PT1726664E

PT1726664E - Sistema de detecção para ensaio por pcr

Info

Publication number: PT1726664E
Application number: PT06252796T
Authority: PT
Inventors: Philip Steven Robinson
Original assignee: Kbiosciences Ltd
Priority date: 2005-05-28
Filing date: 2006-05-30
Publication date: 2010-04-14
Also published as: US20070117108A1; DK1726664T3; CY1110012T1; GB2426520A; EP1726664A1; ATE456670T1; SI1726664T1; PL1726664T3; GB0610653D0; GB0510979D0; US7615620B2; EP1726664B1; ES2340058T3; DE602006011976D1

Description

ΡΕ1726664 1

DESCRIÇÃO "SISTEMA DE DETECÇAO PARA ENSAIO POR PCR"

Campo da invenção

Esta invenção refere-se a um novo sistema de detecção baseado em transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) adequado para utilização em ensaios de reacção em cadeia da polimerase.

Antecedentes da invenção A descoberta da reacção em cadeia da polimerase (PCR) revolucionou o campo da biologia molecular permitindo a amplificação de qualquer fragmento desejado de ADN de qualquer organismo. A utilização mais especializada da PCR é observada em áreas de quantificação em tempo real e na determinação do ponto final de genotipos em que é empregue a utilização de sistemas de ensaio homogéneos. Um sistema de ensaio homogéneo é um em que para derivar o resultado da reacção não requer a separação fisica dos componentes da reacção uns dos outros. Por outras palavras a reacção é realizada e os resultados são derivados sem intervenção fisica adicional na reacção. 2 ΡΕ1726664

Quando monitorizada em tempo real (por outras palavras, monitorização da produção de produto em cada ciclo durante o processo de PCR) a PCR pode ser utilizada de modo quantitativo. Isto tem ampla aplicação em vários campos desde o diagnóstico de infecções virais até à determinação da abundância de uma espécie de ARN mensageiro em ARN humano. 0 processo fisico de monitorização da PCR em tempo real é complexo, exigindo instrumentação sofisticada concebida especificamente para o processo. Esta instrumentação exige que o processo de PCR para produzir uma quantidade mensurável de luz que aumenta com cada ciclo até que os componentes da reacção estarem esgotados. Para servir esta necessidade têm sido demonstradas e comercialmente exploradas várias abordagens elegantes. Dois exemplos desses são o ensaio de 5' nuclease de Taqman comercializado por Applied Biosystems (EUA) e a detecção química SybRGreen comercializada por Molecular Probes (Holanda). Ambos os sistemas de PCR quantitativa funcionam bem, mas ambos têm desvantagens que beneficiariam em ser superadas. A genotipagem (em particular a genotipagem de polimorfismo nucleotídico pontual (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) , é por outro lado um processo que é menos exigente na instrumentação. 0 processo é essencialmente o mesmo empregando a utilização de um sistema de ensaio homogéneo, mas a necessidade de controlar os produtos da reacção de cada ciclo da PCR é menos crítica. Na verdade, a maioria dos cientistas que efectuam 3 ΡΕ1726664 a genotipagem de SNP utilizando sistemas baseados em fluorescência fazem a PCR e só no final da reacção é que determinam os niveis de produto produzido. Esta é geralmente chamada de análise de ponto final. A genotipagem de SNP tem um maior nivel de complexidade, na medida em que o objectivo da reacção é determinar o genotipo de ADN individual num único locus dentro do seu genoma.

Os SNP são marcadores bialélicos que são ideais para ser determinados por ensaios homogéneos fluorescentes em grande número a baixo custo. Os vários sistemas reaccionais que estão actualmente em utilização são mais uma vez a reacção de TaqMan (Applied Biosystems), o sistema Amplifluor (Serologicals, EUA) e o sistema Scorpions (DxS, UK). Todos são sistemas reaccionais elegantes que produzem dados de boa qualidade, mas cada um deles tem as suas próprias desvantagens. 0 principio de todos os sistemas de ensaio homogéneos é a utilização do processo fisico de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) para detectar a produção de produto no processo de PCR. A FRET é o processo em que, quando dois fluoróforos estão em suficiente proximidade um do outro, vão sofrer uma permuta de transferência de energia quando excitados por radiação a comprimentos de onda correspondentes ao seu comprimento de onda de excitação especifico. A FRET é ideal para a quantificação da PCR pois permite que a reacção seja ser monitorizada sem ser separada, um processo que seria 4 ΡΕ1726664 impossível tendo em mente que em geral são realizados 40 ciclos de PCR e a quantidade de produto precisa de ser determinada após cada ciclo.

As principais técnicas actualmente em utilização funcionam bem mas sofrem de uma série de desvantagens que dificultam a sua utilização no mundo científico. O ensaio de Taqman da Applied Biosystems tal como discutido, por exemplo, na patente U.S. 5538848 (ou, mais genericamente, um ensaio FRET baseado em 5' nuclease), requer a produção de uma sonda de oligonucleótido duplamente marcada para cada sequência de ADN a ser medida. Esta sonda no seu estado de pré-reacção é designada 'desactivada'. Por outras palavras, dois fluoróforos (ou um desactivador não fluorescente e um fluoróforo) estão ligados a um oligonucleótido curto dentro de aproxima-damente 30 nucleótidos um do outro. Esta distância é suficientemente pequena para que quando um dos fluoróforos está excitado ao seu comprimento de onda óptimo o outro fluoróforo absorve a energia absorvida e emite radiação a um comprimento de onda diferente, ou no caso de um desactivador não fluorescente a energia absorvida é transmitida por FRET para o desactivador não fluorescente e não é emitida radiação. Quando esta molécula está incluída na reacção o processo de PCR ADN complementar a ela. Isto permite que a sonda se ligue ao ADN onde é posteriormente destruída pela actividade de 5' nuclease da polimerase Taq utilizada no processo de PCR. Agora que a sonda é degradada 5 ΡΕ1726664 os pares de dois fluoróforos já não estão em proximidade suficiente para sofrer FRET e é criada uma diferença de radiação mensurável. A principal desvantagem com o ensaio Taqman é o requisito para a produção das sondas de oligonucleótidos duplamente marcados. É necessária uma única sonda para as determinações quantitativas da massa de ADN, enquanto que são necessárias duas para a genotipagem de SNP (uma para cada alelo) . A produção da sonda propriamente dita é um processo caro e demorado. No momento em que se escreve, cada sonda pode custar tanto como 250 libras, dando reagente suficiente para apenas alguns milhares de reac-ções. Se se considerar que num projecto de genotipagem de SNP podem ser estudados qualquer coisa como mais de 200 SNP, então isto implicaria um investimento inicial de 10000 libras na produção de sondas. Este é um montante proibitivamente elevado para muitas organizações de ciência e, portanto, a principal desvantagem do sistema.

Na área da expressão génica quantitativa a utilização de SYBR Green é frequentemente empregue como uma alternativa de baixo custo à utilização do TaqMan. O SYBR Green é um corante intercalante que só se liga a ADN de cadeia dupla. Como tal pode ser utilizado em ensaios de PCR homogéneos quantitativos. O produto da PCR é gerado à medida que aumenta o número de ciclos da reacção, e à medida que o produto se acumula o SYBR Green liga-se ao produto. Uma vez ligado o SYBR Green sofre uma alteração 6 ΡΕ1726664 conformacional e apresenta fluorescência que é medida directamente. As duas principais desvantagens da utilização desta técnica são a natureza não especifica da reacção, na medida em que qualquer produto, seja o produto correcto ou não, vai produzir um sinal. É portanto imperativo confirmar que a PCR produz o amplicão que é necessário para ser medido. 0 Taqman não sofre desta desvantagem uma vez que a sonda interactua só com a sequência do amplicão gerado correctamente. Em segundo lugar, sabe-se que a utilização do SYBR Green é dificil de optimizar porque o SYBR Green propriamente dito pode interactuar com o processo de PCR tornando a reacção dificil de optimizar.

Os sistemas de ensaio de PCR homogéneos Ampli-fluor e Scorpion também sofrem de desvantagens semelhantes. Ambos os sistemas utilizam um iniciador de PCR com cauda para interactuar com um iniciador fluorescente desactivado com um gancho ("hairpin"). Por outras palavras, a reacção de PCR é iniciada com iniciadores oligonucleótidos convencionais de que um (ou dois, no caso de genotipagem de SNP com base em PCR especifica de alelos) contém uma sequência que é idêntica à extremidade 3' dos iniciadores fluorescentes Amplifluor ou Scorpion. 0 complemento inverso desta sequência é então produzido durante os primeiros poucos ciclos da reacção de PCR. Isto permite que os iniciadores fluorescentes iniciem então a reacção de PCR. Ao fazer isto a estrutura em gancho dos iniciadores do Amplifluor ou do Scorpion é copiada e "desvendada". Estas estruturas em gancho contêm pares desactivadores 7 ΡΕ1726664 fluorescentes, que estão totalmente desactivados quando a estrutura em qancho se pode formar, no entanto quando esta é copiada a estrutura já não se pode formar e assim o par desactivador fluoróforo é separado e é gerado um sinal fluorescente. Existem vários modos de operação para ambas as tecnologias Amplifluor e Scorpion, porém sofrem de pelo menos uma ou mais das seguintes desvantagens. Cada iniciador baseado em gancho é novamente difícil e dispendioso de sintetizar, devido à natureza complexa do gancho e pares desactivadores fluoróforos duplamente marcados. Este custo e natureza tecnicamente exigente da síntese é uma grande desvantagem. Além disso esta reacção também é susceptível à geração de sinal de artefactos de PCR inespecíficos como dímeros de iniciadores e geração de amplicão incorrecta.

Outros ensaios alternativos estão descritos nos seguintes pedidos de patente: PCT WOOO/41549; EP 0909823; PCT WO02/30946; PCT W099/49293 e DE 10230948.

Um outro ensaio alternativo está descrito em Solinas et al., Nuclei Acids Research, 2001, volume 29, N° 20, página E96. Este documento descreve iniciadores Scorpion duplex em análise de SNP. Koo et al., Letters in Applied Microbiology, 2002, 35, página 513, descreve sondas fluorogénicas para PCR que são clivadas pela actividade de 5' nuclease de polimerase de Taq. O pedido de patente WO 2005/061734 descreve sondas de PCR para análise da curva de fusão. ΡΕ1726664 A necessidade de um sistema de detecção especifico fácil de sintetizar, de baixo custo e relativamente fiável específicos para ensaios por PCR homogéneos é evidente. É um objectivo geral da presente invenção tratar de uma ou mais destas insuficiências acima referidas dos sistemas de detecção à base de FRET existentes para PCR. A invenção seguinte trata destas questões em vários formatos diferentes, proporcionando um sistema de detecção adequado para a detecção de produtos de PCR, directa ou indirec-tamente, e que pode ser utilizado de modo quantitativo, em tempo real e/ou em modo de ponto final.

Sumário da invenção

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção é proporcionado um método de ensaio de detecção para um processo por PCR que utiliza FRET, compreendendo o método os passos de proporcionar uma primeira sequência oligonucleotídica marcada uma só vez e pelo menos uma segunda sequência oligonucleotídica marcada uma só vez, tendo a primeira e segunda sequências oligonucleotídicas diferentes Tm, em que a primeira e segunda sequências oligonucleotídicas hibridam uma com a outra em solução livre para formar um par desactivado fluorescente, proporcionar pelo menos um iniciador e iniciar a PCR gerando assim uma sequência complementar de uma ou de ambas as sequências, tendo uma das primeira e segunda sequências oligonucleotídicas uma Tm que é inferior à Ta do processo de PCR, caracterizado por a primeira sequência oligonu- 9 ΡΕ1726664 cleotídica marcada uma só vez consistir numa sequência oligonucleotidica que tem um só marcador numa extremidade, o pelo menos um iniciador compreender pelo menos um iniciador de cauda não marcado, tendo o iniciador de cauda não marcado uma região de cauda, compreendendo a região de cauda uma sequência oligonucleotidica idêntica à sequência oligonucleotidica da primeira sequência oligonucleotidica com um só marcador, sendo a primeira sequência oligonucleotidica com um só marcador um iniciador a partir do qual é iniciada a síntese de ADN uma vez gerada uma sequência complementar da primeira sequência oligonucleotidica marcada uma só vez durante o processo de PCR, de tal modo que a segunda sequência oligonucleotidica marcada uma só vez já não é capaz de hibridar com a primeira sequência oligonu-cleotídica marcada uma só vez, sendo assim gerado um sinal mensurável.

Um problema principal com as técnicas do estado da técnica discutidas acima está ligado à síntese de oligonucleótidos fluorescentes duplamente marcados. A presente invenção tira partido do baixo custo, elevada produtividade e facilidade de síntese de oligonucleótidos marcados com marcadores fluorescentes uma só vez. Estes oligonucleótidos são muito significativamente mais fáceis de sintetizar em sintetizadores automáticos. 0 custo associado é tipicamente uma ordem de grandeza mais barato do que uma sonda fluorescente duplamente marcada. Além disso, por utilização de pares de sequências oligonucleo-tídicas de que uma sequência, com vantagem a sequência 10 ΡΕ1726664 desactivadora, tem uma Tm (temperatura de fusão) inferior à Ta (temperatura de recozimento) do processo de PCR, a eficácia da técnica é dramaticamente melhorada.

Uma fórmula vulgarmente utilizada para a determinação da Tm de uma sequência é Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T) e assim a Tm baixa de uma sequência pode, em principio, ser atingido por um comprimento menor e/ou uma razão (G+C)/(A+T) reduzida em relação à outra sequência do par repórter. É preferido que uma das sequências seja mais de 10 bases mais longa do que a outra e de preferência pelo menos 15 bases mais longa. A invenção é aplicável numa série de formatos, que serão abordados separadamente adiante. A invenção abrange um método de realizar um ensaio FRET bem como um kit para o efeito. A invenção também proporciona genericamente um método de detecção utilizando FRET que proporciona pelo menos duas sequências oligonucleotidicas marcadas uma só vez que hibridam um com a outra em solução livre para formar um par desactivado fluorescente, que por introdução de uma sequência complementar de uma ou ambas as sequências gera um sinal mensurável.

Breve descrição dos desenhos

Formas de realização preferidas da presente invenção vão agora ser mais particularmente descritas a titulo de exemplo com referência aos desenhos anexos em que: 11 ΡΕ1726664 A Figura 1 é um esquema reaccional simples para a detecção indirecta de uma sequência de ADN que é uma forma de realização do método da presente invenção. A Figura 2 é um esquema reaccional simples para a detecção indirecta de uma sequência de ADN em genotipagem de SNP que é uma forma de realização do método da presente invenção. A Figura 3 é um esquema reaccional simples para a detecção directa de produtos de PCR. A Figura 4 é um esquema reaccional simples para a detecção semi-directa da sequência de ADN. A Figura 5 é um gráfico do sinal Fam dividido por

Rox no eixo de X, e sinal Joe dividido por Rox no eixo de Y para o Exemplo Experimental 1, que é uma forma de realização da utilização de um iniciador de Tm baixa no par da sonda; e A Figura 6 é um gráfico do sinal Fam dividido por

Rox no eixo de X, e sinal Joe dividido por Rox no eixo de Y para o Exemplo Experimental 2 que mostra a ineficácia relativa da não utilização de um iniciador de Tm baixa no par da sonda. 12 ΡΕ1726664

Descrição das formas de realização preferidas

Forma de realização 1 - Utilização na detecção

indirecta de produtos de PCR

Esta forma de realização, ilustrada na Figura 1 aqui apresentada a seguir, utiliza um oligonucleótido convencional (iniciador) para iniciar o processo de PCR. Este iniciador convencional tem como cauda uma sequência de ADN que não é direccionada para a região de amplicão de interesse, pelo que esta cauda é essencialmente inerte. Esta sequência de cauda é posicionada na parte 5' do iniciador. A porção 3' do iniciador é direccionada para a região de amplicão de interesse e portanto determina a especificidade da reacção. Na reacção também está incluido um único oligonucleótido marcado fluorescente que é idêntico em sequência à região da cauda do iniciador convencional. Existem vários fluoróforos adequados, sendo uma escolha popular o Fam (um derivado da fluoresceina). Finalmente, incluido na reacção está um oligonucleótido marcado 3' desactivador antisense ao oligonucleótido marcado com Fam. Existem vários marcadores adequados de que a série desactivadora Black Hole de marcadores são uma escolha popular.

Devido à complementaridade dos dois oligonucleó-tidos marcados hibridam uns aos outros. Esta hibridação traz o marcador desactivado para muito perto do fluoróforo, apagando assim todos os sinais fluorescentes da molécula de Fam desactivada quando excitada a 488 nm (comprimento de 13 ΡΕ1726664 onda de excitação ideal de Fam). 0 processo de PCR é então iniciado e o produto da PCR começa a ser gerado. Após os primeiros ciclos de PCR é gerada a sequência antisense ao iniciador fluorescente. 0 iniciador de PCR fluorescente é então capaz de iniciar a sintese durante a PCR, e fá-lo. Isto produz amplicão com uma molécula 5' Fam. Quando isto ocorre, o oligonucleótido desactivador já não é capaz de hibridar ao oligonucleótido marcado com Fam dado que o processo de PCR produz ADN de amplicão de cadeia dupla. Como o oligonucleótido desactivador já não pode hibridar ao oligonucleótido Fam, é gerado um sinal que é directamente proporcional à quantidade do produto de PCR gerado. Tal como mencionado acima, as cinco etapas deste esquema reaccional estão ilustradas na Figura 1.

Forma de realização 2 - Análise de ponto final de genotipagem de SNP específica de alelos

Esta forma de realização, ilustrada na Figura 2, utiliza o mesmo par fluoróforo/oligonucleótido desactivador que a primeira forma de realização. 0 esquema reaccional é idêntico excepto quanto a algumas modificações. A obtenção de genotipagem de SNP requer a utilização de dois iniciadores marcados fluorescentes e correspondentes oligonucleótidos desactivadores. A cada iniciador é mais uma vez adicionada uma cauda que coincide com uma sequência única, na qual é incluído na reacção um 5' iniciador fluorescente marcado. Dois corantes apropriados são Fam e Joe, ambos derivados de fluoresceína, mas 14 ΡΕ1726664 espectralmente resolúveis uns dos outros. Os dois iniciadores (porção sem cauda) são (em geral denominados direc-tos) direccionado para o ADN de interesse. Nessa porção do iniciador tipicamente diferem apenas por um único nucleó-tido na sua base do terminal 3' . Cada iniciador é direccionado à base polimórfica no ADN de interesse. A PCR é realizada e os dois iniciadores só iniciar a sintese quando a base 3' está perfeitamente emparelhada. Quando ocorre desemparelhamento a sintese não decorre.

Durante a reacção a cauda especifica, dependendo do genotipo, é capaz de iniciar a sintese (ou ambas são, no caso de um heterozigoto) . Esta incorpora de novo a porção de cauda fluorescente do iniciador no produto da PCR dificultando assim a hibridação do oligonucleótido desacti-vador. É portanto gerado um sinal segundo o qual o oligonucleótido iniciou a sintese. A reacção é então lida num leitor de placas fluorescentes para ambos os fluoróforos. Os seus dados resultantes são então traçados num gráfico e é gerado um gráfico de agrupamento de um fluoróforo em relação ao outro. Os genotipos resultantes podem então ser determinados com base nos gráficos de agrupamento.

Forma de realização 3 - Detecção directa de produtos de PCR (Não é parte da invenção) A detecção especifica de produtos de PCR é o método mais robusto para assegurar a monitorização exacta de uma presença da região do ADN de interesse. 0 ensaio 15 ΡΕ1726664

Taqman é um dos métodos mais utilizados no entanto, é caro de realizar devido à exigência de sondas duplamente marcadas. É possível utilizar a presente invenção de separar a sonda em dois oligonucleótidos marcados uma só vez para realizar ensaios Taqman e assim ultrapassar esta limitação de custos. 0 ensaio Taqman é uma marca comercial do ensaio da 5' nuclease. 0 ensaio da 5' nuclease utiliza a actividade de 5'-3' exonuclease de polimerases de ADN e mais especificamente Taq polimerase. Durante a PCR, se a enzima encontra uma sonda sequenciada emparelhada com o amplicão a ser copiado, desloca a sonda e degrada-a. Esta degradação é monitorizada por utilização de FRET tal como descrito anteriormente. Um esquema simples para esta forma de realização está ilustrado na Figura 3.

Para realizar um ensaio de 5' nuclease com esta invenção é simples. É criada uma sonda fluorescente marcada com um só fluoróforo e é também criado o par marcado desactivador antisense dessa sonda utilizando técnicas de síntese de ADN tradicionais. As sondas são respectivamente modificadas nas suas extremidades 3' com o fluoróforo ou grupo desactivador. À excepção disto a sequência marcada desactivadora difere da sequência da sonda fluorescente marcada com fluoróforo substancialmente só por ser mais curta em pelo menos dez nucleótidos e de preferência 15 ou mais nucleótidos com o que em comparação com a sequência da sonda fluorescente marcada com fluoróforo tem uma Tm 16 ΡΕ1726664 relativamente baixa e que está abaixo da temperatura de emparelhamento para a PCR.

Na mistura reaccional pré-ciclagem térmica as duas sondas estão hibridadas uma à outra, sendo assim uma sonda totalmente desactivada. Durante a PCR a sonda mais longa vai estar submetida à actividade de 5' nuclease da ADN polimerase. Isto resulta na degradação da sonda mais longa, eliminando assim a supressão do sinal do fluoróforo, levando a um aumento mensurável e quantitativo da fluorescência quando a Tm é reduzida a um ponto em que a sequência mais curta é capaz de hibridar.

Outra utilização do sistema oligonucleótido do par fluoróforo supressor descrito é na detecção homogéneo de produtos de PCR sem a utilização da actividade de 5' nuclease. É desenvolvida a mesma reacção com a excepção de que um ou ambos os fluoróforos e oligonucleótidos supressores estão modificados com um grupo químico (tal como um grupo fosfato) que inibe a degradação pela actividade de 5' nuclease de Taq. Neste caso o sinal fluorescente é gerado pelo facto de que como o produto da PCR se acumula uma ou ambos as sondas testes são capazes de hibridar com elas próprias ou com o produto de PCR gerado quando a temperatura da reacção caiu abaixo da Tm da sequência marcada mais curta. Quando uma ou ambas se ligam ao produto de PCR gerado o oligonucleótido marcado com fluoróforo já não é suprimido, produzindo assim um sinal mensurável. 17 ΡΕ1726664

Um exemplo de redução à prática da genotipagem baseada em PCR específica de alelos utilizando a invenção está apresentado adiante.

Exemplo 1

Notação - Fam = 6-Carboxi fluoresceína; Joe = 6-carboxi-4 ' ,5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína; BHQla = Black Hole Quencher la (unidade desactivadora não fluorescente)

Foram concebidos sete iniciadores oligonucleo-tídicos e as suas sequências podem ser encontradas a seguir. 1. Iniciador marcado com Fam - 5' Fam gtgtgctagcgtcctgaaggtgaccaagttcatgct 2. Iniciador marcado com Joe - 5' Joe atcggtagcatcgctgaaggtcggagtcaacggatt 3. Iniciador 1-5' específico de alelo gaaggtgaccaagttcatgctgcaggaggccgcactctcta 4. Iniciador 2-5' específico de alelo gaaggtcggagtcaacggattcaggaggccgcactctctg 5. Iniciador inverso - 5' atagcactaacagaagacagatcgctaa 18 ΡΕ1726664 6. Iniciador de desactivação Fam marcado com BHQla - 5' aggacgctagcacac-BHQla 7. Iniciador de desactivação Joe marcado com BHQla - 5' agcgatgctaccgat-BHQla

Note-se que o iniciador de desactivação marcado com Fam tem uma sequência oligonucleotidica 15mer e é mais do que 10 nucleótidos mais curto do que o iniciador marcado com Fam/sonda repórter e analogamente o iniciador de desactivação marcado com Joe tem uma sequência oligonucleotidica 15mer e é mais do que 10 nucleótidos mais curto do que o iniciador marcado com Joe/sonda repórter. Consequentemente, os iniciadores marcados com Fam ou Joe/sondas repórter mais longos têm uma Tm que é igual ou superior à Ta de 57°C do passo de emparelhamento do processo de PCR e vão emparelhar com o amplicão no processo, enquanto que os iniciadores de desactivação mais curtos têm uma Tm de cerca de 50°C, i.e. vários graus C abaixo da Ta de 57°C do passo de emparelhamento e não vão emparelhar com o amplicão. Todos os sete foram sintetizados por química de fosfora-midite corrente por Qiagen-Operon (Alemanha). Todos os oligonucleótidos foram diluídos para uma concentração inicial de 200 μΜ em Tris HCl 10 mM pH 8,0. Todas as diluições adicionais foram realizadas neste diluente. Foi criada uma mistura de ensaio contendo os seguintes componentes: 19 ΡΕ1726664 0,25 μΜ de iniciador 1 especifico de alelo 0,25 μΜ de iniciador 2 especifico de alelo 1 μΜ de iniciador inverso 0,1 μΜ de iniciador marcado com Fam 0,1 μΜ de iniciador marcado com Joe 0,5 μΜ de iniciador de desactivação Fam marcado com BHQla 0,5 μΜ de iniciador de desactivação Joe marcado com BHQla 0,2 unidades de Titanium Taq (Becton Dickinson, UK) 10 mM de Tris/HCl pH 8,3 50 mM de KC1 0,05% v/v de IPEGAL-CA630 (Sigma Aldrich, Dorset, UK) 0,05% v/v de Triton X-100 (Sigma Aldrich, Dorset, UK) 2,2 mM de cloreto de magnésio 200 μΜ de dNTP (Sigma Aldrich, Dorset, UK) 5 μΜ de Rodamina-X (Molecular Probes, Holanda)

Aos poços A1-B24 de uma placa de microtitulação com 384 poços adicionou-se 10 ng de ADN genómico de 44 indivíduos caucasianos. Os restantes 4 poços foram deixados vazios, servindo como poços de controlo negativo. Esta placa foi então seca a 50°C durante um periodo de 1 hora.

Aos poços A1-B24 da placa seca adicionou-se 5 pL de mistura de ensaio e a placa foi selada utilizando um selante de placas ALPS 300 utilizando cola transparente forte (Abgene, Epsom UK) . A placa foi então colocada no termociclador nas seguintes condições num mini-termocicla-dor Duncan (Kbiosystems, Basildon, Essex, UK). 20 ΡΕ1726664 94°C durante 4 min seguidos por 20 ciclos de temperatura de desnaturação de 94°C durante 5 segundos, 57°C de temperatura de emparelhamento (Ta) durante 10 segundos, 72 °C de temperatura de alongamento durante 20 segundos, seguidos por mais 20 ciclos de 94°C durante 5 segundos, 57°C durante 20 segundos, 72°C durante 40 segundos

Após a aplicação dos ciclos térmicos a fluorescência associada a cada poço foi determinada utilizando um leitor de placas Envision da Perkin Elmer, (Turku, Finlândia) . Cada poço foi lido três vezes nas seguintes combinações de comprimentos de onda. excitação de Fam: 485 nm emissão de Fam: 520 nm excitação de Joe: 520 nm emissão de Joe: 560 nm excitação de Rox: 590 nm emissão de Rox: 620 nm

Os dados resultantes foram então traçados num gráfico como sinal de Fam dividido por Rox no eixo de X, e sinal de Joe dividido por Rox no eixo de Y. Estes dados estão apresentados na Figura 5. Como se pode ver do gráfico de dispersão da Figura 5 adiante, são visíveis três grupos claramente discerníveis associados aos respectivos genotipos, demonstrando claramente a eficácia da tecnologia de detecção.

Passando para a Figura 6, está apresentado um exemplo de genotipagem baseada em PCR específica de alelos utilizando dois oligonucleótidos de desactivação (um para cada alelo) numa experiência idêntica á apresentada na 21 ΡΕ1726664

Figura 5. Aqui a única modificação é que os dois oligonucleótidos de desactivação foram substituídos pelas sequências de bases 18 mer mais longas a seguir:

Iniciador de desactivação Fam marcado com BHQla 18mer - 5' ttcaggacgctagcacac-BHQla

Iniciador de desactivação Joe marcado com BHQla 18mer - 5' ttcagcgatgctaccgat-BHQla

Os dados da Figura 6 mostram uma clara inibição do processo de PCR pelos oligonucleótidos de desactivação 18mer. As Tm desses oligonucleótidos de desactivação 18mer não são inferiores à Ta de 57°C da reacção de PCR. 0 contraste entre estes maus resultados e os resultados muito bons do método tal como aplicado na Figura 5 demonstra claramente a vantagem dramática da utilização de uma forma de Tm baixa (sub Ta) do segundo iniciador (e.g. de desactivação) do par de iniciadores repórter/sondas. 0 segundo oligonucleótido (e.g. de desactivação) é efectivamente inerte no processo de PCR e assim não são observados efeitos nocivos ou inibidores. 0 aumento da fluorescência é com vantagem determinado por leitura da reacção a uma temperatura inferior à Tm do segundo oligonucleótido revelando assim o sinal.

Lisboa, 7 de Abril de 2010

Claims

ΡΕ1726664 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de ensaio de detecção para um processo por PCR que utiliza FRET, compreendendo o método os passos de proporcionar uma primeira sequência oligonucleo-tidica marcada uma só vez e pelo menos uma segunda sequência oligonucleotidica marcada uma só vez, tendo a primeira e segunda sequências oligonucleotidicas diferentes Tm, em que a primeira e segunda sequências oligonucleotidicas hibridam uma com a outra em solução livre para formar um par desactivado fluorescente, proporcionar pelo menos um iniciador e iniciar a PCR gerando assim uma sequência complementar de uma ou de ambas as sequências, tendo uma das primeira e segunda sequências oligonucleotidicas uma Tm que é inferior à Ta do processo de PCR, caracterizado por a primeira sequência oligonucleotidica marcada uma só vez consistir numa sequência oligonucleotidica que tem um só marcador numa extremidade, o pelo menos um iniciador compreender pelo menos um iniciador de cauda não marcado, tendo o iniciador de cauda não marcado uma região de cauda, compreendendo a região de cauda uma sequência oligonucleotidica idêntica à sequência oligonucleotidica da primeira sequência oligonucleotidica com um só marcador, sendo a primeira sequência oligonucleotidica com um só marcador um iniciador a partir do qual é iniciada a sintese de ADN uma vez gerada uma sequência complementar da primeira sequência oligonucleotidica marcada uma só vez durante o processo de PCR, de tal modo que a segunda sequência oligonucleotidica 2 ΡΕ1726664 marcada uma só vez já não é capaz de hibridar com a primeira sequência oligonucleotidica marcada uma só vez, sendo assim gerado um sinal mensurável.
2. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1 em que uma das primeira e segunda sequências oligonucleotidicas marcadas uma só vez consiste numa sequência oligonucleotidica marcada por fluorescência e a outra das sequências oligonucleotidicas marcadas uma só vez consiste numa sequência oligonucleotidica marcada com um desactivador.
3. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, incorporado num sistema de PCR para detectar uma sequência especifica, em que as referidas primeira sequência oligonucleotidica marcada uma só vez e segunda sequência oligonucleotidica marcada uma só vez diferem quanto ao comprimento por mais de 10 bases.
4. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, em que o processo de PCR é monitorizado em tempo real em cada ciclo ou depois de vários ciclos quando a reacção ainda não produziu produto suficiente para criar um sinal mensurável por abaixamento da temperatura da reacção para permitir que ocorra hibridação.
5. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, em que a referida primeira sequência tem uma Tm que está acima da Ta do processo de PCR. 3 ΡΕ1726664
6. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, em que a referida segunda sequência tem o marcador desactivador do par desactivado fluorescente.
7. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, em que o processo de PCR é uma genotipagem de SNP baseado em PCR especifica de alelos.
8. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, em que o processo de PCR é monitorizado através da utilização só de hibridação.
9. Método de detecção de acordo com a reivindicação 8, em que o processo de PCR é monitorizado através da utilização só de hibridação pós-PCR.
10. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, em que os pares oligonucleotidicos desactivadores de fluorescência variam entre 6 pb e 100 pb.
11. Método de detecção de acordo com a reivindicação 10, em que os pares oligonucleotidicos desactivadores de fluorescência variam entre 6 pb e 100 pb mas não correspondem ao mesmo comprimento.
12. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, em que os pares oligonucleotidicos desactivadores de fluorescência estão ambos marcados com fluoróforos. 4 ΡΕ1726664
13. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, em que os pares oligonucleotidicos desactivadores de fluorescência estão marcados um do par com um fluoróforo e o outro com uma molécula de desactivação não fluorescente .
14. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, em que os pares oligonucleotidicos de fluorescência desactivada são modificados para serem resistentes à degradação por nucleases.
15. Método de detecção de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que os pares oligonucleotidicos de fluorescência desactivada estão marcados com moléculas que são sensíveis à distância.
16. Método de detecção de acordo com a reivindicação 15, em que o processo de PCR é monitorizado através da utilização só de hibridação.
17. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, em que os pares oligonucleotidicos de fluorescência desactivada contêm bases nucleotidicas modificadas. Lisboa, 7 de Abril de 2010