ES2340058T3 - Sistema de deteccion para ensayo de pcr. - Google Patents

Abstract

Método de ensayo de detección para un procedimiento de PCR que utiliza FRET, comprendiendo el método las etapas de proporcionar una primera secuencia oligonucleótida de marcaje único y por lo menos una segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera y segunda secuencias oligonucleótidas de diferente Tm, en donde la primera y segunda secuencias oligonucleótidas se hibridan entre sí en solución libre, formando una pareja fluorescente desactivada, proporcionado por lo menos un cebador e iniciando la PCR, generando de esta manera una secuencia complementaria a una o a ambas secuencias, presentando una de entre la primera y segunda secuencias oligonucleótidas una Tm inferior a la Ta del procedimiento de PCR, caracterizado porque la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único consiste de una secuencia oligonucleótida que presenta un único marcaje en un extremo, comprendiendo el cebador o cebadores por lo menos un cebador con cola no marcado, presentando el cebador con cola no marcado una región de cola, comprendiendo la región de cola una secuencia oligonucleótida idéntica a una secuencia oligonucleótida de la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único un cebador a partir del que se inicia la síntesis de ADN tras generarse una secuencia complementaria a la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único durante el procedimiento de PCR, de manera que la segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único ya no puede hibridarse con la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, generando una señal medible.

Description

Sistema de detección para ensayo de PCR.

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Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo sistema de detección basado en la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET), adecuado para la utilización en ensayos de reacción en cadena de polimerasa.

Antecedentes de la invención

El descubrimiento de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) ha revolucionado el campo de la biología molecular, permitiendo la amplificación de cualquier segmento deseado de ADN de cualquier organismo.

Se realiza un uso más especializado de la PCR en las áreas de la cuantificación en tiempo real y de la determinación de punto final de genotipos, en las que se utilizan sistemas de ensayo homogéneos. Un sistema de ensayo homogéneo es un sistema en el que la obtención del resultado de la reacción no requiere la separación física mutua de los componentes de reacción. En otras palabras, la reacción se lleva a cabo y se obtienen los resultados sin intervención física adicional en la reacción.

Durante la monitorización en tiempo real (en otras palabras, la monitorización de la producción de producto en cada ciclo durante el procedimiento de la PCR), la PCR puede utilizarse de un modo cuantitativo. Esto presenta una amplia aplicación en muchos campos, desde el diagnóstico de infecciones víricas hasta la determinación de la abundancia de una especie de ARN mensajero dentro del ARN humano. El procedimiento físico de monitorización de la PCR en tiempo real es complejo, debido a que requiere instrumentación sofisticada que ha sido diseñada específicamente para el procedimiento. Esta instrumentación requiere que el procedimiento de PCR produzca una cantidad medible de luz que se incremente con cada ciclo hasta agotar los componentes de la reacción. Con este fin se han demostrado y explotado comercialmente varios enfoques elegantes. Dos ejemplos de ellos son el ensayo de la nucleasa 5' Taqman, comercializado por Applied Biosystems (USA), y la reacción de detección con verde SYBR, comercializada por Molecular Probes (Países Bajos). Ambos sistemas de PCR cuantitativa funcionan bien, aunque ambos presentan desventajas que resultaría ventajoso superar.

El genotipado (en particular el genotipado de polimorfismos de nucleótido único (SNP)), por otra parte, es un procedimiento menos exigente con la instrumentación. El procedimiento es esencialmente el mismo, en el que se utiliza un sistema de ensayo homogéneo, aunque el requisito de monitorización de los productos de reacción en cada ciclo de la PCR resulta menos crítico. En efecto, la mayoría de científicos que llevan a cabo un genotipado SNP utilizando sistemas basados en la fluorescencia llevan a cabo la PCR y únicamente al final de la reacción determinan los niveles de producto producido. Esto se denomina de manera general análisis de punto final. El genotipado SNP presenta un nivel adicional de complejidad, en el aspecto de que el propósito de la reacción es determinar el genotipo individual de ADN en un único locus dentro del genoma. Los SNPs son marcadores bialélicos que resultan idóneos para su determinación en gran número a bajo coste en ensayos homogéneos fluorescentes. Los diversos sistemas de reacción utilizados actualmente son, nuevamente, la reacción Taqman (Applied Biosystems), el sistema Amplifluor (Serologicals, USA) y el sistema Scorpions (DxS, Reino Unido). Todos son sistemas de reacción elegantes que producen datos de buena calidad, aunque cada uno de ellos presenta sus propias desventajas.

El principio de todos los sistemas de ensayo homogéneos es la utilización del procedimiento físico de la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) para detectar la producción de producto en el procedimiento de la PCR. FRET es el procedimiento en el que, al hallarse dos fluoróforos suficientemente próximos entre sí, se produce un intercambio de transferencia energética entre los mismos al ser excitados por luz a longitudes de onda correspondientes a su longitud de onda de excitación particular. La técnica FRET resulta idealmente adecuada para la cuantificación de la PCR, debido a que permite monitorizar la reacción sin realizar ninguna separación, un procedimiento que resultaría imposible considerando que, en general, se llevan a cabo 40 ciclos de PCR, y que la cantidad de producto debe determinarse después de cada ciclo.

Las técnicas principales utilizadas actualmente funcionan bien pero adolecen de varias desventajas que dificultan su utilización en el mundo científico.

El ensayo Taqman de Applied Biosystems tal como se comenta en, por ejemplo, la patente US nº 5.538.848 (o, más generalmente, un ensayo de 5' nucleasa basado en FRET), requiere la producción de una sonda oligonucleótida de doble marcaje para cada secuencia de ADN que debe medirse. Se hace referencia a esta sonda en su estado previo a la reacción como "desactivada". En otras palabras, dos fluoróforos (o un desactivador no fluorescente y un fluoróforo) se unen a un oligonucleótido corto separados por una distancia entre ellos inferior a 30 nucleótidos. Esta distancia es suficientemente reducida para que, al excitarse uno de los fluoróforos en su longitud de onda óptima, el otro fluoróforo absorbe la energía absorbida y emite luz a una longitud de onda diferente, o en el caso de un desactivador no fluorescente, la energía absorbida es transferida por FRET al desactivador no fluorescente y no se emite luz. En el caso de que esta molécula se encuentre incluida en la reacción, el procedimiento de PCR crea un ADN complementario a la misma. Esto permite que la sonda se una al ADN, siendo posteriormente destruido por la actividad 5' nucleasa de la polimerasa Taq utilizada en el procedimiento de la PCR. Tras la degradación de la sonda, las dos parejas de fluoróforos ya no se encuentran suficientemente próximos para experimentar la FRET y se crea una diferencia medible de luz.

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La desventaja principal del ensayo Taqman es la necesidad de producir sondas oligonucleótidas de marcaje doble. Se requiere una única sonda para las mediciones cuantitativas de la masa del ADN, mientras que se requieren dos para el genotipado SNP (una para cada alelo). La producción de la sonda misma es un procedimiento caro y laborioso. En la actualidad cada sonda puede costar hasta 250 libras esterlinas, proporcionando suficiente reactivo para sólo unos cuantos miles de reacciones. Si se considera que en un proyecto de genotipado SNP pueden estudiarse más de 200 SNPs, el proyecto requeriría una inversión inicial de 10.000 libras esterlinas para la producción de sondas. Ésta es una suma
prohibitiva para muchas organizaciones científicas y, de esta manera, supone una desventaja importante del sistema.

En el área de la expresión génica cuantitativa, con frecuencia se utiliza verde SYBR como alternativa de bajo coste a la utilización de Taqman. El verde SYBR es un pigmento interquelante que únicamente se une a ADN bicatenario. De esta manera, puede utilizarse en ensayos homogéneos de PCR cuantitativa. El producto de la PCR se genera a medida que se incrementa el número de ciclos de reacción, y a medida que se acumula producto, el verde SYBR se une al mismo. Tras unirse, el verde SYBR experimenta un cambio de conformación y emite fluorescencia, que se mide directamente. Las dos desventajas principales de la utilización de esta técnica son la naturaleza no específica de la reacción, y que cualquier producto, sea el producto correcto o no, producirá una señal. Por lo tanto, resulta imperativo confirmar que la PCR produce el amplicón que se requiere medir. Taqman no adolece de esta desventaja, debido a que la sonda interacciona únicamente con la secuencia del amplicón correctamente generado. En segundo lugar, la utilización de verde SYBR es conocido que resulta difícil de optimizar, debido a que el verde SYBR mismo puede interaccionar con el procedimiento de la PCR, dificultando la optimización de la reacción.

Los sistemas homogéneos de ensayo PCR Amplifluor y Scorpion también adolecen de desventajas similares. Ambos sistemas utilizan un cebador de PCR con cola para interaccionar con un cebador fluorescente desactivado con una horquilla. En otras palabras, la reacción de PCR se inicia con cebadores oligonucleótidos convencionales de entre los que uno (o dos en el caso del genotipado SNP basado en una PCR específica de alelo) contiene una secuencia que es idéntica al extremo 3' de los cebadores fluorescentes Amplifluor o Scorpion. A continuación, se sintetiza el complemento inverso de dicha secuencia, durante los primeros pocos ciclos de la reacción de PCR. Esto permite que seguidamente los cebadores fluorescentes inicien la reacción de PCR. Al producirse lo anterior, la estructura de horquilla de los cebadores Amplifluor o Scorpion se copia y se "desenrolla". Estas estructuras de horquilla contienen parejas de desactivador fluorescente que se encuentran totalmente desactivadas en el caso de que resulte posible la formación de la estructura de horquilla, sin embargo, al copiarse ya no puede formarse la estructura y, por lo tanto, la pareja de desactivador y fluoróforo se encuentra separada y se genera una señal fluorescente. Existen varios modos de funcionamiento para las tecnologías tanto de Amplifluor como de Scorpion, sin embargo adolecen de una o más de las desventajas siguientes. Nuevamente, cada cebador basado en una horquilla resulta difícil y caro de sintetizar, debido a la naturaleza compleja de la horquilla y de las parejas de desactivador-fluoróforo de marcaje doble. Este coste y naturaleza técnicamente exigente de la síntesis es una desventaja importante. Además, la reacción también es susceptible a que artefactos no específicos de la PCR generen una señal, por ejemplo dímeros de cebadores, así como a la generación de amplicones incorrectos.

Se dan a conocer ensayos alternativos adicionales en las solicitudes de patente siguientes: PCR nº WO 00/41549, EP nº 0.909.823, PCT nº WO 02/30946, PCT nº WO 99/49293 y DE nº 10230948.

Se da a conocer un ensayo alternativo adicional en Solinas et al., Nucleic Acids Research 29(20):E96, 2001. Este documento da a conocer cebadores dúplex Scorpion en el análisis SNP. Koo et al., Letters in Applied Microbiology 35:513, 2002, dan a conocer sondas fluorogénicas para PCR que son cortadas por la actividad 5' nucleasa de la polimerasa Taq. La solicitud de patente WO nº 2005/061734 describe sondas de PCR para el análisis de curvas de disociación.

La necesidad de un sistema de detección específica fácil de sintetizar, de bajo coste y relativamente fiable para los ensayos homogéneos de PCR resulta evidente. Es un objetivo general de la presente invención superar una o más de las desventajas anteriormente mencionadas de los sistemas existentes de detección basados en FRET para PCR. La invención siguiente supera dichas desventajas en varios formatos diferentes, proporcionando un método de detección adecuado para la detección directa o indirecta de productos de PCR y que puede utilizarse de un modo cuantitativo, en tiempo real y/o de punto final.

Descripción resumida de la invención

Según un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método de ensayo de detección para un procedimiento de PCR que utiliza FRET, comprendiendo el método las etapas de proporcionar una primera secuencia oligonucleótida de marcaje único y por lo menos una segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera y segunda secuencias oligonucleótidas de Tm diferente, en donde la primera y segunda secuencias oligonucleótidas se hibridan entre sí en solución libre, formando una pareja fluorescente desactivada, proporcionando por lo menos un cebador y cebando la PCR, generando de esta manera una secuencia complementaria a una o a ambas secuencias, presentando, una de entre la primera y segunda secuencias oligonucleótidas, una Tm inferior a la Ta del procedimiento de PCR, caracterizado porque la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único consiste de una secuencia oligonucleótida que presenta un único marcaje en un extremo, comprendiendo el cebador o cebadores por lo menos un cebador con cola no marcado, presentando el cebador con cola no marcado una región de cola, comprendiendo la región de cola una secuencia oligonucleótida idéntica a la secuencia oligonucleótida de la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único un cebador a partir del cual se inicia la síntesis de ADN tras generarse una secuencia complementaria a la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único durante el procedimiento de PCR, de manera que la segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único ya no puede hibridarse a la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, de manera que se genera una señal medible.

Un problema importante de las técnicas de la técnica anterior se refiere a la síntesis de oligos fluorescentes de marcaje doble. La presente invención aprovecha el rendimiento elevado a coste reducido y la facilidad de síntesis de los oligos de marcaje fluorescente único. Estos oligos son muy significativamente más fáciles de sintetizar en sintetizadores automáticos. El coste asociado es típicamente un orden de magnitud menor que el de una sonda de doble marcaje fluorescente. Además, mediante la utilización de parejas de secuencias oligo de entre las que una secuencia, convenientemente la secuencia desactivadora, presenta una Tm (temperatura de disociación) inferior a la Ta (temperatura de hibridación) del procedimiento de PCR, se mejora drásticamente la eficacia de la técnica.

Una fórmula utilizada comúnmente para determinar la Tm de una secuencia es Tm=4(G+C)+2(A+T), y de esta manera puede conseguirse, en principio, la Tm baja de una secuencia mediante una longitud más corta y/o una proporción (G+C)/(A+T) más baja que la de la otra secuencia de la pareja informadora. Resulta preferente que una de las secuencias presente una longitud superior en 10 bases a la otra, preferentemente superior en 15 bases.

La invención resulta aplicable en varios formatos, descritos por separado posteriormente. La invención comprende un método para llevar a cabo un ensayo FRET, así como un kit para tal fin. Asimismo, la invención proporciona de manera general un método de detección que utiliza FRET, que proporciona por lo menos dos secuencias oligonucleótidas de marcaje único que se hibridan entre sí en solución libre formando una pareja fluorescente desactivada, que tras la introducción de una secuencia complementaria a una o a ambas secuencias genera una señal medible.

Breve descripción de los dibujos

A continuación se describen particularmente realizaciones preferentes de la presente invención a título de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

la figura 1 es un esquema simple de reacción para la detección indirecta de una secuencia de ADN, a modo de realización de la presente invención.

La figura 2 es un esquema simple de reacción para la detección indirecta de una secuencia de ADN en el genotipado SNP, a modo de realización del método de la presente invención.

La figura 3 es un esquema simple de reacción para la detección directa de productos de PCR.

La figura 4 es un esquema simple de reacción para la detección semidirecta de una secuencia de ADN.

La figura 5 es un gráfico que representa en el eje X la señal de Fam dividido por la señal de Rox, y en el eje Y la señal de Joe dividida por la señal de Rox, para el Ejemplo experimental 1, que se proporciona a título de ejemplo de cebador de baja Tm en la pareja de sondas, y

la figura 6 es un gráfico que representa en el eje X la señal de Fam dividida por la señal de Rox, y en el eje Y la señal de Joe dividida por la señal de Rox, para el Ejemplo experimental 2, que muestra la ineficacia relativa de no utilizar cebador de baja Tm en la pareja de sondas.

Descripción de las realizaciones preferentes

Realización 1

Utilización en la detección indirecta de productos de PCR

La presente realización, ilustrada en la figura 1 posteriormente en la presente memoria, utiliza un oligo (cebador) convencional para iniciar el procedimiento de PCR. Este cebador convencional presenta una cola de ADN que no se dirige a la región amplicón de interés, de manera que esta cola es esencialmente inerte. Esta secuencia de cola se posiciona en la parte 5' del cebador. La parte 3' del cebador se dirige a la región amplicón de interés y por lo tanto controla la especificidad de la reacción. También se incluye en la reacción un oligo de marcaje fluorescente único que presenta una secuencia idéntica a la de la región de cola del cebador convencional. Existen varios fluoróforos adecuados, siendo una elección popular, Fam (un derivado de la fluoresceína). Finalmente, se incluye en la reacción un oligo 3' marcado con desactivador en orientación antisentido respecto al oligo marcado con Fam. Existen varios marcajes adecuados, de entre los que la serie de desactivadores Black Hole es una elección popular.

Debido a la complementariedad de los dos oligos marcados, se hibridan entre sí. Esta hibridación provoca que el marcaje desactivador se encuentre muy próximo al fluoróforo, desactivando de esta manera toda la señal fluorescente de la molécula Fam al excitarse a 488 nm (la longitud de onda de excitación óptima de Fam). A continuación se inicia el procedimiento de PCR y se inicia la generación del producto de PCR. Tras los primeros pocos ciclos de PCR, se genera la secuencia antisentido respecto al cebador fluorescente. A partir de entonces el cebador fluorescente de PCR puede iniciar la síntesis durante la PCR, y efectivamente lo hace. Ello produce amplicón con una molécula de Fam en el extremo 5'. Tras lo anterior, el oligo desactivador ya no puede hibridarse con el oligo marcado con Fam a medida que el procedimiento de PCR produce amplicón de ADN de doble cadena. Debido a que el oligo-desactivador ya no puede hibridarse con el oligo-Fam, se genera una señal que es directamente proporcional a la cantidad de producto de PCR
generado. Tal como se ha indicado anteriormente, las cinco etapas de este esquema de reacción se ilustran en la fig. 1.

Realización 2

Análisis de punto final del genotipado SNP específico de alelo

La presente realización, ilustrada en la figura 2, utiliza la misma pareja de oligos fluoróforo/desactivador que en la primera realización. El esquema de reacción es idéntico excepto por algunas modificaciones.

Para realizar el genotipado SNP se requiere la utilización de dos cebadores marcados fluorescentemente y los oligos desactivadores correspondientes. Nuevamente se añade a cada cebador una cola con una secuencia única, a la que se añade en la reacción un cebador 5' marcado fluorescentemente. Dos pigmentos adecuados son Fam y Joe, ambos derivados de la fluoresceína, aunque espectralmente resolubles uno de otro. Los dos cebadores (parte sin cola) reconocen (generalmente denominados "directos") el ADN de interés. En esta parte del cebador típicamente difieren únicamente por un único nucleótido en la base 3' terminal. Cada cebador reconoce la base polimórfica en el ADN de interés. Se lleva a cabo la PCR y los dos cebadores únicamente inician la síntesis en el caso de que la base 3' se haya hibridado perfectamente. En el caso de que se produzca un desapareamiento, no se produce la síntesis.

Durante la reacción, la cola específica puede, dependiendo del genotipo, iniciar la síntesis (o pueden ambas, en el caso de un heterocigoto). Nuevamente, lo anterior provoca la incorporación de la parte de cola fluorescente en el cebador y en el producto de PCR, dificultando de esta manera la hibridación del oligo-desactivador. Por lo tanto, se genera una señal según qué oligo ha iniciado la síntesis. A continuación, se lee la reacción en un lector de placas fluorescentes para ambos fluoróforos. Seguidamente los datos resultantes se proporcionan en un gráfico de conglomerados comparando un fluoróforo con el otro. Los genotipos resultantes pueden generarse seguidamente basándose en los gráficos de conglomerados.

Realización 3

Detección directa de los productos de PCR (no parte de la invención)

La detección específica de los productos de PCR es el método más robusto para garantizar el seguimiento exacto de la presencia de una región de ADN de interés. El ensayo Taqman es uno de los métodos más ampliamente utilizados. Sin embargo, resulta de realización cara debido al requisito de utilización de sondas de doble marcaje.

Resulta posible, utilizando la presente invención, separar la sonda en dos oligos de marcaje único para llevar a cabo los ensayos Taqman, superando de esta manera dicha limitación del coste. El ensayo TAqman es un nombre comercial para el ensayo de 5' nucleasa. El ensayo de 5' nucleasas utiliza la actividad 5' a 3' exonucleasa de las ADN polimerasas, y más específicamente de la polimerasa Taq. Durante la PCR, al encontrarse el enzima con una secuencia de sonda hibridada al amplicón que debe copiarse, desplaza la sonda y la degrada. Se realiza un seguimiento de esta degradación mediante la utilización de FRET, tal como se ha indicado anteriormente. Un esquema simple para esta realización se ilustra en la figura 3.

La realización de un ensayo de 5' nucleasa con la presente invención resulta sencilla. Se crea una sonda fluorescente marcada con un solo fluoróforo y también se crea la pareja antisentido marcada con desactivador de dicha sonda utilizando técnicas tradicionales de síntesis de ADN. Se modifican las sondas en su extremo 3' con, respectivamente, el grupo fluoróforo o el grupo desactivador. Aparte de lo anterior, la secuencia marcada con desactivador difiere de la sonda fluorescente marcada con fluoróforo sustancialmente sólo en que es más corto, en por lo menos diez nucleótidos, y preferentemente 15 ó más nucleótidos, de manera que, en comparación con la sonda fluorescente marcada con fluoróforo, presenta una Tm relativamente baja y que es inferior a la temperatura de hibridación para la PCR.

En la mezcla de reacción previa al ciclado térmico, las dos sondas se hibridan entre sí, formando de esta manera una sonda totalmente desactivada. Durante la PCR, la sonda más larga se encontrará sometida a la actividad de 5' nucleasa de la ADN polimerasa. Esto resulta en la degradación de la sonda más larga, retirando de esta manera la desactivación de la señal del fluoróforo y conduciendo a un incremento medible y cuantitativo de fluorescencia al reducir la Tm hasta un punto en el que la secuencia más corta puede hibridarse.

Una utilización adicional del sistema oligo de pareja fluoróforo-desactivador descrito es en la detección homogénea de productos de PCR sin utilización de actividad 5' nucleasa. Se desarrolla la misma reacción, con la excepción de que cualquiera de entre oligo-fluoróforo y oligo-desactivador, o ambos, resulta modificado con un grupo químico (tal como un grupo fosfato) que inhibe la degradación por parte de la actividad 5' nucleasa de la Taq. En este caso, la señal fluorescente es generada por el hecho de que, a medida que se acumula producto de la PCR, cualquiera de las sondas, o ambas, pueden hibridarse entre sí o con el producto de PCR generado al caer la temperatura de reacción por debajo de la Tm de la secuencia marcada más corta. Al unirse cualquiera de las dos, o ambas, al producto de PCR generado, el oligo marcado con fluoróforo ya no se encuentra desactivado, produciendo de esta manera una señal medible.

A continuación se proporciona un ejemplo de reducción a la práctica del genotipado basado en PCR específica de alelo utilizando la invención.

Ejemplo 1

Notación: Fam=6-carboxifluoresceína, Joe=6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína, BHQ1a=desacti-
vador Black Hole 1a (grupo desactivador no fluorescente).

Se diseñaron siete oligonucleótidos cebadores y se proporcionan sus secuencias a continuación:

1.

Cebador marcado con Fam: 5'Fam-gtgtgctagcgtcctgaaggtgaccaagttcatgct

2.

Cebador marcado con Joe: 5'Joe-atcggtagcatcgctgaaggtcggagtcaacggatt

3.

Cebador 1 específico de alelo: 5'-gaaggtgaccaagttcatgctgcaggaggccgcactctcta

4.

Cebador 2 específico de alelo: 5'-gaaggtcggagtcaacggattcaggaggccgcactctctg

5.

Cebador inverso: 5'-atagcactaacagaagacagatcgctaa

6.

Cebador desactivador de Fam marcado con BHQ1a: 5'-aggacgctagcacac-BHQ1a

7.

Cebador desactivador de Joe marcado con BHQ1a: 5'-agcgatgctaccgat-BHQ1a

Se indica que el cebador desactivador marcado con Fam presenta una secuencia oligonucleótida 15mera y presenta una longitud 10 nucleótidos inferior a la de la sonda cebadora marcada con Fam/informadora y, de manera similar, el cebador desactivador marcado con Joe presenta una secuencia oligonucleótida 15mera y presenta una longitud 10 nucleótidos inferior a la de la sonda cebadora marcada con Joe/informador. De acuerdo con lo anterior, las sondas cebadores/informadoras marcadas con Fam o con Joe presentan una Tm igual o superior a la Ta de 57ºC de la etapa de hibridación del procedimiento de PCR y se hibridarán con el amplicón en el procedimiento, mientras que los cebadores desactivadores más cortos presentan una Tm de aproximadamente 50ºC, es decir, varios grados centígrados inferiores a la Ta de 57ºC de la etapa de hibridación y no se hibridarán con el amplicón. Se sintetizaron los siete mediante la reacción estándar de fosforamidita de Qiagen-Operon (Alemania). Se diluyó la totalidad de los oligos hasta una concentración inicial de 200 \muM en Tris/HCl 10 mM, pH 8,0. Todas las diluciones posteriores se llevaron a cabo en este diluyente. Se creó una mezcla de ensayo que contenía los componentes siguientes:

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1

A los pocillos A1-B24 de una placa de microtitulación de 384 pocillos se añadieron 10 ng de ADN genómico procedente de 44 individuos caucásicos. Los 4 pocillos restantes se dejaron vacíos a modo de pocillos de control negativo. A continuación, se secó dicha placa a 50ºC durante 1 hora.

A los pocillos A1-B24 de la placa seca se añadieron 5 \mul de mezcla de ensayo y se selló la placa utilizando un sellador de placas ALPS 300 utilizando sellante transparente fuerte Clear Seal Strong (Abgene, Epsom, Reino Unido). A continuación, se termocicló la placa bajo las condiciones siguientes en un minitermociclador Duncan (KBiosystems, Basildon, Essex, Reino Unido):

94ºC durante 4 minutos, seguido de 20 ciclos de la temperatura de desnaturalización (94ºC) durante 5 segundos, temperatura de hibridación (Ta), de 57ºC, durante 10 segundos, temperatura de elongación, de 72ºC, durante 20 segundos, seguido de 20 ciclos adicionales de 94ºC durante 5 segundos, 57ºC durante 20 segundos y 72ºC durante 40 segundos.

Tras el ciclado térmico, se determinó la fluorescencia asociada a cada pocillo utilizando un lector de placas Envision, de Perkin Elmer (Turku, Finlandia). Se leyó cada pocillo tres veces a las combinaciones de longitudes de onda siguientes:

Excitación de Fam: 485 nm

Emisión de Fam: 520 nm

Excitación de Joe: 520 nm

Emisión de Joe: 560 nm

Excitación de Rox: 590 nm

Emisión de Rox: 620 nm

A continuación, se proporcionan en gráficos los datos resultantes, que muestran, en el eje X, la señal de Fam dividida por la señal de Rox, y en el eje Y, la señal de Joe dividido por la señal de Rox,. Se presentan estos datos en la figura 5. Tal como puede observarse en el gráfico de conglomerados de la figura 5, posteriormente, se observan tres conglomerados claramente discernibles, asociados a los genotipos respectivos, demostrando claramente la eficacia de la tecnología de detección.

En la figura 6 se proporciona un ejemplo de genotipado basado en PCR específica de alelo, utilizando dos oligos desactivadores (uno por cada alelo) en un experimento idéntico al presentado en la figura 5. La única modificación es que los dos oligos desactivadores han sido sustituidos por las secuencias más largas de bases, 18meras, proporcionadas a continuación:

cebador desactivador-Fam 18mero marcado con BHQ1a: 5'-ttcaggacgctagcacac-BHQ1a

cebador desactivador-Joe 18mero marcado con BHQ1a: 5'-ttcagcgatgctaccgat-BHQ1a

Los datos en la figura 6 muestran una clara inhibición del procedimiento de la PCR por los oligos desactivadores 18meros. La Tm de dichos oligos desactivadores 18meros no es inferior a la Ta, de 57ºC, de la reacción de PCR. El contraste entre estos pobres resultados y los muy buenos resultados obtenidos con el método según la aplicación en la figura 5 demuestra claramente el gran beneficio obtenido al utilizar una forma de baja Tm (sub-Ta) del segundo cebador (desactivador) de la pareja de cebadores/sondas informadores.

El segundo oligonucleótido (desactivador) es efectivamente inerte en el procedimiento de la PCR y de esta manera no se observan efectos perjudiciales ni de inhibición. El incremento de la fluorescencia se determina convenientemente mediante la lectura de la reacción a una temperatura inferior a la Tm del segundo oligonucleótido, revelando de esta manera la señal.

Claims (17)

1. \global\parskip0.900000\baselineskip

   1. Método de ensayo de detección para un procedimiento de PCR que utiliza FRET, comprendiendo el método las etapas de proporcionar una primera secuencia oligonucleótida de marcaje único y por lo menos una segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera y segunda secuencias oligonucleótidas de diferente Tm, en donde la primera y segunda secuencias oligonucleótidas se hibridan entre sí en solución libre, formando una pareja fluorescente desactivada, proporcionado por lo menos un cebador e iniciando la PCR, generando de esta manera una secuencia complementaria a una o a ambas secuencias, presentando una de entre la primera y segunda secuencias oligonucleótidas una Tm inferior a la Ta del procedimiento de PCR, caracterizado porque la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único consiste de una secuencia oligonucleótida que presenta un único marcaje en un extremo, comprendiendo el cebador o cebadores por lo menos un cebador con cola no marcado, presentando el cebador con cola no marcado una región de cola, comprendiendo la región de cola una secuencia oligonucleótida idéntica a una secuencia oligonucleótida de la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, siendo la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único un cebador a partir del que se inicia la síntesis de ADN tras generarse una secuencia complementaria a la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único durante el procedimiento de PCR, de manera que la segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único ya no puede hibridarse con la primera secuencia oligonucleótida de marcaje único, generando una señal medible.
2. 2. Método de detección según la reivindicación 1, en el que la primera y segunda secuencias oligonucleótidas de marcaje único consisten de una secuencia oligonucleótida marcada fluorescentemente y la otra secuencia oligonucleótida de marcaje único consiste de una secuencia oligonucleótida marcada con un desactivador.
3. 3. Método de detección según la reivindicación 1, incorporado en un sistema de PCR para detectar una secuencia específica, en el que dichas primera secuencia oligonucleótida de marcaje único y segunda secuencia oligonucleótida de marcaje único presentan longitudes que difieren en más de 10 bases.
4. 4. Método de detección según la reivindicación 1, en el que el procedimiento de PCR se monitoriza en tiempo real en cada ciclo o tras un número de ciclos con los que la reacción no ha generado todavía suficiente producto para crear una señal medible mediante la reducción de la temperatura de reacción para permitir que se produzca la hibridación.
5. 5. Método de detección según la reivindicación 1, en el que dicha primera secuencia presenta una Tm que es superior a la Ta del procedimiento de PCR.
6. 6. Método de detección según la reivindicación 1, en el que dicha segunda secuencia presenta el marcaje desactivador de la pareja fluorescente desactivada.
7. 7. Método de detección según la reivindicación 1, en el que el procedimiento de PCR es el genotipado SNP basado en la PCR específica de alelo.
8. 8. Método de detección según la reivindicación 1, en el que el procedimiento de PCR se monitoriza mediante la utilización de únicamente hibridación.
9. 9. Método de detección según la reivindicación 8, en el que el procedimiento de PCR se monitoriza mediante la utilización posteriormente a la PCR de únicamente hibridación.
10. 10. Método de detección según la reivindicación 1, en el que las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia presentan una longitud comprendida entre 6 pb y 100 pb.
11. 11. Método de detección según la reivindicación 10, en el que las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia presentan una longitud comprendida entre 6 pb y 100 pb pero no presentan la misma longitud.
12. 12. Método de detección según la reivindicación 1, en el que ambos elementos de las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia se marcan con fluoróforos.
13. 13. Método de detección según la reivindicación 1, en el que en las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia, un elemento de la pareja se marca con un fluoróforo y el otro elemento, con una molécula desactivadora no fluorescente.
14. 14. Método de detección según la reivindicación 1, en el que las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia se modifican para que sean resistentes a la degradación por nucleasas.
15. 15. Método de detección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia se marcan con moléculas que son sensibles a la distancia.
16. 16. Método de detección según la reivindicación 15, en el que el procedimiento de PCR se monitoriza mediante la utilización de únicamente hibridación.
17. 17. Método de detección según la reivindicación 1, en el que las parejas de oligos de desactivación de fluorescencia contienen bases nucleótidas modificadas.