforotioatos en los extremos 5' y/o 3', sin embargo, es preferible que, como alternativa, o ademas de dichas modificaciones terminales, al menos una de las bases internas del cebador sea un fosforotioato. Por ejemplo, pueden ser fosforotioatos 10-90 %, 20-80 %, 30-70 % o 40-60 % de las bases. En un modo de realization, las bases modificadas con fosforotioato estan separadas por al menos uno, p.ej. de uno a tres, bases (fosforodiester) sin modificar. En un modo de realizacion preferible, bases alternas dentro del (los) cebador(es) son fosforotioatos

El uso de modification con fosforotioato sobre bases alternas de cebadores marcados con fluoroforo (denominadas en el presente documento semi-modification S) en combination con desactivadores sin modificar representa un modo de realizacion preferible de la invencion, ya que ofrece una discrimination particularmente potenciada e intensidad de senal de la PCR.

A continuation, se ilustran ejemplos de diferentes modificaciones con fosforotioato que se pueden utilizar en la presente invencion, en cebadores marcados con fluoroforos o desactivadores, en los que * representa un fosforotioato:

Fluor FAM sin modificar: 5'-FAM- GCGATTAGCCGTTAGGATGA 3'

Fluor FAM 3' S: 5'-FAM- CGATTAGCCGTTAGGATG* A 3'

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Fluor FAM Semi S: 5'-FAMG*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*A 3'

Fluor FAM completamente S: 5'-FAMG*C*G*A*T*T*A*G*C*C*G*T*T*AG*G*A*T*G*A 3'

Fluor HEX sin modificar: 5'-HEX- GTCGGTGAACAGGTTAGAGA 3'

Fluor HEX 3' S: 5'-HEX- GTCGGTGAACAGGTTAGAG* A 3'

Fluor HEX Semi S: 5'-HEXG*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*A 3'

Fluor HEX completamente S: 5'-HEXG*T*C*G*G*T*G*A*A*C*A*G*G*T*T*A*G*A*G*A 3'

Desactivador FAM normal: 5' CCTAACGGCTAATCGC-3'Dabsyl Desactivador FAM Semi S V1.0: 5'C*CT*AA*CG*GC*TA*AT*CG*C -3'Dabsyl Desactivador FAM Semi S V2.0: 5'CC*TA*AC*GG*CT*AA*TC*GC -3'Dabsyl Desactivador FAM Completamente S: 5'C*C*T*A*A*C*G*G*C*T*A*A*T*C*G*C -3'Dabsyl Desactivador HEX Completo S: 5' AACCTGTTCACCGAC-3'Dabsyl Desactivador HEX Semi S V1.0: 5'AA*CC*TG*TT*CA*CC*GA*C-3'Dabsyl Desactivador HEX Semi S V2.0: 5'A*AC*CT*GT*TC*AC*CG*AC-3'Dabsyl Desactivador HEX completamente S: 5'A*A*C*C*T*G*T*T*C*A*C*C*G*A*C-3'Dabsyl

Las secuencias de oligonucleotido que contienen al menos un grupo fosforotioato para su uso en la presente

invention se pueden sintetizar a traves de metodos conocidos entre los especialistas en la tecnica.

La presente invencion encuentra uso en diversas aplicaciones diferentes, siendo particularmente adecuada para su uso en reacciones basadas en PCR, incluyendo aplicaciones de detection de SNP, aplicaciones detection de variacion alelica, PCR en tiempo real y similares.

Tal como se ha indicado anteriormente, la presente divulgation proporciona metodos para reducir la amplification no especifica y/o la formation de cebadores-dimeros en una reaction de extension de cebador dependiente de molde y para detectar la production de productos de extension de cebador en una mezcla de reaccion de extension de cebador, p.ej. determinando si los productos de extension de cebador se producen o no en una reaccion de extension de cebador. Se entiende por producto de extension de cebador una molecula de acido nucleico que resulta de una reaccion de extension de cebador dependiente de molde. Las reacciones de extension dependientes de molde son las reacciones en las que una polimerasa extiende la molecula de cebador de acido nucleico que se hibrida con una molecula de acido nucleico molde, determinandose la secuencia de bases que se anade al extremo de la molecula de acido nucleico del cebador por la secuencia de bases en la cadena del molde. Las reacciones de extension de cebador dependientes de molde incluyen reacciones de extension de cebador tanto de amplificacion como de no amplificacion. En algunos modos de realization de la presente invencion, la reaccion de extension del cebador dependiente de molde en la que se detecta la produccion de los productos de extension de cebador es una reaccion de amplificacion, p.ej. una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).

En la presente divulgacion, la reaccion de extension de cebador dependiente de molde en la que se detecta la produccion de los productos de extension de cebador es una reaccion que contiene cebadores modificados con grupos fosforotioato en combination con polimerasas que carecen de actividad nucleasa 3'^5'.

En la practica de los metodos de la presente divulgacion, la primera etapa consiste en producir una mezcla de extension de cebador, p.ej. una composition que incluye todos los elementos necesarios para que tenga lugar la reaccion de extension de cebador. Por ejemplo, la mezcla de extension de cebador puede incluir al menos dos secuencias de oligonucleotido de marcado simple, p.ej. de diferente Tf, que se hibridan entre si en una solution libre para formar un par desactivado fluorescente que, tras la introduction de una secuencia complementaria para una o ambas secuencias genera una senal medible, teniendo por ejemplo una de las secuencias un Tf que esta a la Th, o por debajo de ella, (“par cebador casete FET”), conteniendo al menos una de las secuencias de oligonucleotido al menos un grupo fosforotioato.

Tiene lugar la FET cuando estan en intima proximidad un dador de energia fluorescente adecuado y una fraction de aceptor de energia. La energia de excitation absorbida por el dador se transfiere al aceptor que puede seguir disipando esta energia entonces ya sea por emision fluorescente, si es un fluoroforo, o por medios no fluorescentes, si se trata de un desactivador. Un par dador-aceptor comprende dos fluoroforos que tienen espectros que se

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solapan, solapandose la emision del dador con la absorcion del aceptor, de manera que existe una transferencia de energia desde el fluoroforo excitado al otro miembro del par. No es esencial que el fluoroforo excitado emita fluorescencia realmente, siendo suficiente que el fluoroforo excitado sea capaz de absorber eficazmente la energia de excitacion y la transfiera eficazmente al fluoroforo emisor.

Como tales, el (los) casete(s) FET empleados en los metodos objeto de la invencion son detectores de acidos nucleicos que incluyen en oligonucleotidos por separado un dominio de fluoroforo, en el que esta ubicado el dador de energia fluorescente, es decir el dador, y un segundo oligonucleotido con un dominio aceptor, en el que esta ubicado el aceptor de energia fluorescente, es decir el aceptor. Tal como se ha mencionado anteriormente, el oligonucleotido dador incluye el fluoroforo dador. El fluoroforo dador puede estar ubicado en cualquier parte del detector de acido nucleico, si bien esta presente normalmente en el extremo 5' del detector.

El dominio aceptor incluye el aceptor de energia fluorescente. El aceptor puede estar ubicado en cualquier parte del dominio aceptor, si bien esta presente normalmente en el extremo 3' del detector de acido nucleico.

Ademas de los dominios de aceptor y fluoroforo, los oligonucleotidos del aceptor de casete FET tambien incluyen un dominio de union de acido nucleico diana que se une a una secuencia de acido nucleico diana que se crea a partir de los cebadores de cola no marcados incluidos en la reaccion, p.ej. en condiciones de hibridacion rigurosas (tal como se define mas adelante).

Dependiendo de la naturaleza del oligonucleotido y el propio ensayo, el dominio de union diana puede hibridarse con la region del producto de extension de cebador. Por ejemplo, cuando el ensayo es un ensayo de genotipificacion de SNP, p.ej. en el que se emplea un sistema informador de casete universal, el dominio de union diana se hibrida en condiciones rigurosas con el sitio de union diana del producto de extension de cebador. Los fluoroforos para los pares de oligonucleotido FET se pueden seleccionar para que sean de una familia quimica similar o diferente, tales como colorantes cianina, xantenos o similares. Los floroforos de interes incluyen sin limitarse solo a ellos, colorantes de fluoresceina (p.ej. 5-carboxifluoresceina (5-FAM), 6-carboxifluoresceina (6-FAM), 2',4',1,4,-tetraclorofluorescema (TET), 2\4',5',7',1,4-hexaclorofluorescema (HEX), y 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluorescema (JOE)), colorantes de cianina como Cy5, dansyl derivados, colorantes de rodamina ( p.ej. tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), y tetrapropano-6-carboxirodamina (ROX)), DABSYL, DABCYL, cianina, como Cy3, antraquinona, nitrotiazol y compuestos de nitroimidazol y similares. Los fluorofluoros de interes se describen ademas en las solicitudes de patente internacionales WO 01/42505 y WO 01/86001.

Dado que la mezcla de reaccion de extension de cebador producida en la etapa inicial de los metodos objeto de la invencion es una mezcla de reaccion de extension de cebador deficiente en exonucleasa 3'^5' incluye ademas una enzima que no tiene actividad exonucleasa 3'^5'. En muchos modos de realizacion, la combinacion de polimerasas empleada incluye al menos una Familia A, correspondiendo los terminos “Familia A" y “Familia B” al esquema de clasificacion notificado en Braithwaite & Ito, Nucleic Acids Res. (1993) 21:787-802. Las polimerasas de Familia A de interes incluyen: Thermus aquaticus polimerasas, incluyendo la polimerasa natural (Taq) y derivados y homologos de la misma, como Klentaq (tal como se describe en Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. (1994) 91:2216-2220); Thermus thermophiles polimerasas, incluyendo la polimerasa natural (Tth) y derivados y homologos de la misma, y similares. La polimerasa para su uso en la invencion se puede utilizar en forma purificada o sin purificar.

Otro componente de la mezcla de reaccion producido en la primera etapa de los metodos es el acido nucleico molde. El acido nucleico que sirve como molde puede ser de cadena simple o de doble cadena, siendo el acido nucleico normalmente acido desoxiribonucleico (ADN). La longitud del acido nucleico molde puede ser de tan solo 50 pb, si bien normalmente es de al menos aproximadamente 100 pb de longitud, mas comunmente al menos aproximadamente 150 pb de longitud, y puede tener una longitud de hasta 10.000 pb de longitud, p.ej. 50.000 pb de longitud o mas, incluyendo un extracto de ADN genomico o un digesto del mismo, etc. El acido nucleico puede estar libre en solucion, flanqueado por uno o ambos lados con el acido nucleico que no es el molde, presente en un vector, p.ej. plasmido y similar, siendo el unico criterio que el acido nucleico este disponible para participar en la reaccion de extension de cebador. El acido nucleico molde puede estar presente en forma purificada o formando complejo con otros acidos nucleicos que no son molde, p.ej. en preparacion de ADN celular, etc.

El acido nucleico molde puede derivarse de diversas fuentes, dependiendo de la aplicacion para la que se realice la PCR, incluyendose entre dichas fuentes organismos que comprenden acidos nucleicos, es decir, virus; procariotas, p.ej. bacterias, archaea y cianobacterias; y eucariotas, p.ej. miembros del reino protista, como flagelados, amebas y sus parientes, parasitos ameboides, ciliados y similares, miembros del reino de los hongos, como mohos mucilaginosos, mohos mucilaginosos acelulares, mohos mucilaginosos celulares, mohos acuaticos, mohos verdaderos, hongos conjugados, ascomicetos, hongos cavarioides, hongos imperfectos y similares; plantas como algas, musgos, hepaticas, anthocerophyta, lycopodiopsida, Equisetum, helechos, gimnospermas y plantas de flor, monocotiledoneas y dicotiledoneas; y animales, incluyendo esponjas, miembros de phylum cnidaria, p.ej. medusas, corales y similares, ctenoforos, gusanos, rotiferos, nematodos, anelidos, moluscos, artropodos, equinodermos, gusanos bellota, y vertebrados, incluyendo reptiles, peces, aves, serpientes y mamiferos, p.ej. roedores, primates, incluyendo seres humanos y similares. El acido nucleico molde puede utilizarse directamente desde su fuente natural y/o procesarse previamente de diversas formas, tal como se conoce en la tecnica. En algunos modos de

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realizacion, el acido nucleico molde puede provenir de una fuente sintetica.

El siguiente componente de la mezcla de reaccion producida en la primera etapa de los metodos objeto de la invention esta constituido por los cebadores empleados en la reaccion de extension de cebador, p.ej. los cebadores de PCR (tales como cebadores directos e inversos empleados en amplification geometrica o un cebador unico empleado en amplificacion lineal). Cada mezcla de reaccion de extension de cebador comprendera al menos dos cebadores (en caso de amplificacion lineal) y, normalmente, tres cebadores, y mas normalmente de cinco a siete cebadores en el caso de una reaccion de genotipificacion de SNP. Una mezcla de reaccion de extension de cebador comprendera al menos un cebador dador marcado fluorescentemente y un aceptor complementario, un cebador marcado con desactivador en el caso de amplificacion lineal, conteniendo uno o ambos cebadores al menos un grupo fosforotioato.

Mas habitualmente, en el caso de amplificacion exponencial, la mezcla de extension de cebador comprendera al menos un cebador dador marcado fluorescentemente y un aceptor complementario, un cebador marcado con desactivador y un cebador sin marcar inverso, conteniendo uno o cualquiera de los cebadores al menos un grupo fosforotioato. Lo mas habitual es, en el caso de amplificacion exponencial en la que se utiliza un sistema informador universal, que la mezcla de extension de cebador comprenda al menos un cebador aceptor marcado fluorescentemente y un dador complementario, un cebador marcado con desactivador, un cebador sin marcar inverso y un cebador directo de cola, conteniendo uno o cualquiera de los cebadores al menos una modification fosforotioato. Los cebadores de oligonucleotido con los que entra en contacto el acido nucleico molde (en adelante denominado ADN molde para mayor facilidad) sera suficientemente largo como para proporcionar hibridacion con el ADN molde complementario en condiciones de hibridacion (descritas con mayor detalle mas adelante), pero no tendra una longitud suficiente como para formar hibridos estables con el ADN molde en condiciones de polimerizacion. Los cebadores pueden tener una longitud de al menos 10 pb, p.ej. al menos 15 pb o 16 pb de longitud. Los cebadores pueden tener una longitud de 30 pb de longitud o mas, por ejemplo, la longitud de los cebadores puede ser 18 a 60 pb de longitud, como por ejemplo de aproximadamente 20 a 35 pb de longitud. Se puede poner en contacto del aDn molde con un solo cebador o con un grupo de dos cebadores (cebadores directo e inverso), dependiendo de si se desea la extension del cebador, amplificacion lineal o exponencial del ADN molde. Cuando se emplea un unico cebador, el cebador tendra normalmente complementariedad con uno de los extremos 3' del ADN molde y cuando se emplean dos cebadores, los cebadores tendran normalmente complementariedad con los dos extremos 3' del ADN molde de doble cadena.

Tal como se utiliza en el presente documento, “acido nucleico" significa ADN, ARN, tanto monocatenario como de doble cadena, asi como cualquier modificacion quimica de los mismos. Las modificaciones incluyen, sin limitarse solo a ellas, las que proporcionan otros grupos quimicos que incorporan una carga adicional, polarizabilidad, union de hidrogeno, interaction electrostatica y funcionalidad al acido nucleico. Dichas modificaciones incluyen, sin limitarse solo a ellas, modificaciones con azucar en la position 2', modificaciones con pirimidina en la position 5, modificaciones con purina en la posicion 8, modificaciones con aminas exociclicas, sustitucion con 4-tiouridina, sustitucion con 5-bromo o 5-yodo-uracilo; modificaciones en la cadena principal, metilaciones, combinaciones de apareamientos de bases inusuales, combinaciones como las isobases isocitidina e isoguanidina y similares. Las modificaciones tambien pueden incluir modificaciones en 3' y 5', como protection con capuchon.

Tal como se utiliza en el presente documento “complementario" se refiere al par de bases de nitrogeno que consiste en una purina unidad por enlaces de hidrogeno a pirimidina, que conecta las cadenas complementarias de ADN o de moleculas hibridas que unen ADN y ARN.

Tal como se utiliza en el presente documento “grupo fluorescente" se refiere a una molecula que al excitarse con luz con longitud de onda seleccionada, emite luz de una longitud de onda diferente. Grupos fluorescentes se puede referir tambien a “fluoroforos".

Tal como se utiliza en el presente documento “grupo de modificacion de la fluorescencia" se refiere a una molecula que puede alterar en algun modo la emision de fluorescencia desde un grupo fluorescente. Un grupo de modificacion de fluorescencia lo lleva a cabo a traves de un mecanismo de transferencia de energia. Dependiendo de la identidad del grupo de modificacion de la fluorescencia, la emision de fluorescencia puede sufrir una serie de alteraciones, incluyendo, pero sin limitarse solo a ellas, atenuacion, desactivacion completa, potenciacion, cambio de longitud de onda, cambio de polaridad, cambio en la duration de la fluorescencia. Un ejemplo de grupo de modificacion de la fluorescencia es un grupo de desactivacion.

Tal como se utiliza en el presente documento “transferencia de energia" se refiere al proceso segun el cual se altera la emision de fluorescencia de un grupo fluorescente a traves de un grupo de modificacion de fluorescencia. Si el grupo de modificacion de fluorescencia es un grupo de desactivacion, entonces la emision de fluorescencia del grupo fluorescente se atenua (desactiva). La transferencia de energia puede tener lugar por transferencia de energia de resonancia fluorescente, o por transferencia de energia directa. Los mecanismos exactos de transferencia de energia en estos dos casos son diferentes. Debe entenderse que cualquier referencia a la transferencia de energia en la presente solicitud abarca todos estos fenomenos con diferentes mecanismos. La transferencia de energia tambien se denomina en el presente documento transferencia de energia fluorescente o FET.

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Tal como se utiliza en el presente documento “par de transferencia de ene^a” se refiere a dos moleculas cualquiera que participen en la transferencia de energia. Normalmente, una de las moleculas actua como grupo fluorescente y la otra actua como grupo de modificacion de la fluorescencia. El par de transferencia de energia preferible de la presente invencion comprende un grupo fluorescente y un grupo de desactivacion. En algunos casos, la distincion entre el grupo fluorescente y el grupo de modificacion de la fluorescencia puede ser borrosa. Por ejemplo, en determinadas circunstancias dos grupos fluoresceina adyacentes pueden desactivar entre si la emision fluorescente por transferencia de energia directa. Por esta razon, no hay ninguna limitacion en cuanto a la identidad de cada uno de los miembros del par de transferencia de energia en la presente solicitud. Lo unico que se necesita es que las propiedades espectroscopicas del par de transferencia de energia en conjunto cambien de una manera medible si se altera la distancia entre cada uno de los miembros en una cantidad critica.

“Par de transferencia de energia” se utiliza para referirse a un grupo de moleculas que forman un complejo unico dentro del cual tiene lugar la transferencia de energia. Dichos complejos pueden comprender por ejemplo dos grupos fluorescentes que pueden ser diferentes entre si y un grupo de desactivacion, dos grupos de desactivacion y un grupo fluorescente o multiples grupos fluorescentes y multiples grupos de desactivacion. En los casos en los hay multiples grupos fluorescentes y/o multiples grupos de desactivacion, los grupos individuales pueden ser diferentes entre si.

Tal como se utiliza en el presente documento “cebador” se refiere a un oligonucleotido que es capaz de actuar como punto de inicio de la sintesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la sintesis del producto de extension de cebador que es complementario a la cadena de acido nucleico (p.ej. en condiciones de hibridacion rigurosas). El termino “secuencia de oligonucleotidos” se puede utilizar en el presente documento para referirse a un cebador y viceversa.

Tal como se utiliza en el presente documento “grupo de desactivacion” se refiere a un grupo de modificacion de la fluorescencia que puede atenuar al menos parte de la luz emitida por un grupo fluorescente. Los autores de la invencion se refieren a esta atenuacion en el presente documento como “desactivacion”. Por lo tanto, la iluminacion del grupo fluorescente en presencia del grupo de desactivacion lleva a una senal de emision que es menos intensa de lo esperado o que esta ausente completamente. La desactivacion tiene lugar a traves de transferencia de energia entre el grupo fluorescente y el grupo de desactivacion.

Tal como se utiliza en el presente documento “transferencia de energia de resonancia fluorescente” o “FRET” se refiere a un fenomeno de transferencia de energia en el que la luz emitida por el grupo fluorescente excitado es absorbida al menos parcialmente por un grupo de modificacion de fluorescencia. Si el grupo de modificacion de fluorescencia es un grupo de desactivacion, entonces el grupo puede radiar la luz absorbida como luz de diferente longitud de onda o puede disiparla en forma de calor. FRET depende del solapamiento entre el espectro de emision del grupo fluorescente y el espectro de absorcion del grupo de desactivacion. FRET tambien depende de la distancia entre el grupo de desactivacion y el grupo fluorescente. Por encima de cierta distancia critica, el grupo de desactivacion no puede absorber la luz emitida por el grupo fluorescente o solamente de forma escasa.

Tal como se utiliza en el presente documento “cebador de cola” se refiere a un oligonucleotido que contiene dos dominios, uno especifico para el ADN molde diana de interes y el otro, una secuencia unica que sirve como molde para la produccion del producto a partir de cebadores universales presentes en cada reaccion de PCR distinta y diferente.

Tal como se utiliza en el presente documento “transferencia de energia directa” se refiere a un mecanismo de transferencia de energia en el que no tiene lugar el paso de fotones entre el grupo fluorescente y el grupo de modificacion de fluorescencia. Sin vincularse a un mecanismo unico, se cree que, en la transferencia de energia directa, el grupo fluorescente y el grupo de modificacion de la fluorescencia interfieren con las estructuras electronicas de uno y otro. Si el grupo de modificacion de fluorescencia es un grupo de desactivacion, esto tendra como resultado que el grupo de desactivacion impida que el grupo de fluorescencia emita luz.

En general, la desactivacion por transferencia de energia directa es mas eficaz que la desactivacion por FRET. De hecho, algunos grupos de desactivacion que no desactivan grupos de fluorescencia en particular por FRET (porque no tienen el necesario solapamiento de espectro con el grupo fluorescente) lo pueden hacer eficazmente por transferencia de energia directa. Asimismo, algunos de los grupos fluorescentes pueden actuar como grupos de desactivacion por si mismos si estan lo suficientemente cerca de otros grupos fluorescentes como para causar la transferencia de energia directa. Por ejemplo, en estas condiciones, dos grupos de fluoresceina adyacentes pueden desactivar la fluorescencia uno a otro eficazmente. Por estas razones, no hay limitacion en cuanto a la naturaleza de los grupos fluorescentes y los grupos de desactivacion utiles para la puesta en practica de la presente invencion.

Un ejemplo de “condiciones de hibridacion rigurosas” consiste en hibridacion a 50 °C o mas y 6.0*SSC (900 mM NaCl / 90 mM citrato sodico). Otro ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas consiste en incubacion durante toda la noche a 42°C o mas en una solucion de: 50 % formamida, 6*SSC (900 mM NaCl, 90 mM citrato trisodico), 50 mM fosfato sodico (pH 7,6), 10 % sulfato de dextrano y 20 ug/ml de ADN de esperma de salmon esquilado, desnaturalizado. Condiciones de hibridacion rigurosas son condiciones de hibridacion que son al menos tan

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rigurosas como las condiciones representativas mencionadas, considerandose las condiciones como al menos tan rigurosas cuando son en aproximadamente un 80 % tan rigurosas, normalmente, en al menos aproximadamente un 90 % tan rigurosas como las condiciones rigurosas espedficas expuestas. Otras condiciones de hibridacion rigurosas son conocidas en la tecnica y se pueden emplear tambien.

Las referencias a secuencias que son identicas en el presente documento se pueden interpretar como secuencias que son identicas o sustancialmente homologas entre si.

Entre los ejemplos del uso de la presente invencion se incluyen los siguientes:

Deteccion directa de productos de PCR

Este modo de realizacion, ilustrado en la FIG. 1 utiliza un cebador de oligonucleotido para iniciar el proceso de PCR. Se dirige dicho cebador convencional a la region de molde de interes y por tanto conduce la especificidad de la reaccion. Dicho oligonucleotido esta marcado tambien fluorescentemente en el extremo 5'. Existen distintos fluoroforos adecuados siendo una eleccion popular FAM (un derivado de fluoresceina). Finalmente, se incluye en la reaccion un oligonucleotido marcado con desactivador 3' antisentido para el oligonucleotido marcado FAM. Existe una serie de marcadores adecuados, optandose por lo general por la serie de marcadores desactivadores Black Hole. Siempre y cuando la longitud del oligonucleotido desactivador sea lo suficientemente larga como para dar una Tf por encima de la Th de la reaccion, se puede evaluar la generation de producto en cada ciclo del proceso de PCR en cualquier instrumento de PCR tiempo real (como por ejemplo ABI 7900 Prism Instrument). Alternativamente, se puede emplear en la reaccion un oligonucleotido de desactivacion que tenga una Tf por debajo de la Th de la reaccion. Despues de la PCR se enfria la reaccion a temperatura ambiente y se pueden evaluar los productos en cualquiera de dichos instrumentos en tiempo real y ademas cualquier lector de placa fluorescente (como por ejemplo BMG Pherastar).

Gracias a la complementariedad de los dos oligonucleotidos marcados (desactivador y fluoroforo marcados), se hibridan entre si. Esta hibridacion acerca el marcador del desactivador muy proximo al fluoroforo produciendo asi en conjunto una senal fluorescente de la molecula FAM desactivada, cuando se excita a 488 nm (la longitud de onda de excitation optima de FAM).

Se incluyen tambien en la reaccion un cebador inverso convencional para crear un par de cebador de PCR. El proceso PCR se inicia entonces y se empieza a generar el producto de PCR.

Despues de los primeros ciclos de PCR se genera la secuencia antisentido del cebador fluorescente. Durante este proceso, el oligonucleotido de desactivador deja de unirse; esto produce el amplicon que contiene una molecula FAM 5'. Una vez que esto ocurre, el oligo de desactivacion deja de tener capacidad de hibridarse con el oligonucleotido marcado con FAM, ya que el proceso de PCR produce un ADN de amplicon de doble cadena. Dado que el oligonucleotido de desactivacion deja de poder hibridarse con el oligonucleotido FAM, se genera entonces una senal que es directamente proporcional a la cantidad de producto PCR generada.

Deteccion indirecta (tiempo real) de productos de PCR

Este modo de realizacion, ilustrado en la FIG.2, utiliza un oligonucleotido convencional (cebador) para iniciar el proceso de PCR. El cebador convencional tiene una cola con una secuencia de ADN que no va dirigida a la region de amplicon de interes, en virtud de lo cual esta cola es esencialmente inerte. Esta secuencia de cola esta ubicada en la portion 5' del cebador. Tambien se incluye en la reaccion un oligonucleotido marcado fluorescentemente unico que es identico o sustancialmente homologo a la region de secuencia de cola del cebador convencional. Existe una serie de fluoroforos adecuados, optandose por lo general por FMA (un derivado de fluoresceina). Finalmente, se incluye en la reaccion un oligonucleotido marcado con desactivador 3' antisentido para el oligonucleotido marcado con FAM. Existe una serie de marcadores adecuados, optandose por lo general por la serie de marcadores de desactivador Black Hole.

Siempre y cuando la longitud del oligonucleotido de desactivador sea lo suficientemente larga como para dar una Tf por encima de la Ta de la reaccion, se puede evaluar la generacion del producto en cada ciclo del proceso de PCR en cualquier instrumento de PCR en tiempo real (como por ejemplo, un ABI 7900 Prism instrument). Alternativamente, la reaccion puede emplear un oligonucleotido de desactivacion que tiene una Tf por debajo de la Th de la reaccion. Tras la PCR se enfria la reaccion a temperatura ambiente y se pueden evaluar los productos en cualquiera de dichos instrumentos en tiempo real, asi como con un lector de placa fluorescente (como por ejemplo BMG Pherastar).

Gracias a la complementariedad de los dos oligonucleotidos marcados, se hibridan entre si. Esta hibridacion acerca el marcador del desactivador muy proximo al fluoroforo, produciendo asi en conjunto una senal fluorescente desde la molecula FAM desactivada, cuando se excita a 488 nm (la longitud de onda de excitacion optima de FAM). A continuation, se inicia el proceso de PCR y se empieza a generar el producto de PCR. Despues de los primeros ciclos de PCR se genera la secuencia antisentido del cebador fluorescente. El cebador de PCR fluorescente es

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entonces capaz de iniciar la smtesis durante la PCR y asi lo hace. Esto produce amplicon que contiene una molecula FAM 5'. Una vez que esto ocurre, el oligo de desactivacion deja de ser capaz de hibridarse con el oligonucleotido marcado con FAM, ya que el proceso de PCR produce ADN de amplicon de doble cadena. Dado que el oligonucleotido de desactivacion deja de poder hibridarse con el oligonucleotido FAM, se genera entonces una senal que es directamente proporcional a la cantidad de producto de PCR generado.

La region de cola del cebador de cola no tiene por que ser identica al oligonucleotido marcado fluorescentemente unico, siempre y cuando una secuencia antisentido de la region de cola generada se hibride con el oligonucleotido marcado fluorescentemente unico.

Deteccion indirecta (punto final) de productos de PCR - Genotipificacion de SNP

El modo de realizacion ilustrado en la FIG. 3 utiliza el mismo par de oligonucleotidos marcado con fluoroforo e desactivador que el descrito en la FIG. 2. El esquema de reaccion es identico, salvo algunas modificaciones.

Para producir la genotipificacion de SNP se requiere el uso de dos cebadores marcados fluorescentemente y que corresponden a los oligonucleotidos marcados con desactivador. Cada cebador tiene tambien en este caso una cola con una secuencia unica, en la que se incluye, en la reaccion, un cebador marcado fluorescentemente 5'. Dos colorantes adecuados son FAM y HEX, de resolucion espectral entre si. Los dos cebadores (porcion sin cola; generalmente denominados directos) se dirigen al ADN de interes. En esta porcion del cebador, difieren normalmente unicamente en un solo nucleotido en su base 3' terminal. Cada uno de los cebadores se dirige a la base polimorfica en el ADN de interes. Se lleva a cabo la PCR y los dos cebadores unicamente inician la smtesis cuando la base 3' esta perfectamente apareada. Cuando se produce un desapareamiento, la smtesis no prosigue.

Durante la reaccion, la cola especifica dependiendo del genotipo es capaz de iniciar la smtesis (o ambos, en el caso de un heterocigoto). Esto vuelve a incorporar la porcion de cola fluorescente del cebador en el producto de PCR impidiendo asi la hibridacion del oligonucleotido del desactivador. Se genera por tanto una senal segun cual de los oligonucleotidos ha iniciado la smtesis. A continuacion, se lee la reaccion en un lector de placa fluorescente para ambos fluoroforos. A continuacion, se traza un grafico de los datos resultantes y se genera un diagrama de racimo de un fluoroforo sobre otro. A continuacion, se pueden determinar los genotipos resultantes basandose en los graficos de racimo.

Otro uso mas del sistema oligo par fluoroforo desactivador descrito es en la deteccion homogenea de productos de PCR con el uso de actividad nucleasa 5'-3' de Taq polimerasa.

La presente divulgacion e invencion se puede emplear para mejorar la especificidad y formation de cebador dimero que tiene lugar en el ensayo de 5' nucleasa, conocido tambien como taqman.

En la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, la forma singular “un" “uno" y “el" incluyen la referencia en plural a no ser que el contexto lo dicte claramente de otra forma. A no ser que se defina de otra forma, todos los terminos cientificos y tecnicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado por el que los entienden habitualmente las personas especializadas en la tecnica a la que pertenece la presente invencion.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor interviniente, hasta la decima parte de la unidad del limite inferior a no ser que el contexto lo dicte claramente de otra forma, entre el limite superior y el limite inferior de dicho intervalo y cualquier otro valor interviniente o senalado en dicho intervalo indicado, queda abarcado en la invencion. Los limites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos pueden incluirse independientemente en intervalos mas pequenos y tambien quedan abarcados por la presente invencion, sujetos a cualquier limite excluido de manera especifica en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos limites, los intervalos que excluyen cada uno o ambos de dichos limites incluidos tambien se incluyen en la presente invencion.

A continuacion, se describira la invencion haciendo referencia a los siguientes ejemplos que tienen un fin unicamente ilustrativo sin pretenderse que limiten el alcance de la presente invencion.

EJEMPLO 1

Abreviaturas:

FAM: 6-Carboxi Fluoresceina

HEX: 2',4',5',7',1,4-hexaclorofluorescema

Dabcyl : desactivador oscuro no fluorescente

Se disenaron siete oligonucleotidos cuyas secuencias se pueden encontrar a continuacion, en las que * representa uso de modification S:

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1) Oligonucleotido marcado con fluorescema FAM Semi S: 5'-FAMG*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*A3'

2) Oligonucleotido marcado fluorescentemente HEX Semi S: 5'-HEXG*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*A3'

3) Desactivador FAM normal: 5' CCTAACGGCTAATCGC-3'Dabsyl

4) Desactivador HEX normal: 5' AACCTGTTCACCGAC-3'Dabsyl

5) Cebador 1 espedfico de alelo: 5' GCGATTAGCCGTTAGGATGACTGAGTGCAGGTTCAGACGTCC3'

6) Cebador 2 espedfico de alelo: 5' GTCGGTGAACAGGTTAGAGACTGAGTGCAGGTTCAGACGTCT3'

7) Cebador inverso comun: 5' CTCCCTTCCACCTCCGTACCAT3'

Se puede apreciar que en este ejemplo, el cebador de desactivador marcado con FAM tiene una secuencia de oligonucleotido de 16 meros y es mas corta en mas de 2 nucleotidos que la sonda cebador/informador marcada con FAM y, de manera similar, el cebador de desactivador marcado con HEX tiene una secuencia de oligonucleotidos de 15 meros y es mas corta en mas de 2 nucleotidos que la sonda cebador/informador marcada con HEX. Por consiguiente, las sondas cebador/informador marcadas con FAM HEX tienen una Tf que esta a los 57 °C de la Th de la etapa de hibridacion del proceso de PCR, o por encima de ella, y se hibridara con el molde en el proceso, mientras que los cebadores de desactivador mas cortos estan por debajo de los 57 °C de la Th de la etapa de hibridacion, o por debajo de ella, y no se hibridaran con el molde.

Se diluyeron todos los oligonucleotidos a concentraciones iniciales de 200 |jM en 10 mM Tris/ HCl pH 8,0. Se llevaron todas las posteriores diluciones en este diluente. Se creo una mezcla de ensayo que incluyo los siguientes componentes:

(1) 0,16 uM cebador 1 espedfico de alelo

(2) 0,16 uM cebador 2 espedfico de alelo

(3) 0,41 uM cebador inverso (comun)

(4) 0,1 uM oligonucleotido marcado con FAM

(5) 0,1 uM Oligonucleotido marcado con HEX

(6) 0,5 uM oligonucleotido marcado con desactivador (antisentido a oligonucleotido 4)

(7) 0,5 uM oligonucleotido marcado con desactivador (antisentido a oligonucleotido 5)

(8) 30-90 Unidades/ml Taq polimerasa N-terminal truncada

(9) 10 mM Tris / HCl pH 8,3

(10) 10 mM KCl

(11) 1,8 mM cloruro de magnesio

(12) 165,2 uM dNTPs

(13) 212,5 nM 5-carboxi-X-rodamina, SE (5-ROX. SE)

Se anadieron a pocillos A1-B24 de una placa de microtitulacion de 384 pocillos 10 ng de ADN genomico de 44 individuos caucasianos. Los 4 pocillos restantes se dejaron vados y sirvieron como pocillos de control negativo. A continuacion, se seco la placa a 50 °C durante un periodo de 1 hora.

Se anadio a los pocillos A1-B24 de la placa secada 5 jl de mezcla de ensayo y se sello la placa utilizando un

sellador de placa de fusion transmision diodo laser (KBioscience RU Ltd). A continuacion, se sometio la placa a un

ciclo termico en las siguientes condiciones en un Hydrocycler (KBioscience RU Ltd):

94 °C durante 15 minutos activacion de arranque en caliente 94 °C durante 20 segundos

61 - 55 °C durante 60 segundos (caida 0,8°C por ciclo)

10 ciclos en las condiciones indicadas 94 °C durante 20 segundos 55 °C durante 60 segundos 26 ciclos en las condiciones indicadas

Tras el ciclo termico se determino la fluorescencia asociada con cada pocillo utilizando un lector de placa BMG Pherastar. Se leyo cada pocillo tres veces en las siguientes combinaciones de longitud de onda.

Excitacion FAM: 485 nm, Emision FAM: 520 nm Excitacion HEX: 535 nm, Emision HEX: 556 nm Excitacion ROX: 575 nm, Emision ROX: 610 nm

A continuacion, se trazo un grafico con los datos resultantes como senal FAM dividida por ROX en el eje de las X y senal HEX dividida por ROX en el eje de las Y.

Tal como se puede observar del grafico de dispersion de la FIG.4, son visibles tres grupos claramente discernibles asociados con los correspondientes genotipos lo que demuestra claramente la eficacia de la tecnologia de deteccion.

5 EJEMPLO 2

Siguiendo un protocolo similar al descrito en el Ejemplo 1, se llevaron a cabo ensayos para comparar el uso de oligonucleotidos marcados fluorescentemente de configuraciones (i) no S modificadas, (ii) semi-S modificadas (fosforotioatos alternos) y (iii) completamente S-modificados. Los datos generados se presentan en la FIG. 5. Los 10 datos presentados para el ensayo 1 demuestran el uso de las configuraciones (i), (ii) y (iii) (arriba); los datos para el ensayo 2 demuestran las configuraciones (i) y (ii). En ambos ensayos los oligonucleotidos de desactivador no tuvieron modificacion con fosforotioato.

Se observo una mejor especificidad y una menor amplificacion del control sin molde (vease abajo a la izquierda del 15 grafico de dispersion) con todas las variantes de los fluor modificados con fosforotioato. El uso de modificacion con fosforotioato en todas las bases del oligonucleotido marcado fluorescentemente tuvo cierto efecto sobre la velocidad de PCR y la intensidad de senal. Se observo que el uso de modificacion de fosforotioato en bases alternas de los cebadores marcados con fluor (denominada semi-modificacion S) en combinacion con desactivadores sin modificar fue optimo para una mejor discriminacion e intensidad de senal de la PCR.

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Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

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50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para la deteccion de un producto de extension de cebador producido en presencia de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3’^5’, comprendiendo el metodo las etapas de:

a) proporcionar al menos dos secuencias de oligonucleotido de marcado simple que se hibridan entre s^ en solucion libre para formar un par desactivado fluorescente que, tras la introduccion de una secuencia complementaria para una o ambas secuencias genera una senal medible cuando la secuencia complementaria se hibrida con una de las al menos dos secuencias de oligonucleotido de marcado simple, conteniendo al menos una de las secuencias de oligonucleotido al menos un grupo fosforotioato;

b) proporcionar al menos un cebador e iniciar la reaccion de extension de cebador a partir de al menos un cebador utilizando una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3’ a 5’ generando en virtud de ello una secuencia complementaria para al menos una de las secuencias de nucleotido de marcado simple; y

c) medir la senal detectable que se genera cuando se hibrida la secuencia complementaria con una de las al menos dos secuencias de oligonucleotido de marcado simple.
2. Un kit para la deteccion de un producto de extension de cebador producido en presencia de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3’^5’, que comprende:

1) al menos dos secuencias de oligonucleotidos de marcado simple, que se hibridan entre si en solucion libre para formar un par desactivado fluorescente que, tras la introduccion de una secuencia complementaria para una o ambas secuencias genera una senal medible cuando se hibrida la secuencia complementaria con una de las dos secuencias de oligonucleotidos de marcado simple; y

2) una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3’ a 5’;

en el que al menos una de las secuencias de oligonucleotidos contiene al menos un grupo fosforotioato, en el que al menos una de las bases internas de la al menos una secuencia de oligonucleotidos contiene un grupo fosforotioato y en el que la al menos una secuencia de oligonucleotidos que contiene el al menos un grupo fosforotioato tiene del 20 al 80 %, opcionalmente, del 30 al 70 % de las bases modificadas por un grupo fosforotioato; y opcionalmente,

en el que las bases modificadas estan separadas por al menos una base sin modificar y/o en el que fosforotioatos son bases alternas.
3. El metodo o el kit de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que la primera y la segunda secuencias de oligonucleotidos son de diferente Tf (temperatura de fusion) y opcionalmente

a) en donde una de entre la primera y la segunda secuencias de oligonucleotidos tiene una Tf que esta a la Th (temperatura de hibridacion) de la reaccion de extension de cebador, o por debajo de ella, o

b) en donde una de entre la primera y la segunda secuencias de oligonucleotidos tiene una Tf que esta a la Th de la reaccion de extension de cebador, o por encima de ella.
4. Un metodo para la deteccion de un producto de extension de cebador producido en presencia de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3’^5’ utilizando PCR, comprendiendo el metodo las etapas de:

a) proporcionar una primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple y al menos una segunda secuencia de oligonucleotidos de marcado simple, teniendo una Tf diferente la primera y la segunda secuencias de oligonucleotidos, en las que se hibridan la primera y la segunda secuencias de oligonucleotidos entre si en solucion libre para formar un par desactivado fluorescente y al menos un cebador y teniendo una de entre la primera y la segunda secuencias de nucleotidos una Tf que esta a la Th del proceso de PCR, o por debajo de ella, conteniendo al menos una de las secuencias de oligonucleotido al menos un grupo fosforotioato, comprendiendo el al menos un cebador al menos un cebador de cola sin marcar, teniendo el cebador de cola sin marcar una region de cola, comprendiendo la region de cola una secuencia de oligonucleotidos complementaria para una secuencia de oligonucleotidos de la segunda secuencia de oligonucleotidos de marcado simple, siendo la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple un cebador a partir del cual se inicia la sintesis de ADN una vez generada una secuencia complementaria para la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple durante el proceso de PCR, de manera que la segunda secuencia de oligonucleotidos de marcado simple deja de ser capaz de hibridarse con la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple, generando en virtud de ello una senal medible;

b) iniciar la reaccion de extension de cebador a partir del al menos un cebador utilizando una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3’ a 5’ en virtud de lo cual se genera una secuencia complementaria para la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple; y

c) medir la senal detectable que se genera cuando se hibrida la secuencia complementaria con la primera secuencia de oligonucleotidos de marcado simple.
5. Un metodo o un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde uno de los oligonucleotidos de marcado simple es 10 bases mas corto que el otro.

5

10

15

20

25

30

35

40
6. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 en el que el proceso de PCR se controla en tiempo real en cada ciclo o despues de una serie de ciclos, cuando la reaccion no haya generado todav^a suficiente producto como para crear una senal medible, reduciendo la temperatura de la reaccion para permitir que se produzca la hibridacion.
7. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dichos otros oligonucleotidos de marcado simple tienen una Tf que esta por encima de la Th.
8. Un metodo o un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho nucleotido de marcado simple tiene el marcador desactivador del par desactivado fluorescente.
9. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 8, en el que al menos una de las bases internas del (de los) oligonucleotido(s) que contiene(n) grupo fosforotioato es un fosforotioato y en el que el 20-80 %, opcionalmente el 30-70 %, de las bases del (de los) oligonucleotido(s) que contiene(n) grupo fosforotioato son fosforotioatos.
10. Un metodo o un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en genotipificacion de SNP basada en PCR especifica de alelo.
11. Un metodo o un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para controlar la produccion de un amplicon mediante ensayo de 5'-nucleasa, en el que el ensayo 5' nucleasa se emplea para llevar a cabo reacciones de discriminacion alelica.
12. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 11, en el que el producto de extension de cebador se controla a traves del uso de hibridacion solamente, opcionalmente en el que el producto de extension de cebador se controla a traves del uso de hibridacion solamente tras PCR.
13. Un metodo o un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que los oligo pares de desactivacion fluorescente estan en el intervalo de 6 pb a 100 pb, opcionalmente en el intervalo de 6 pb a 100 pb, pero no coinciden en longitud.
14. Un metodo o un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que al menos una de las bases de un oligonucleotido marcado con fluoroforo contiene al menos un grupo fosforotioato.
15. Un metodo o un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los oligo pares de desactivacion fluorescente estan:

a) marcados, uno del par con un fluoroforo y el otro con una molecula de desactivacion no fluorescente; y/o

b) modificados para ser resistentes a la degradacion de nucleasa, y/o

estan marcados con moleculas que son sensibles a la distancia.