ES2960312T3

ES2960312T3 - Métodos y kits para la detección de moléculas de ácido nucleico

Info

Publication number: ES2960312T3
Application number: ES18773818T
Authority: ES
Inventors: Rebecca Louise Howard
Original assignee: LGC Genomics Ltd
Current assignee: LGC Genomics Ltd
Priority date: 2017-08-18
Filing date: 2018-08-20
Publication date: 2024-03-04
Anticipated expiration: 2038-08-20
Also published as: CA3072538A1; EP3668999B1; CN111247252A; PT3668999T; EP3668999A1; WO2019034898A1; US20200248241A1; LT3668999T; GB201713251D0; PL3668999T3; BR112020003339A2; DK3668999T3

Abstract

Un método para la detección de uno o más productos de amplificación de polinucleótidos, comprendiendo el método, en una realización, las etapas de: a) proporcionar uno o más grupos cebadores de oligonucleótidos, comprendiendo cada grupo: i) un cebador directo que comprende un casete de fluorescencia específico porción y una porción específica del objetivo aguas abajo de 3"; y ii) uno o más cebadores específicos de diana; b) proporcionar uno o más pares inactivados fluorescentes, caracterizado cada par por: i) un primer oligonucleótido de casete marcado con un resto fluorescente y que tiene una secuencia que es capaz de hibridarse con el complemento de la porción específica del casete de fluorescencia del cebador directo de un grupo cebador oligonucleotídico determinado; y ii) un segundo oligonucleótido de casete marcado con un resto desactivador; c) iniciar una reacción isotérmica de amplificación de polinucleótidos en presencia de una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena generando de este modo una secuencia complementaria a al menos una porción del cebador directo relevante, de manera que el oligonucleótido del segundo casete relevante sea menos capaz de hibridarse con el primer casete relevante oligonucleótido, mediante el cual se genera una señal; y d) detectar la señal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y kits para la detección de moléculas de ácido nucleico

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y kits para la detección de moléculas de ácido nucleico, en particular, productos de amplificación de polinucleótidos formados en una reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica.

Antecedentes de la invención

Las técnicas de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos específica de secuencia ofrecen ventajas sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del ingléspolymerase chain reaction)tradicional, porque pueden proporcionar una detección molecular rápida y sensible sin la necesidad de equipos de ciclo térmico como los que se utilizan en la PCR. Pueden resultar particularmente útiles en diagnósticos moleculares de campo o en el lugar de atención debido a su idoneidad para su uso con instrumental portátil y de menor potencia.

En contraste con la PCR, que desnaturaliza el ADN bicatenario (ADNbc) con calor, los métodos de amplificación isotérmica normalmente utilizan actividad enzimática para separar las cadenas de un polinucleótido diana y permiten la hibridación de cebadores oligonucleotídicos específicos de secuencia. La reacción de amplificación está impulsada por múltiples rondas de hibridación de cebadores, extensión de cebadores y separación de cadenas, y se realiza a una temperatura única. Aunque actualmente se utilizan muchos sistemas de amplificación, no todos son lo suficientemente simples como para proporcionar una detección específica en un corto período de tiempo. Aquellos que pueden prestarse a una amplificación rápida suelen utilizar una polimerasa de desplazamiento de cadena que cumple la doble función de separación de cadenas y extensión del cebador. Dichos métodos incluyen la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) (Notomiet al.,2000, Nucleic Acids Res.28(12):E63, Loop-mediated isothermal amplification of DnA; Nagamineet al.,2002, Mol Cell Probes. 16(3):223-9, Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers), la amplificación inteligente (SMAP) (Lezhava y Hayashizaki, 2009, Methods Mol Biol. 578:437-51 Detection of SNP by the isothermal smart amplification method, and Cross-Priming Amplification (CPA) (Xuet al.,2012, Sci Rep. 2:246, Cross priming amplification: mechanism and optimization for isothermal DNA amplification). Cada uno de estos es capaz de producir abundantes productos de amplificación de polinucleótidos a partir de un polinucleótido diana utilizando una polimerasa de desplazamiento de cadena junto con cebadores oligonucleotídicos complejos.

Si bien muchos métodos de amplificación isotérmica anteriores se han basado en la detección de ácidos nucleicos diana utilizando métodos de turbidez o colorantes intercalados, en los últimos años, la detección mediante sondas fluorescentes se ha vuelto más común. Los métodos típicos de detección con sondas fluorescentes implican el uso de sondas que están diseñadas para unirse al polinucleótido diana amplificado de una manera específica de secuencia. Por ejemplo, las sondas TaqMan son oligonucleótidos con doble marcador que se hibridan con polinucleótidos diana. Una actividad exonucleasa 5'-3' de una ADN polimerasa desplaza y degrada la sonda, liberando el fluoróforo del desactivador. Dichas sondas se han utilizado con éxito en reacciones de amplificación isotérmicas múltiples en las que se incluye una helicasa para separar las cadenas del ADNbc diana (Tonget al.,2008, Biotechniques. 45(5):543-57. doi: 10.2144/000112959, Development of isothermal TaqMan assays for detection of biothreat organisms). Las sondas HyBeacon son oligonucleótidos monocatenarios con una o más bases internas marcadas con un colorante fluorescente. Son más fluorescentes cuando se hibridan con una diana complementaria que cuando son monocatenarios, y su hibridación con una diana se puede controlar mediante análisis de curvas de fusión o hibridación. Las sondas HyBeacon se han utilizado con éxito para detectar productos de amplificación de reacciones de amplificación isotérmicas, y las variaciones de secuencia en la secuencia diana se pueden detectar como diferentes máximos de fusión (Howardet al.,2015, Mol Cell Probes. 29(2):92-8, doi: 10.10161j.mcp.2014.12.001, Rapid detection of diagnostic targets using isothermal amplification and HyBeacon probes--a homogenous system for sequencespecific detection). Por ejemplo, se puede utilizar una sonda HyBeacon para distinguir diferentes alelos en un producto de amplificación, en virtud de ser completamente complementario a un alelo e incorporar un emparejamiento incorrecto con respecto a otro alelo.

La técnica LAMP se ha adaptado recientemente para la detección de múltiples dianas, mediante la adaptación de uno de los cebadores LAMP específicos de la diana para cada reacción de amplificación a fin de que contenga un desactivador o fluoróforo, y la provisión de un oligonucleótido complementario que contenga un fluoróforo o desactivador, según corresponda, que forme un dúplex con el cebador LAMP (Tanneret al.,2012, Biotechniques.

53(2):81-9. doi: 10.2144/0000113902, Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification). La separación de cadenas de la región dúplex durante la reacción de amplificación da como resultado una ganancia de señal de fluorescencia. El uso de diferentes pares de fluoróforo/desactivador permite la detección de múltiples dianas. Sin embargo, la selección de dianas depende de la especificidad del oligonucleótido marcado complementario para el cebador LAMP específico de la diana marcado y de la falta de reactividad cruzada con otros cebadores LAMP específicos de la diana utilizados en una reacción múltiple. En la práctica, el método se ha utilizado para detectar secuencias diana altamente divergentes procedentes de ADN humano, deE. coli, C. elegansy de bacteriófagos en multiplex.

Existe la necesidad de métodos de detección que no se basen únicamente en diferencias entre la secuencia de nucleótidos de las secuencias diana para permitir que se distingan diferentes productos de amplificación en reacciones de amplificación isotérmicas. La presente invención proporciona un método en el que se incorpora un casete de detección al producto de amplificación, y la presencia del casete o su complemento se detecta mediante la hibridación con un oligonucleótido del casete, que normalmente está marcado. Con los oligonucleótidos del casete marcados de manera diferente se pueden detectar diferentes casetes o sus complementos, permitiendo distinguir incluso productos estrechamente relacionados en reacciones múltiples. Se han desarrollado oligonucleótidos de casete adecuados para su uso en la PCR convencional (Documentos US 2007/117108 A1, US 2013/252238 A1 y WO 2014/135872 A1), pero no se han utilizado previamente en reacciones de amplificación isotérmicas, que requieren cebadores oligonucleotídicos multidominio complejos.

La enumeración o discusión de un documento publicado previamente en la presente memoria descriptiva no debe considerarse una aceptación de que el documento forme parte del estado de la técnica o de que sea el conocimiento común general.

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

De acuerdo con la invención, se proporciona un método para la detección de uno o más productos de amplificación de polinucleótidos, comprendiendo el método las etapas de:

a) proporcionar uno o más grupos de cebadores oligonucleotídicos, comprendiendo cada grupo uno o más conjuntos de cebadores oligonucleotídicos, cada conjunto caracterizado por que:

i) un primer cebador oligonucleotídico (cebador directo) que comprende una parte específica del casete de fluorescencia y una parte en 3' cadena abajo específica de la diana; y

ii) uno o más cebadores oligonucleotídicos específicos de la diana;

en donde cada uno de los cebadores oligonucleotídicos de un conjunto particular es adecuado para la hibridación con una cadena de un polinucleótido diana para permitir la formación de un producto de amplificación del polinucleótido diana en una reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica;

y en donde el primer cebador oligonucleotídico de cada conjunto del mismo grupo contiene una parte específica del casete de fluorescencia que es capaz de hibridarse con el complemento de la parte específica del casete de fluorescencia del primer cebador oligonucleotídico de cualquier conjunto del mismo grupo;

b) proporcionar uno o más conjuntos de oligonucleótidos del casete, cada conjunto caracterizado por que:

i) un primer oligonucleótido del casete marcado con una fracción fluorescente (fracción donante) y que tiene una secuencia capaz de hibridarse con el complemento de la parte específica del casete de fluorescencia del primer cebador oligonucleotídico de cualquier conjunto en un grupo de cebadores oligonucleotídicos determinado; y

ii) un segundo oligonucleótido del casete marcado con una fracción aceptora (por ejemplo, una fracción desactivadora);

en donde los oligonucleótidos del casete de cada conjunto se hibridan entre sí para formar un par desactivado fluorescente;

c) iniciar una reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica en presencia de una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena generando de este modo (si el polinucleótido diana está presente) una secuencia complementaria a al menos una parte del primer cebador oligonucleotídico en cuestión, de modo que el segundo oligonucleótido del casete en cuestión (aceptor, por ejemplo, desactivador, marcado) sea menos capaz de hibridarse con el primer oligonucleótido del casete en cuestión (marcado con fluorescencia), generándose así una señal; y

d) detectar la señal que se genera.

También se proporcionan kits adecuados para su uso en dicho método.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1A: Las secuencias diana utilizadas en la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) se muestran junto con los cebadores LAMP clásicos correspondientes. En un método ilustrativo de la invención, se incorpora una secuencia universal del casete en uno de los 'cebadores internos' de LAMP entre las secuencias F1c y F2 (o B1c y B2), como se muestra. Esto incorpora la secuencia del casete universal en uno de los 'bucles' LAMP donde es accesible.

Figura 1B: Esta figura muestra, basándose en las estructuras definidas en la figura 1A, el mecanismo por el cual la secuencia del casete universal puede incorporarse en un producto de reacción LAMP, replicarse y detectarse su complemento. En esta figura se muestra sólo la parte relevante de la reacción LAMP completa.

Figura 2: En esta figura se muestran datos en tiempo real (A/B) y datos finales (C) generados cuando se combina la reacción LAMP de genotipado de SNP descrita en el ejemplo 1 con el sistema de detección isotérmica del casete universal. En la figura se muestra:

A) Datos en tiempo real generados en el canal de detección FAM de un instrumento Roche LightCycler 480. Las señales de fluorescencia pertenecientes a múltiples reacciones están superpuestas, con un grupo de señales mostrando desarrollo de fluorescencia con el tiempo y el otro grupo mostrando un desarrollo de fluorescencia mínimo o nulo con el tiempo. Una señal plana es para un control sin diana.

B) Datos en tiempo real generados en el canal de detección HEX de un instrumento Roche LightCycler 480. Las señales de fluorescencia pertenecientes a múltiples reacciones están superpuestas, con un grupo de señales mostrando desarrollo de fluorescencia con el tiempo y el otro grupo mostrando un desarrollo de fluorescencia mínimo o nulo con el tiempo. Los miembros de los grupos de fluorescencia alta y baja corresponden respectivamente a los miembros de los grupos de fluorescencia baja y alta que se muestran en A. Una señal plana es para un control sin diana.

C) Un gráfico de datos finales producido después de la amplificación, en el que el eje de ordenadas muestra la intensidad de fluorescencia del canal HEX y el eje de abscisas muestra la intensidad de fluorescencia del canal FAM. Los dos grupos de genotipado se distinguen claramente.

Figura 3: En esta figura se muestran datos en tiempo real (A/B) y datos finales (C) generados en el ejemplo 2 y como se describe para la figura 2.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención

Un primer aspecto de la invención proporciona un método para la detección de uno o más productos de amplificación de polinucleótidos, comprendiendo el método las etapas de:

ii) uno o más cebadores oligonucleotídicos específicos de la diana;

d) detectar la señal que se genera.

La etapa (a) anterior proporciona uno o más grupos de cebadores oligonucleotídicos, comprendiendo cada grupo uno o más conjuntos de cebadores oligonucleotídicos que son adecuados para generar un producto de amplificación de un polinucleótido diana en una reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica. El primer cebador oligonucleotídico de cada conjunto, también conocido como "cebador con cola", comprende tanto una secuencia en 3' cadena abajo específica de la diana como una parte específica del casete de fluorescencia. El propósito de la parte específica del casete de fluorescencia es incorporarse al producto de amplificación, de modo que el complemento de la parte específica del casete de fluorescencia esté disponible para la hibridación con un primer oligonucleótido del casete marcado con una fracción fluorescente. En cada conjunto, el complemento de la parte específica del casete de fluorescencia del primer cebador oligonucleotídico es capaz de hibridarse con el primer oligonucleótido del casete marcado con una fracción fluorescente. Normalmente, las partes específicas del casete de fluorescencia del primer cebador oligonucleotídico de cada conjunto son idénticas. Normalmente, son al menos en parte idénticas a la secuencia del primer oligonucleótido del casete. En el uso del método, el primer oligonucleótido del casete se hibrida con el o cada producto de amplificación del o cada conjunto de cebadores oligonucleotídicos, lo que genera una señal. De manera adecuada, el método implica más de un grupo de cebadores oligonucleotídicos. De manera adecuada, cada grupo de cebadores oligonucleotídicos incorpora una parte específica del casete de fluorescencia diferente en el producto de amplificación, que se hibrida con un primer oligonucleótido del casete diferente marcado con una fracción fluorescente diferente. De esta manera, se pueden distinguir múltiples dianas en virtud de la generación de diferentes señales de fluorescencia.

En la etapa (b), cada primer oligonucleótido del casete marcado con una fracción fluorescente se proporciona junto con un segundo oligonucleótido del casete marcado con una fracción aceptora, y los dos se hibridan entre sí para formar un par desactivado fluorescente. El primer oligonucleótido del casete del par es capaz de hibridarse con el complemento de la parte específica del casete de fluorescencia del primer cebador oligonucleotídico de cualquier conjunto de un grupo de cebadores oligonucleotídicos determinado. En otras palabras, no importa cuántos conjuntos de cebadores oligonucleotídicos haya en un grupo determinado, sólo se necesita un par desactivado fluorescente por grupo. De manera adecuada, el método implica más de un grupo de cebadores oligonucleotídicos, y se proporciona un par desactivado fluorescente diferente para cada grupo, lo que genera una señal de fluorescencia diferente para cada grupo en el funcionamiento del método. En una realización, cada conjunto está diseñado para generar un producto de amplificación a partir de una única diana, y cada producto de amplificación se detecta mediante la adquisición de una señal de fluorescencia diferente.

En la etapa (c), una reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica genera (si el polinucleótido diana está presente) una secuencia complementaria a al menos una parte, y normalmente todo, del primer cebador oligonucleotídico en cuestión. El primer oligonucleótido del casete (marcado con fluorescencia) se hibrida preferentemente con el complemento de la parte específica del casete de fluorescencia en el producto de amplificación y, por lo tanto, se alivia la desactivación de su señal de fluorescencia mediante el segundo oligonucleótido del casete. En la primera ronda de la reacción de amplificación de polinucleótidos, se forma un producto de extensión del cebador a partir del primer cebador oligonucleotídico. La amplificación de este producto a partir de un cebador inverso normalmente forma una secuencia complementaria al primer cebador oligonucleotídico en cuestión. Sin embargo, no se puede descartar que esta amplificación cebada inversa pueda terminar antes de que se complete la formación de una secuencia complementaria a la totalidad del primer cebador oligonucleotídico en cuestión. La parte de la secuencia complementaria al primer cebador oligonucleotídico en cuestión debe comprender al menos una parte de, normalmente todos, el complemento de la parte específica del casete de fluorescencia para que el segundo oligonucleótido del casete en cuestión (aceptor, por ejemplo, desactivador, marcado) sea menos capaz de hibridarse con el primer oligonucleótido del casete en cuestión (marcado con fluorescencia) (se considera que esto se debe a que la secuencia complementaria formada con el primer cebador oligonucleotídico en cuestión se hibrida con el primer oligonucleótido del casete).

Condiciones y componentes de la reacción

Una "reacción de amplificación de polinucleótidos", como en el método de la invención, implica la hibridación de una molécula cebadora de ácido nucleico con una cadena de una molécula polinucleotídica molde, y una reacción de extensión del cebador dependiente del molde, en la que una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena extiende el cebador hibridado mediante la adición de una secuencia de bases al extremo 3' del cebador, cuya secuencia está determinada por la secuencia de bases en la cadena molde. La formación de un producto de extensión de cebador específico de la diana, resultante de la reacción de extensión del cebador dependiente del molde, se puede considerar como la primera ronda de una reacción de amplificación de polinucleótidos. Rondas adicionales requieren la separación de cadenas del producto de extensión del cebador de modo que más cebadores puedan hibridarse con una u otra cadena y sufrir una reacción de extensión del cebador. En una reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica, a diferencia de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional, la separación de cadenas después de la formación del producto de extensión del cebador específico de la diana en la primera ronda de la reacción no se efectúa solo con calentamiento. En particular, no es necesario calentar la reacción a una temperatura superior a la temperatura seleccionada para la extensión del cebador. El método de la invención se lleva a cabo en presencia de una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena, permitiendo así que se realicen múltiples rondas de la reacción de amplificación de polinucleótidos a una temperatura relativamente constante. Normalmente, la reacción de amplificación de polinucleótidos (y opcionalmente también la detección de la señal) se realiza en su totalidad a una temperatura que es adecuada para la extensión del cebador a partir de la ADN polimerasa de desplazamiento de cadena. En determinadas realizaciones, la reacción puede enfriarse periódicamente para facilitar la detección de la señal en la etapa (d). La reacción también puede enfriarse al final, si procede, para facilitar la detección de la señal.

El término Ta será muy conocido para los expertos en la materia y se refiere a la temperatura (normalmente fijada o programada en el aparato que controla los parámetros de la reacción) a la que se produce una extensión del cebador significativa durante la reacción de extensión de cebador. Normalmente, se utilizará sustancialmente la misma Ta a lo largo de una reacción de amplificación de polinucleótidos. A veces se utilizará una Ta diferente (normalmente más elevada) en las rondas iniciales de una reacción de amplificación de polinucleótidos. Normalmente, la Ta no variará más de 10 °C, normalmente no más de 5 °C o no más de 2 °C desde el omento en el que se combinan los componentes de la reacción o se realiza la primera reacción de extensión del cebador, hasta la terminación o finalización de la reacción. Una Ta adecuada es adecuada para la operación de la ADN polimerasa de desplazamiento de cadena y es una que facilita la hibridación y extensión del cebador específico de molde. Una temperatura de reacción adecuada puede estar entre 50 °C y 75 °C, tal como, por ejemplo, entre 60 °C y 65 °C. Se puede realizar una etapa de desnaturalización inicial antes de la primera reacción de extensión del cebador para separar las cadenas de la molécula de ácido nucleico diana. Por ejemplo, la mezcla de reacción, con la excepción de la ADN polimerasa de desplazamiento de cadena, se puede calentar hasta aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5 minutos, después se enfría a aproximadamente 4 °C, antes de la adición de la ADN polimerasa de desplazamiento de cadena y la incubación a la temperatura de reacción. Puede que no sea necesaria una etapa de desnaturalización inicial. Por ejemplo, Xuet al.,2012, citado anteriormente, describen un método isotérmico en el que se incluyó betaína en el tampón de reacción para provocar la formación espontánea de burbujas de desnaturalización locales a la temperatura de reacción.

La ADN polimerasaBst,fragmento grande, es una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena adecuada y tiene actividad a temperaturas elevadas y es estable entre 50 °C y 70 °C durante >30 minutos. Se pueden seleccionar fácilmente variantes de polimerasas existentes mediante una reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica convencional, tal como una LAMP convencional que utiliza ADN lambda (Nagamine,et al.,Mol. Cel. Probes, 16:223-9 (2002), en la que se considera que una amplificación suficiente de 5 ng de ADN genómico del fago lambda es un umbral de detección en menos de 30 minutos entre 60 °C y 68 °C utilizando concentraciones de cebador convencionales. Entre las variantes de polimerasa adecuadas se incluyen las ADN polimerasasBst2.0 oBst2.0 WarmStart™ o la polimerasa 9° N™ (New England Biolabs, Ipswich, Mass.), en comparación con la ADN polimerasaBstde tipo salvaje, fragmento grande donde el tiempo de reacción múltiplex podría reducirse a tan sólo 5 a 30 minutos sin una reducción significativa de la señal. Otra variante de polimerasa adecuada esBst3.0 (New England Biolabs, Ipswich, Mass.) que es un homólogo diseñado por ordenador de las ADN polimerasa I deBacilo estearothermophilus,fragmento grande, genomanipulado para mejorar el rendimiento de la amplificación isotérmica y aumentar la actividad de transcripción inversa. La ADN polimerasaBst3.0 contiene actividad de ADN polimerasa 5 '^ 3 ' con moldes de ADN o ARN y una fuerte actividad de desplazamiento de cadena, pero carece de actividad exonucleasa 5 '^ 3 ' y 3 '^5 '.

Normalmente, la ADN polimerasa de desplazamiento de cadena carece de actividad exonucleasa 5'-3' y/o exonucleasa 3'-5'. La falta de actividad exonucleasa 3'-5' puede promover la especificidad de amplificación. Normalmente, la actividad exonucleasa 5'-3' está ausente o en niveles bajos para evitar o reducir la degradación de la cadena desplazada. En determinadas realizaciones, la ADN polimerasa de desplazamiento de cadena es la única enzima presente en la reacción. En otras realizaciones, se puede incluir una enzima adicional, tal como una proteína de unión a emparejamientos incorrectos, por ejemplo, MutS deThermus aquaticus,lo que puede reducir los emparejamientos incorrectos y la amplificación de fondo, como se describe en Lezhava y Hayashizaki, 2009,citado anteriormente,en relación con el método SMAP. Una exonucleasa 5'-3', si está presente, puede ser la ADN polimerasa I GspSSD, fragmento grande; la ADN polimerasa I GspSSD2.0, fragmento grande; o la ADN polimerasa I GspM3.0, fragmento grande, todas los cuales son termoestables y también tienen actividad transcriptasa inversa. Puede incluirse una pirofosfatasa inorgánica para evitar la acumulación de pirofosfato durante la reacción, por ejemplo, la pirofosfatasa inorgánica disponible en OptiGene Ltd, Reino Unido (N.° de cat. ISO-001nd), o la pirofosfatasa termoestable deThermococcus litoralisdivulgada en el documento WO 9612798. En una realización, las únicas enzimas presentes en la reacción son una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena y una pirofosfatasa inorgánica.

En la práctica de los métodos de la invención, es necesario producir una mezcla de amplificación de polinucleótidos, por ejemplo, una composición que incluye todos los elementos necesarios para que se produzca una reacción de amplificación de polinucleótidos.

La mezcla de reacción incluye los cebadores empleados en la reacción de extensión del cebador. Se pueden utilizar uno o más grupos de cebadores oligonucleotídicos, comprendiendo cada grupo uno o más conjuntos de cebadores oligonucleotídicos. Cada conjunto puede tener normalmente un cebador directo y otro inverso. Tal como se ha indicado anteriormente, normalmente se pueden utilizar 1, 2, 3, 4 o más grupos de cebadores. Cada grupo puede incluir normalmente un conjunto de cebadores (a menos que, por ejemplo, exista una razón por la que se desea medir los productos de amplificación combinados que surgen de dos conjuntos separados de cebadores). Cada mezcla de amplificación de polinucleótidos normalmente comprenderá al menos dos o tres cebadores directos. También puede haber un cebador inverso correspondiente para cada cebador directo, pero puede que no sean diferentes, por ejemplo en una reacción de genotipado de SNP, donde se puede utilizar un cebador inverso común con varios cebadores directos diferentes.

La mezcla de amplificación de polinucleótidos incluye al menos un par de oligonucleótidos marcados (el conjunto o conjuntos de oligonucleótidos del casete), cuyos oligonucleótidos se hibridan entre sí para formar un par desactivado fluorescente, en donde un oligonucleótido está marcado con una fracción fluorescente y el otro oligonucleótido está marcado con una fracción desactivadora. El oligonucleótido marcado fluorescente de cada conjunto comprende una secuencia capaz de hibridar con el complemento o complementos de la región específica del casete de fluorescencia del primer cebador oligonucleotídico (cebador directo) de cada conjunto de cebadores de un grupo particular.

El ácido nucleico que sirve de molde puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, donde normalmente el ácido nucleico es ácido desoxirribonucleico (ADN), pero, como alternativa, puede ser ácido ribonucleico (ARN). La longitud del ácido nucleico molde puede ser tan corta como 20 pb, pero normalmente tienen una longitud de al menos aproximadamente 50 o 100 pb, y más normalmente de al menos aproximadamente 150 pb, y pueden llegar a las 1.000 o 10.000 pb o más, por ejemplo, 50.000 pb de longitud o más, incluyendo un extracto de ADN genómico, una digestión del mismo o un lisado en bruto, etc. El ácido nucleico puede estar libre en solución, flanqueado en uno o ambos extremos por ácido nucleico no molde, presente en un vector, por ejemplo, un plásmido y similares, con el único criterio de que el ácido nucleico esté disponible para participar en la reacción de extensión del cebador. El ácido nucleico molde puede estar presente en forma purificada o en una mezcla compleja con otros ácidos nucleicos no molde, por ejemplo, en una preparación de ADN celular, etc.

El ácido nucleico molde puede proceder de una variedad de fuentes diferentes, dependiendo de la aplicación para la que se realice la PCR, donde tales fuentes incluyen organismos que comprenden ácidos nucleicos, es decir, virus; procariotas, por ejemplo, bacterias, arqueas y cianobacterias; y eucariotas, por ejemplo, vertebrados, incluyendo reptiles, peces, aves, serpientes y mamíferos, por ejemplo, roedores, primates, incluidos seres humanos. El ácido nucleico molde puede utilizarse directamente de su fuente de origen natural, por ejemplo, como lisado bruto y/o se puede preprocesar de diferentes maneras, como se conoce en la materia. En algunas realizaciones, el ácido nucleico molde puede ser de una fuente sintética.

La mezcla de reacción puede contener varios componentes tampón, sales, dNTP, agentes tamponantes, cationes divalentes, por ejemplo, procedentes de sales de magnesio, como se conoce en la materia. El MgSO4 puede estar incluido, normalmente en un intervalo de 3,5 mM a 5,5 mM, tal como a una concentración de 4 mM.

Cebadores oligonucleotídicos

Tal como se ha indicado anteriormente, cada conjunto de cebadores oligonucleotídicos incluye un primer cebador oligonucleotídico (cebador directo) que comprende una parte específica del casete de fluorescencia y una parte específica de la diana situada en 3' cadena abajo; y uno o más cebadores oligonucleotídicos específicos de la diana. El primer cebador oligonucleotídico puede incluir una o más partes de cebador adicionales y, de la misma manera, uno o más de los cebadores oligonucleotídicos específicos de la diana pueden comprender más de una parte del cebador. Una "parte del cebador" pretende significar una parte de un cebador que tiene un papel en la formación del producto de amplificación de polinucleótidos. Las partes del cebador típicas son partes específicas de la diana, pero también pueden incluir partes de autohibridación.

De manera adecuada, la parte del cebador, o cada una parte del cebador, está diseñada para tener una temperatura de fusión (Tm) prevista para ser aproximadamente 5 °C por encima de la Ta de la reacción. La Tm de un oligonucleótido es la temperatura en °C a la que el 50 % de las moléculas de una población de un oligonucleótido monocatenario se hibridan con su secuencia complementaria y el otro 50 % de las moléculas de la población no se hibrida con dicha secuencia complementaria. Una fórmula comúnmente utilizada para determinar la Tm de una secuencia es Tm = 4(G C) 2(A T). La Tm de un par de oligonucleótidos también se puede medir de manera empírica, por ejemplo, la Tm puede medirse utilizando el análisis de la curva de fusión, por ejemplo, utilizando un instrumento Roche LightCycler 480 en una placa blanca de 96 pocillos. La Tm puede ensayarse en tampón de reacción convencional en ausencia de polimerasa. El tampón de reacción estándar se indica en los ejemplos. Los máximos de fusión pueden generarse a partir de los datos de la curva de fusión mediante la función de análisis del LightCycler 480 (-dF/dt). Las Tm se calculan utilizando una opción de Tm manual para identificar el punto más bajo en el máximo de fusión inverso. Cuando se hace referencia a una Tm para la hibridación que implica parte de un oligonucleótido, se considera que la Tm en cuestión es la Tm que puede determinarse para una hibridación utilizando un oligonucleótido de prueba correspondiente a la parte en cuestión de ese oligonucleótido. Las partes del cebador que tienen una Tm adecuada normalmente tienen una longitud de secuencia de entre 18 y 30 nucleótidos.

Normalmente, el primer cebador oligonucleotídico (cebador directo) tiene una parte específica de la diana en 5' cadena arriba con respecto a la parte específica del casete de fluorescencia. En determinadas realizaciones, el primer cebador oligonucleotídico (cebador directo) puede tener una parte de autohibridación en 5' cadena arriba con respecto a la parte específica del casete de fluorescencia. Por autohibridación se entiende que la parte forme una estructura en horquilla a la Ta de la reacción, tal como por tener una parte en 5' que es el complemento inverso de su parte en 3'. Normalmente, el método de amplificación de polinucleótidos que implica el primer cebador oligonucleotídico no es la reacción en espiral de la polimerasa, como se describe en Liuet al.,2015, Sci Rep. 5:12723. doi: 10.1038/srep12723, Polymerase Spiral Reaction (PSR): A novel isothermal nucleic acid amplification method.

En una realización, el primer cebador oligonucleotídico (cebador directo) tiene una parte específica de la diana en 5' cadena arriba con respecto a la parte específica del casete de fluorescencia. Los conjuntos de cebadores oligonucleotídicos que incluyen dicho primer cebador oligonucleotídico pueden aplicarse adecuadamente en amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP), amplificación de cebado cruzado (CPA) o amplificación inteligente (SMAP).

Una reacción de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), como se describe en Notomiet al.,2000, citado anteriormente, necesita dos cebadores internos y dos cebadores externos. Los cebadores internos se denominan cebador interno directo (FIP, del inglésforwardinnerprimer)y cebador interno inverso (BIP, del inglésbackwardinner primer),y cada uno contiene dos partes específicas de la diana correspondientes a las secuencias de sentido y antisentido del ADN diana, uno para el cebado de la primera etapa y otro para la autohibridación en etapas posteriores. La extensión de los cebadores externos en las primeras etapas provoca que el producto de extensión del respectivo cebador interno sea desplazado por la polimerasa de desplazamiento de cadena. En etapas posteriores, los cebadores directos pueden hibridarse con una estructura de bucle monocatenario que se forma mediante la hibridación de la parte específica de la diana en 5' cadena arriba con su complemento en el producto de extensión. Se pueden incluir cebadores adicionales para acelerar la reacción, como se describe en Nagamineet al.,2002, citado anteriormente. En una realización, el cebador FIP y/o BIP puede modificarse para incluir la parte específica del casete de fluorescencia entre las partes específicas de la diana en 5' cadena arriba y en 3' cadena abajo.

En la amplificación de cebado cruzado (CPA) "simple" y "doble" descrita en Xuet al.,2012, citado anteriormente, uno o ambos extremos del producto de amplificación incluyen respectivamente un bucle formado por un cebador cruzado. En la CPA "simple", el cebador cruzado contiene secuencias de cola en 5' que son idénticas a un cebador para la cadena complementaria. Esto permite el desplazamiento de la cadena mediante la extensión desde un cebador cadena arriba e incorpora un segundo sitio de cebado definido en el extremo 5' del producto resultante. Cada uno de los cebadores para la cadena opuesta consiste en una única secuencia complementaria al molde y se eligen de manera que se unan en tándem al molde, lo que proporciona una región de ADN bicatenario mellado que puede extenderse mediante una ADN polimerasa que desplaza la cadena. En una CPA "doble", se utilizan cebadores de antisentido directos e inversos, y cada cebador cruzado contiene secuencias de cola en 5' idénticas al sitio de cebado de cada uno, introduciendo así sitios de cebado adicionales en cada ronda de extensión. En una realización, el cebador cruzado en la CPA "simple", o uno o ambos cebadores cruzados en la CPA "doble", puede modificarse para incluir la parte específica del casete de fluorescencia entre las partes específicas de la diana en 5' cadena arriba y en 3' cadena abajo.

En la amplificación inteligente (SMAP) descrita en Lezhava y Hayashizaki, 2009,citado anteriormente,un cebador de retorno (TP, del inglésturn-back primer)con cola y un cebador de plegamiento (FP, del inglésfolding primer)con cola ceban las reacciones de extensión a partir de cualquiera de las cadenas, y son desplazados a su vez por cebadores externos. Por lo general, también se incluye un cebador de refuerzo. Los cebadores externos y el Tp pueden ser respectivamente los mismos que los cebadores externos y FIP o BIP utilizados en LAMP. Sin embargo, el FP se diferencia del FIP o BIP en que su cola no es una parte específica de la diana, sino una parte autohibridada, que puede existir como una horquilla. Esto facilita la síntesis de ADN autocebado a partir del FP, perpetuando así la reacción. En particular, cuando se genera un complemento de la sección de plegado, el extremo 3' del producto de síntesis se autohibrida y actúa como cebador para sintetizar una cadena adicional de la diana. En una realización, el TP puede modificarse para incluir la parte específica del casete de fluorescencia entre las partes específicas de la diana en 5' cadena arriba y en 3' cadena abajo.

En una realización alternativa, el primer cebador oligonucleotídico (cebador directo) tiene una parte de autohibridación en 5' cadena arriba con respecto a la parte específica del casete de fluorescencia. Los conjuntos de cebadores oligonucleotídicos que incluyen dicho primer cebador oligonucleotídico se pueden aplicar adecuadamente en SMAP. Esta realización corresponde a SMAP en la que el FP se modifica para incluir la parte específica del casete de fluorescencia.

Dado que el primer cebador oligonucleotídico puede contener una o dos partes de cebador además de la parte específica del casete de fluorescencia, normalmente puede tener entre 30 y 120 nucleótidos de longitud, tal como entre 40 y 90 nucleótidos de longitud, o entre 40 y 80 nucleótidos de longitud.

Los cebadores se incluyen de manera adecuada en la reacción de amplificación, tal como en LAMP, CPA o SMAP, en un intervalo de concentración de 0,1 a 2,0 pM. Para reacciones LAMP, las concentraciones preferidas son: Cebadores BIP/FIP de 0,8 a 2,0 pM; Cebadores F31B3 de 0,2 a 0,8 pM; y LoopF/LoopB (si está presente) de 0,4 a 1,0 pM. Se describen concentraciones de cebadores y condiciones de reacción ilustrativas en Howardet al.,2015, citado anteriormente, para cada una de LAMP, CPA y SMAP.

Conjuntos de oligonucleótidos del casete y partes específicas del casete de fluorescencia

Tal como se ha indicado anteriormente, la parte específica del casete de fluorescencia o secuencia "marcador" de cada uno de los primeros cebadores oligonucleotídicos (cebadores directos) de un grupo determinado puede ser normalmente idéntica o estar estrechamente relacionada, por ejemplo, tener la misma longitud o diferir en longitudes inferiores a aproximadamente 10, más normalmente 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos y no puede haber más de 3, 2 o 1 nucleótidos no idénticos. Puede ser más sencillo que estas partes específicas del casete de fluorescencia sean idénticas, pero no es esencial, lo que permite más flexibilidad en el diseño de los oligonucleótidos.

La parte específica del casete de fluorescencia o secuencia o secuencias marcador de un grupo normalmente diferirán significativamente de las de un grupo diferente, de modo que no hay una hibridación prácticamente relevante entre la o las partes específicas del casete de fluorescencia de un grupo y los complementos de la o las partes específicas del casete de fluorescencia de otro grupo, como resultará evidente para aquellos expertos en la materia.

Los conjuntos de oligonucleótidos del casete adecuados y las partes específicas del casete de fluorescencia se describen en los documentos US 2007/117108 A1, US 2013/252238 A1 y WO 2014/135872 A1.

Los primeros cebadores oligonucleotídicos (cebadores directos) de un grupo tienen cada uno una parte específica del casete de fluorescencia (normalmente idéntica o estrechamente relacionada). Tras la introducción (por ejemplo, por el progreso de la reacción de extensión del cebador cuando el ácido nucleico diana al que se dirigen los cebadores de un determinado conjunto de cebadores está presente) de una secuencia complementaria a la parte específica del casete de fluorescencia (con la que el oligonucleótido del casete de fluorescencia marcado fluorescente es capaz de hibridarse), se genera una señal detectable, porque el oligonucleótido del casete de fluorescencia marcado con aceptor (desactivador) es menos capaz de unirse al oligonucleótido del casete de fluorescencia marcado fluorescente (donante) y desactivar la señal del mismo. A medida que avanza la reacción de amplificación del polinucleótido y se genera más producto de extensión con el que el oligonucleótido del casete de fluorescencia marcado fluorescente es capaz de hibridarse, generalmente mayor será la señal producida.

Por tanto, además del dominio de fluoróforos, el oligonucleótido marcado fluorescente también comprende una secuencia que es capaz de hibridar con el complemento de la parte específica del casete de fluorescencia de un grupo dado de primeros cebadores oligonucleotídicos (cebadores directos). Esta secuencia "marcador" se une a una secuencia de ácido nucleico (producto de extensión) que se crea como complemento del o de los cebadores etiquetados incluidos en la reacción (que pueden estar sin marcar, o que pueden ser por ejemplo, el propio oligonucleótido del casete marcado fluorescente en rondas posteriores de la reacción de extensión del cebador), por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas. El oligonucleótido marcado fluorescente puede o no ser capaz de actuar como cebador en una reacción de amplificación de polinucleótidos (por ejemplo, puede tener un grupo OH en 3'). Se considera que, en general, se forma más producto de extensión de cebador y, por lo tanto, se obtiene una mejor señal, si el o un primer oligonucleótido del casete marcado con una fracción fluorescente es capaz de actuar como un cebador en la reacción de amplificación de polinucleótidos. El oligonucleótido del casete de fluorescencia marcado con aceptor/desactivador puede no ser capaz de actuar como cebador en una reacción de extensión de cebador, por ejemplo, porque el aceptor/desactivador puede impedir que el oligonucleótido actúe como cebador.

Además del dominio aceptor, el oligonucleótido del casete marcado con una fracción aceptora es capaz de hibridar con el oligonucleótido del casete marcado fluorescente correspondiente para formar un par fluorescente desactivado.

Normalmente, el oligonucleótido del casete marcado fluorescente no comprende una parte específica de la secuencia diana, es decir, no comprende una secuencia que hibrida (a la Ta de la reacción de amplificación de polinucleótidos) con el polinucleótido diana con el que se pretende que hibride una parte específica de la diana del primer cebador o cebadores oligonucleotídicos. Por tanto, en tal disposición, el oligonucleótido del casete marcado fluorescente no está ligado a una secuencia diana concreta, pero puede utilizarse en la detección de un producto de amplificación de polinucleótidos, resultante de cualquier secuencia diana (con los conjuntos de oligonucleótidos cebadores adecuados) procedente de cualquier secuencia diana.

El oligonucleótido del casete marcado fluorescente (y el correspondiente oligonucleótido del casete marcado con aceptor/desactivador) puede incluirse en una mezcla de ensayo "maestra", para usarse junto con una mezcla de "ensayo" (específica de la diana). Normalmente, el oligonucleótido del casete marcado con aceptor/donante tampoco comprende una parte específica de la secuencia diana. Por tanto, en una realización, el primer y segundo oligonucleótidos del casete de cada conjunto no comprenden una parte específica de la diana.

En una disposición alternativa, el primer cebador oligonucleotídico es el oligonucleótido del casete marcado fluorescente, y el marcador fluorescente se incorpora directamente al producto de amplificación.

Normalmente, el oligonucleótido del casete marcado fluorescente consiste en la fracción fluorescente (fracción donante) y la secuencia capaz de hibridar con el complemento de la parte específica del casete de fluorescencia de un primer cebador oligonucleotídico. Normalmente, el oligonucleótido del casete marcado con aceptor/desactivador consiste en la fracción aceptora/desactivadora y la secuencia capaz de hibridar con la parte específica del casete de fluorescencia del oligonucleótido del casete marcado con fluorescencia.

La interacción entre el oligonucleótido del casete de fluorescencia marcado fluorescente (donante) y el oligonucleótido del casete de fluorescencia marcado con aceptor (desactivador) es, normalmente, menos estable que la interacción entre el oligonucleótido del casete de fluorescencia marcado fluorescente (donante) y el producto de extensión complementario de la parte específica del casete de fluorescencia del cebador oligonucleotídico directo de cada conjunto de cebadores del grupo en cuestión. Dicha disposición puede ser útil para lograr un equilibrio óptimo entre evitar la generación de señales anómalas y permitir que la reacción de extensión del cebador transcurra de manera eficaz. Por tanto, la Tm para la hibridación entre el oligonucleótido del casete de fluorescencia marcado fluorescente (donante) y el oligonucleótido del casete de fluorescencia marcado con aceptor (desactivador) (en el presente documento Tm A) puede ser menor que la Tm para la hibridación entre el oligonucleótido del casete de fluorescencia marcado fluorescente (donante) y el producto de extensión complementario a la parte específica del casete de fluorescencia del cebador oligonucleotídico directo (en el presente documento Tm C) de cada conjunto de cebadores del grupo en cuestión (por ejemplo, entre aproximadamente 1 y 10 °C menos).

En un ejemplo (por ejemplo, cuando el oligonucleótido del casete marcado fluorescente no comprende una secuencia específica de diana), el oligonucleótido del casete marcado con desactivador es entre 1 y 5 bases de nucleótidos más corto que el oligonucleótido del casete marcado fluorescente. Normalmente, la parte no apareada (en relación con el oligonucleótido del casete marcado con desactivador) del oligonucleótido del casete marcado fluorescente se encuentra en el extremo 3' del oligonucleótido del casete marcado fluorescente u "opuesto" al extremo 5' del oligonucleótido del casete marcado con desactivador. La parte del cebador (o cebadores) oligonucleotídico en cuestión cuyo complemento hibrida con el oligonucleótido del casete marcado fluorescente suele estar dentro de aproximadamente 5 nucleótidos de la longitud (por ejemplo, entre 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótido más corto y 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótido más largo; por ejemplo, la misma longitud) del oligonucleótido del casete marcado con fluorescencia, por ejemplo, con cualquier diferencia de longitud, normalmente en el extremo 5' del cebador oligonucleotídico y del oligonucleótido del casete marcado con fluorescencia. En rondas posteriores de la reacción de amplificación de polinucleótidos, el oligonucleótido del casete marcado fluorescente puede actuar como cebador por sí mismo, por lo que el complemento formado durante la extensión del cebador se extenderá generalmente hasta el extremo 5' del oligonucleótido del casete marcado fluorescente. Por tanto, la parte del complemento que hibrida con el oligonucleótido del casete marcado con desactivador es normalmente tan larga como el oligonucleótido del casete marcado con desactivador.

En otros ejemplos, como alternativa o además puede haber más emparejamientos incorrectos (o más significativos) entre el oligonucleótido del casete marcado con desactivador y el oligonucleótido del casete marcado fluorescente que entre el complemento del cebador (o cebadores) oligonucleotídico en cuestión y el oligonucleótido del casete marcado fluorescente. Como saben bien los expertos en la materia, la posición de una emparejamiento incorrecto dentro de un par de oligonucleótidos y la naturaleza del emparejamiento incorrecto (por ejemplo, si se interrumpe un emparejamiento A:T o un emparejamiento G:C) influirán en la importancia del emparejamiento incorrecto en el cambio en la estabilidad/cambio de la Tm.

En otros ejemplos más, como alternativa o además pueden utilizarse diferentes nucleótidos/bases en el oligonucleótido del casete marcado con desactivador en relación a los utilizados en la mezcla de reacción de extensión de cebador (y por lo tanto incorporados en el complemento de los cebadores), alterando de esta manera la estabilidad relativa de las hibridaciones entre el oligonucleótido del casete marcado con desactivador y el oligonucleótido del casete marcado fluorescente y el producto de extensión de cebador. Por lo general, la base o bases "no convencionales" pueden utilizarse en el oligonucleótido del casete marcado con desactivador y las bases "convencionales" pueden utilizarse en la mezcla de extensión de cebadores, pero también son posibles otras disposiciones, como será evidente para la persona experta.

La Tm (Tm A) del par o pares fluorescentes desactivados suele estar dentro de (±) 20 °C, tal como dentro de (±) 10 °C, de la Ta de la reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica. En realizaciones ilustrativas, la Tm del par fluorescente desactivado puede ser de aproximadamente 55 °C, como se describe en el documento US 2007/117108 A1, entre 48 y 50 °C, como se describe en el documento US 2013/252238 A1, o aproximadamente 62 °C, como se describe en el documento WO 2014/135872 A1.

En una realización, la Tm (Tm A) del par o pares fluorescentes desactivados está por encima de la Ta de la reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica, tal como hasta 15 °C, hasta 10 °C, o entre 1 y 10 °C por encima de la Ta de la reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica. En esta disposición, el oligonucleótido fluorescente no incorporado se hibrida con el oligonucleótido desactivador a la temperatura de adquisición de fluorescencia, lo que permite controlar la reacción en tiempo real o en el punto final. Una ventaja de esta realización es que la detección en tiempo real se puede realizar a la temperatura de la reacción de amplificación; no se necesita enfriamiento de la reacción. En el documento WO 2014/135872 A1 se describen pares desactivados fluorescentes adecuados y partes oligonucleotídicas específicas del casete de fluorescencia.

Independientemente de si la Tm A está por encima, en o por debajo de la Ta, uno de los primeros o segundos casetes oligonucleotídicos en cada conjunto puede tener una Tm que está en o por debajo de la Ta de la reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica. Normalmente, la Tm del segundo casete oligonucleotídico está en o por debajo de la Ta, y la Tm del primer oligonucleótido del casete está por encima de la Ta de la reacción. En esta disposición, las secuencias de oligonucleótidos marcadas individualmente tienen Tm diferentes y la que tiene la Tm mayor es normalmente más de 10 nucleótidos más larga que la otra y preferentemente al menos 15 nucleótidos más larga. En los documentos US 2007/117108 A1 y US 2013/252238 A1 se describen pares desactivados fluorescentes adecuados y partes oligonucleotídicas específicas del casete de fluorescencia.

En la presente invención, uno o ambos del par de oligonucleótidos del casete marcado fluorescente (o los oligonucleótidos cebadores) pueden contener bases modificadas tales como bases modificadas con fosforotioato. El número de enlaces fosfodiéster sustituidos por fosforotioatos en cualquier oligonucleótido/cebador determinado puede variar de ninguno a todos los enlaces fosfodiéster sustituidos por fosforotioatos, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o más. El o los oligonucleótidos/cebadores pueden contener fosforotioatos en los extremos 5' y/o 3', sin embargo, se prefiere que, como alternativa o además de tales modificaciones terminales, al menos una de las bases internas del oligonucleótido/cebador sea un fosforotioato. Por ejemplo, del 10 al 90 %, del 20 al 80 %, del 30 al 70 % o del 40 al 60 % de las bases pueden ser fosforotioatos. En una realización, las bases modificadas con fosforotioato (cuando hay más de una) están separadas por al menos una, por ejemplo, de una a tres, bases no modificadas (fosfodiéster), por ejemplo, las bases alternativas dentro del o de los oligonucleótidos/cebadores pueden ser fosforotioatos. En un ejemplo, puede ser particularmente útil que el oligonucleótido o los oligonucleótidos del casete marcados fluorescentes (donantes) contengan bases modificadas con fosforotioato. Se considera que la presencia de bases modificadas con fosforotioato puede ayudar a reducir la formación de productos anómalos que pueden ser fluorescentes y, por lo tanto, dar lugar a la generación de una señal de fluorescencia errónea. Véase, por ejemplo, el documento US 2013/0252238, para un análisis de los patrones de incorporación del fosforotioato que se consideran también útiles en relación con la presente invención.

Detección de señales

La transferencia de energía fluorescente se produce cuando un donante de energía fluorescente adecuado y una fracción aceptora de energía se encuentran muy cerca uno del otro. La energía de excitación absorbida por el donante se transfiere al aceptor, que puede disipar entonces esta energía, ya sea por emisión fluorescente si es un fluoróforo, o por mecanismos no fluorescentes si es un desactivador. Un par donante-aceptor comprende dos: un grupo fluorescente y un grupo modificador de la fluorescencia con espectros superpuestos, donde la emisión del donante (grupo fluorescente) se superpone a la absorción del aceptor (modificador de la fluorescencia), de forma que hay una transferencia de energía desde el fluoróforo excitado al otro miembro del par. De esta manera, el par o los pares de oligonucleótidos marcados (conjuntos de oligonucleótidos del casete de fluorescencia) de la invención son detectores de ácidos nucleicos que incluyen un dominio fluoróforo en los oligonucleótidos separados, donde se sitúa el donante de energía fluorescente, es decir, el donante, y un segundo oligonucleótido con un dominio aceptor donde se sitúa el aceptor de energía fluorescente, es decir, el aceptor. Como se mencionó anteriormente, el oligonucleótido donante incluye el fluoróforo donante. El fluoróforo donante se puede posicionar en cualquier lugar del detector de ácidos nucleicos, pero normalmente está presente en el extremo 5' del oligonucleótido.

El dominio del aceptor incluye el aceptor de energía de fluorescencia. El aceptor se puede posicionar en cualquier lugar del dominio del aceptor, pero normalmente está presente en el extremo 3' del oligonucleótido.

En la presente invención, en un par de oligonucleótidos marcados cada uno de los oligonucleótidos del casete puede contener uno o más marcadores, por ejemplo, 1,2 o 3 marcadores. Uno o ambos oligonucleótidos del casete contienen preferentemente un solo marcador, más preferentemente ambos oligonucleótidos contienen un solo marcador.

Por ejemplo, el oligonucleótido del casete marcado fluorescente contiene preferentemente un marcador en el extremo 5' del oligonucleótido o dentro de él, y el oligonucleótido del casete marcado con desactivador contiene un marcador en el extremo 3' del oligonucleótido o dentro de él.

Los fluoróforos de los pares de oligonucleótidos marcados pueden seleccionarse de modo que pertenezcan a una familia química similar o a una diferente, tales como colorantes de cianina, xantenos o similares. Los fluoróforos de interés incluyen, pero no se limitan a, colorantes de fluoresceína (por ejemplo, 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',4',1,4,-tetraclorofluoresceína (TET), 2',4',5',7',1,4-hexaclorofluoresceína (HEX) y 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE)), colorantes de cianina, tales como el Cy5, derivados de dansilo, colorantes de rodamina (por ejemplo, tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA) y tetrapropano-6-carboxirrodamina (ROX)), DABSYL, DABCYL, cianina, tal como Cy3, antraquinona, nitrotiazol y compuestos de nitroimidazol, u otros colorantes no intercalantes. Se describen fluoróforos de interés con más detalle en las solicitudes de patentes internacionales WO 01/42505 y WO 01/86001.

Si se utiliza más de un grupo de cebadores (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) y, por consiguiente, varios conjuntos de oligonucleótidos del casete, el grupo de fluoróforos puede ser normalmente diferente para cada uno de los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) conjuntos de oligonucleótidos del casete. El grupo aceptor (por ejemplo, desactivador) puede ser el mismo o diferente siempre que sean capaces de modular la fluorescencia del grupo de fluoróforos emparejados de manera satisfactoria. Normalmente, 1, 2, 3 o 4 grupos de cebadores diferentes (cada uno de los cuales puede tener uno o más conjuntos de cebadores, normalmente un conjunto de cebadores) y, en consecuencia, 1, 2, 3 o 4 conjuntos de oligonucleótidos del casete se pueden utilizar en un único tubo de reacción. Un factor limitante puede ser el número de espectros diferentes que es posible distinguir, que puede depender de las características del equipo de generación/medición de fluorescencia disponible. Los expertos en la materia conocerán las consideraciones para elegir conjuntos de fluoróforos y aceptores/desactivadores compatibles.

La señal que se genera en los métodos de la invención puede detectarse mediante la medición de la señal en cualquier punto durante o después de la reacción de amplificación de polinucleótidos. La medición de la señal puede ser cualitativa o cuantitativa. La señal puede detectarse al final de la reacción o puede detectarse en tiempo real. Cuando la Tm del par desactivado fluorescente está por debajo de la Ta de la reacción de amplificación, la reacción puede enfriarse periódicamente para permitir la medición, tal como a una temperatura igual o inferior a la Tm del par desactivado fluorescente. Normalmente, la temperatura sólo se enfría hasta el grado necesario para detectar la fluorescencia. Por ejemplo, la reacción se puede enfriar a 37 °C cada cinco minutos.

La relación del oligonucleótido del casete marcado con aceptor con respecto al oligonucleótido del casete marcado con fluoróforo puede variar en la reacción de amplificación de polinucleótidos para optimizar la señal lograda y/o minimizar la señal que surge en un "control sin molde" (NTC, del inglésno témplate control).Las relaciones adecuadas pueden ser al menos 0,75:1, 1:1, 1,5:1, 2:1, 3:1, 4:1 o 5:1, por ejemplo, entre 1:1 y 10:1, por ejemplo, entre 1:1 y 5:1 de oligonucleótido en casete marcado con aceptor a marcado con fluoróforo en un conjunto de oligonucleótidos del casete.

Aplicaciones

La presente invención encuentra uso en una variedad de aplicaciones diferentes, y es particularmente adecuada para su uso en el genotipado de SNP específicos de alelo, detección de mutaciones somáticas, detección de patógenos, estudios de expresión génica o estudios de variación del número de copias y similares.

Definiciones

Como se utiliza en el presente documento, "ácido nucleico" significa ADN, ARN, monocatenario o bicatenario, y cualquier modificación química de los mismos. Las modificaciones incluyen, pero sin limitación, las que proporcionan otros grupos químicos que incorporan carga adicional, polarizabilidad, enlaces de hidrógeno, interacción electrostática y funcionalidad al ácido nucleico. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, modificaciones del azúcar en la posición 2', modificaciones de pirimidina en posición 5, modificaciones de purina en posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, la sustitución de 5-bromo o de 5-yodo-uracilo; modificaciones de la cadena principal, metilaciones, combinaciones inusuales de pares de bases como las isobases isocitidina e isoguanidina y similares. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones en 3' y 5', tales como el encapuchado.

Como se utiliza en el presente documento, "complementario" se refiere al par de bases nitrogenadas, que consiste en una purina unida por enlaces de hidrógeno a una pirimidina, que conecta las cadenas complementarias de ADN o de moléculas híbridas que unen el ADN y el ARN.

Como se utiliza en el presente documento, "grupo fluorescente" se refiere a una molécula que, cuando se excita con una luz que tiene una longitud de onda seleccionada, emite luz de una longitud de onda diferente. A los grupos fluorescentes también se les puede llamar "fluoróforos".

Como se utiliza en el presente documento, "grupo modificador de la fluorescencia" se refiere a una molécula que puede alterar de alguna manera la emisión de fluorescencia de un grupo fluorescente. Un grupo modificador de la fluorescencia generalmente logra esto a través de un mecanismo de transferencia de energía. Dependiendo de la identidad del grupo modificador de la fluorescencia, la emisión de fluorescencia puede sufrir una serie de alteraciones, que incluyen, pero sin limitación, atenuación, desactivación completa, mejora, un cambio en la longitud de onda, un cambio de polaridad, un cambio en la duración de la fluorescencia. Un ejemplo de un grupo modificador de la fluorescencia es un grupo de desactivación.

Como se utiliza en el presente documento, la "transferencia de energía" se refiere al proceso por el cual un grupo modificador de la fluorescencia altera la emisión de fluorescencia de un grupo fluorescente. Si el grupo modificador de la fluorescencia es un grupo de desactivación, entonces la emisión de fluorescencia del grupo fluorescente se atenúa (se desactiva). La transferencia de energía puede ocurrir a través de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, o a través de la transferencia directa de energía. Los mecanismos exactos de transferencia de energía en estos dos casos son diferentes. Debe entenderse que cualquier referencia a la transferencia de energía en la presente solicitud abarca todos estos fenómenos distintos en cuanto al mecanismo. La transferencia de energía también se denomina en el presente documento como transferencia de energía fluorescente o FET (del inglésfluorescent energy transfer).

Como se utiliza en el presente documento, "par de transferencia de energía" se refiere a dos moléculas cualquiera que participan en la transferencia de energía. Normalmente, una de las moléculas actúa como un grupo fluorescente, y la otra actúa como un grupo modificador de la fluorescencia. Tales pares pueden comprender, por ejemplo, dos grupos fluorescentes que pueden ser diferentes entre sí y un grupo de desactivación, dos grupos de desactivación y un grupo fluorescente, o múltiples grupos fluorescentes y múltiples grupos de desactivación. En los casos en que hay múltiples grupos fluorescentes y/o múltiples grupos de desactivación, los grupos individuales fluorescentes y/o desactivadores pueden ser diferentes entre sí. Los pares de transferencia de energía preferentes de la divulgación comprenden un grupo fluorescente y un grupo de desactivación. En algunos casos, la distinción entre el grupo fluorescente y el grupo modificador de fluorescencia puede ser confusa. Por ejemplo, en determinadas circunstancias, dos grupos de fluoresceína adyacentes pueden desactivar la emisión de fluorescencia del otro a través de la transferencia directa de energía. Por este motivo, en esta solicitud no hay ninguna limitación en la identidad de los miembros individuales del par de transferencia de energía. Todo lo que se requiere es que, si la distancia entre los miembros individuales se altera en alguna cantidad crítica, las propiedades espectroscópicas del par de transferencia de energía en su conjunto cambien de alguna manera medible.

Como se utiliza en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que puede producirse la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico. Por tanto, un oligonucleótido capaz de actuar como cebador puede tener normalmente un grupo 3' OH.

Como se utiliza en el presente documento, por "grupo de desactivación" se entiende cualquier grupo modificador de la fluorescencia que pueda atenuar, al menos parcialmente, la luz emitida por un grupo fluorescente. Se denomina a esta atenuación como "desactivación". Por consiguiente, la iluminación del grupo fluorescente en presencia del grupo de desactivación conduce a una señal de emisión menos intensa de lo esperado, o incluso completamente ausente. La desactivación ocurre a través de la transferencia de energía entre el grupo fluorescente y el grupo de desactivación.

Como se utiliza en el presente documento, "transferencia de energía por resonancia de fluorescencia" o "FRET" se refiere a un fenómeno de transferencia de energía en el que la luz emitida por el grupo fluorescente excitado es absorbida, al menos parcialmente, por un grupo modificador de la fluorescencia. Si el grupo modificador de la fluorescencia es un grupo de desactivación, entonces ese grupo puede o bien irradiar la luz absorbida como luz de una longitud de onda diferente, o puede disiparla como calor. La FRET depende de una superposición entre el espectro de emisión del grupo fluorescente y el espectro de absorción del grupo de desactivación. La FRET también depende de la distancia entre el grupo de desactivación y el grupo fluorescente. Por encima de una cierta distancia crítica, el grupo de desactivación es incapaz de absorber la luz emitida por el grupo fluorescente, o sólo puede hacerlo de manera pobre.

Como se utiliza en el presente documento, "cebador con cola" se refiere a un oligonucleótido que contiene al menos dos dominios, uno específico para el ácido nucleico diana, p. ej., ADN, de interés, es decir, capaz de hibridar con dicho ácido nucleico diana, y la otra secuencia (normalmente en 5' de la secuencia específica de diana), que sirve como molde para la producción del producto de extensión que comprende el complemento de la secuencia "marcador". El complemento de la secuencia "marcador" puede entonces unirse a, por ejemplo, la parte "marcador" del correspondiente oligonucleótido del casete marcado fluorescente (que puede carecer de cualquier otra secuencia que no sea la parte "marcador"). Los cebadores marcados también pueden comprender regiones adicionales tales como un enlazador entre los dos dominios mencionados anteriormente y/o marcadores.

En el presente documento, la "transferencia directa de energía" se refiere a un mecanismo de transferencia de energía en el que no se produce el paso de un fotón entre el grupo fluorescente y el grupo que modifica la fluorescencia. Sin estar ligado a un solo mecanismo, se cree que en la transferencia directa de energía, el grupo fluorescente y el grupo modificador de la fluorescencia interfieren en la estructura electrónica del otro. Si el grupo modificador de la fluorescencia es un grupo de desactivación, esto hará que el grupo de desactivación impida que el grupo fluorescente emita luz.

En general, la desactivación por transferencia directa de energía es más eficaz que la desactivación por FRET. De hecho, algunos grupos de desactivación que no desactivan grupos fluorescentes concretos por FRET (porque no tienen la superposición espectral necesaria con el grupo fluorescente) pueden hacerlo de manera eficaz por transferencia directa de energía. Por otra parte, algunos grupos fluorescentes pueden actuar como grupos de desactivación por ellos mismos si están lo suficientemente cerca de otros grupos fluorescentes como para provocar una transferencia directa de energía. Por ejemplo, en estas condiciones, dos grupos de fluoresceína adyacentes pueden desactivar la fluorescencia del otro de forma eficaz. Por estas razones, no hay ninguna limitación en la naturaleza de los grupos fluorescentes y los grupos de desactivación útiles para la práctica de esta invención.

Cuando se hace referencia a la "hibridación" o a la capacidad de un oligonucleótido y/o cebador para "hibridar" con otra secuencia de nucleótidos, el experto entenderá que dicha hibridación es capaz de ocurrir en las condiciones predominantes en la reacción de amplificación de polinucleótidos en la que se utiliza el oligonucleótido y/o el cebador.

Kits

La invención también proporciona un kit adecuado para su uso en un método para la detección de uno o más productos de amplificación de polinucleótidos, comprendiendo el kit:

i) un primer cebador oligonucleotídico (cebador directo) que comprende una parte en 5' cadena arriba específica de la diana o de autohibridación, una parte específica del casete de fluorescencia y una parte en 3' cadena abajo específica de la diana; y

ii) uno o más cebadores oligonucleotídicos específicos de la diana;

b) uno o más conjuntos de oligonucleótidos del casete, cada conjunto caracterizado por que:

en donde los oligonucleótidos del casete de cada conjunto se hibridan entre sí para formar un par desactivado fluorescente.

ii) uno o más cebadores oligonucleotídicos específicos de la diana;

en donde los oligonucleótidos del casete de cada conjunto se hibridan entre sí para formar un par desactivado fluorescente; y

c) una polimerasa de desplazamiento de cadenas.

En cualquiera de los kits, los primeros cebadores oligonucleotídicos pueden estar normalmente sin marcar. El oligonucleótido del casete marcado fluorescente no suele comprender una secuencia específica de diana.

Otras preferencias para los oligonucleótidos son las indicadas anteriormente.

Los kits de acuerdo con la divulgación también pueden contener otros componentes adecuados para su uso en una reacción de amplificación de polinucleótidos tales como cationes divalentes, por ejemplo, procedentes de sales de magnesio, desoxirribonucleótidos 5' trifosfatos (dNTP), agentes tamponantes, etc.

El kit puede comprender el uno o más conjuntos de casetes de oligonucleótidos en un primer recipiente, en donde, opcionalmente, el primer recipiente comprende otros componentes para realizar una reacción de amplificación de polinucleótidos, tales como un tampón, la polimerasa de desplazamiento de cadena y en donde, opcionalmente, los primeros oligonucleótidos del casete no comprenden una parte específica de la diana; y uno o más grupos de cebadores oligonucleotídicos en un recipiente o recipientes separados adicionales.

Detección indirecta (en tiempo real) de productos de amplificación de polinucleótidos

Esta realización utiliza cebadores oligonucleotídicos no marcados para iniciar una reacción LAMP. El cebador FIP o BIP se modifica mediante la introducción de una secuencia de ADN "marcador" entre las secuencias específicas de la diana en 5' cadena arriba y en 3' aguas abajo, y se utiliza junto con los otros cinco cebadores LAMP, como se ilustra en la figura 1. La reacción también incluye un oligonucleótido de cadena sencilla marcado con fluorescencia que es capaz de hibridar con el complemento de la región de la secuencia marcador del cebador FIP o BIP modificado generado en la reacción. Existen varios fluoróforos adecuados, siendo el FAM una elección popular (un derivado de fluoresceína). Por último, la reacción incluye un oligonucleótido marcado en 3' con un desactivador en antisentido con respecto al oligonucleótido marcado con FAM. Existen varios marcadores adecuados, de los cuales, las series de marcadores desactivadores Black Hole son una elección popular.

Como la longitud del oligonucleótido desactivador es lo suficientemente larga como para dar una Tm superior a la Ta de la reacción, la generación del producto se puede evaluar en tiempo real (por ejemplo, con un instrumento Roche LC480 o ABI 7900 Prism).

Debido a la complementariedad de los dos oligonucleótidos marcados, se hibridan entre sí. Esta hibridación lleva el marcador desactivador muy cerca del fluoróforo, de manera que reproduce toda la señal fluorescente del fluoróforo. Se inicia el proceso de amplificación de polinucleótidos y comienza a generarse el producto de amplificación. Después de las primeras rondas de amplificación, se genera la secuencia complementaria al oligonucleótido marcado. El oligonucleótido fluorescente es entonces capaz de iniciar la síntesis durante la reacción de amplificación del polinucleótido, y lo hace. No es esencial que el oligonucleótido fluorescente sea capaz de actuar como cebador, pero se considera que se puede generar más producto si el oligonucleótido fluorescente actúa como cebador, lo que puede proporcionar una mejor señal. Esto produce un amplicón que contiene una molécula fluorescente. Una vez que esto ocurre, el oligonucleótido de desactivación es menos capaz de hibridarse con el oligonucleótido marcado fluorescente, dado que el proceso de amplificación produce un amplicón de ADN bicatenario. Como el oligonucleótido de desactivación ya no se hibrida con el oligonucleótido marcado fluorescente, entonces se genera una señal que es directamente proporcional a la cantidad de producto de amplificación generado y que puede medirse.

No es necesario que la región marcador del cebador FIP o BIP modificado sea idéntica a la del oligonucleótido único marcado con fluorescencia, siempre y cuando una secuencia complementaria de la región marcadora generada se hibride al oligonucleótido marcado con fluorescencia.

Detección indirecta (final) de productos de amplificación de polinucleótidos-Genotipado SNP

La presente realización utiliza el mismo par o pares de oligonucleótidos marcados con fluoróforo y con desactivador como se ha descrito anteriormente.

El genotipado de SNP utiliza al menos dos pares de oligonucleótidos marcados, por ejemplo 2, 3 o 4 pares, en donde cada par comprende preferentemente un fluoróforo diferente, y en los que los fluoróforos son espectralmente resolubles entre sí, por ejemplo, FAM y HEX. Los cebadores marcados (cada uno correspondiente a un grupo de cebadores oligonucleotídicos diferente, como se indicó anteriormente) están marcados con una secuencia distinta, la parte de los cebadores no marcada (generalmente denominada directa) se dirige al ADN de interés. En esta parte del cebador en 3' específica de la diana pueden diferir entre sí solo por un solo nucleótido, por ejemplo, en su base 3' terminal. Cada cebador se dirige a la base polimórfica del ADN de interés, como es bien sabido por los expertos en la materia. La extensión con cebador se lleva a cabo de modo que los cebadores solo inician la síntesis cuando se emparejan con la secuencia diana de interés, por ejemplo, cuando la base en 3' está perfectamente emparejada. Cuando se produce un emparejamiento incorrecto no se produce la síntesis.

Durante la reacción, la parte específica de la diana en 3', dependiendo del genotipo, es capaz de iniciar la síntesis (o ambas, en el caso de un heterocigoto). Esto da lugar a la incorporación de la parte marcada distintiva del cebador en el producto de amplificación de polinucleótidos de manera que impide la hibridación del oligonucleótido desactivador con el correspondiente oligonucleótido fluorescente. Por lo tanto, se genera una señal de acuerdo con la de los oligonucleótidos específicos de alelo que iniciaron la síntesis. Los productos de amplificación que incorporan uno o más de los fluoróforos pueden leerse entonces en un lector de placas fluorescentes. Los datos resultantes pueden representarse entonces y se genera un gráfico de agrupación de un fluoróforo sobre el otro. Los genotipos resultantes pueden determinarse entonces en base a los gráficos de agrupación.

En la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está comprendido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse de forma independiente en los intervalos, y también están comprendidos dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención intervalos que excluyen alguno de los límites incluidos o ambos.

La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos, sin limitación alguna a los mismos.Ejemplo 1: Genotipado de SNP mitocondrial en una reacción LAMP

Como el ADN mitocondrial es homocigoto, las muestras individuales poseen solo un alelo de un SNP, lo que permite la detección de productos de amplificación específicos de alelos individuales en una reacción múltiple. Se utilizó un ensayo de genotipado de SNP mitocondrial (ADNmt humano 11719) para demostrar la viabilidad para la detección universal mediante un ensayo LAMP.

El ADN mitocondrial se extrajo de sangre humana y la parte diana en cuestión tiene la siguiente secuencia de ADN, en el que el SNP se muestra en negrita:

ACAAAACAC ATAGCCT ACCCCTT CCTT GTACT AT CCCTAT GAGGCAT AATT ATAACAA

GCTCCAT CT GCCTACGACAAAC AGACCTAAAATCGCT CATT GCAT ACT CTT CAAT CA

GCC ACATAGCCCTCGT AGT AACAGCCATT CT CATCCAAACCCCCT GAAGCTT CACC

GGCGCAGTCATTCTCATAATCGCCCACGG[A/G]CTTACATCCTCATTACTATTCTGC

CTAGC AAACT C AAAGT ACG AAG G C ACT C AC AGT GGCAT C ATAAT CCTCTCTCAAGGA

CTTCAAACTCTACTCCCACTAATAGCTTTTTGATGACTTCTAGCAAGCCTCGCTAACC

TCGCCTTACCCCCCACTATTAACCTACTGGGAGAAGTCTCTGTGCTAGTAACCACGT

TCTC

Los cebadores LAMP inversos (BIP) BIPKASP AI1 y BIPKASP AI2 se diseñaron para incorporar una secuencia marcadora universal idéntica a una parte de una secuencia de oligonucleótidos del casete marcada con FAM (fluoresceína) o HEX, respectivamente, y para incluir un nucleótido en 3' correspondiente al alelo que se va a detectar. Los cebadores LAMP se muestran en la siguiente tabla, con las secuencias marcadoras subrayadas y la secuencia de SNP mostrada en negrita.

Los cebadores se combinaron en una mezcla a granel de la siguiente manera:

Tabla 2: Mezcla a granel preparada para producir un volumen de reacción de 250 ^l de oligonucleótidos LAMP.

continuación

Las secuencias de oligonucleótidos del casete se muestran a continuación:

Tabla 3: Secuencias de oli onucleótidos del casete.

Se hizo una mezcla de casetes de 20* de la siguiente manera:

Tabla 4: Mezcla de casetes.

Se adquirió la mezcla maestra isotérmica, que comprende ADN polimerasa de desplazamiento de cadena, pirofosfatasa inorgánica, tampón de reacción, MgSO4 y dNTPS (OptiGene Ltd, Reino Unido, n.° de cat. ISO-001 nd) y los reactivos se combinaron (por reacción) de la siguiente manera:

Tabla 5: Mezcla de reacción.

La amplificación se realizó en reacciones de 25 pl en una placa blanca de 96 pocillos en un instrumento Roche Light Cycler 480. La amplificación se realizó a 65 °C durante 90 minutos con detección fluorescente cada minuto (un ciclo). Después de la incubación de 90 minutos, la reacción se enfrió a 37 °C y se realizó una lectura fluorescente final. Los datos de amplificación en tiempo real se muestran en la figura 2A (detección FAM) y 2B (detección HEX). Estos datos demuestran que la amplificación se puede completar en veinte minutos. El análisis final en la figura 2C muestra que los grupos agrupados de productos fluorescentes FAM o HEX se distinguen incluso después de noventa minutos, reflejando la presencia de los diferentes alelos del SNP de ADNmt11719 en las diferentes muestras.

Ejemplo 2: Reacción LAMP adicional para el genotipado de SNP mitocondrial

El ensayo de genotipado de SNP mitocondrial del ejemplo 1 se repitió usando una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena diferente.

Los cebadores, como se describe en el ejemplo 1, se combinaron en una mezcla de cebadores a granel de la siguiente manera:

T l : M z l r r n l.

continuación

Se preparó una mezcla de casetes 20* usando las secuencias de oligonucleótidos de casetes descritas en el ejemplo 1 de la siguiente manera:

Tabla 7: Mezcla de casetes.

La mezcla maestra isotérmica se preparó como en la tabla 8 usando la ADN polimerasaBst3.0 (N.° de cat. NEB M0374) y los reactivos adjuntos se adquirieron en New England Biolabs. El tampón de amplificación isotérmico II (N.° de cat. NEB B0374S) después de la dilución a 1*, como en la mezcla de reacción final, proporciona Tris-HCl 20 mM, (NH4)2SO410 mM, KCl 150 mM, MgSO42 mM, Tween®20 al 0,1 %, (pH 8,8 @ 25 °C). El MgSO4 adicional incluido en la mezcla maestra aportó la concentración final de MgSO4 a 4 mM, que fue la concentración óptima para la reacción. Un intervalo preferido para la concentración final de MgSO4 es de 3,5 mM a 5,5 mM.

T l : M z l m r i rmi r 2 r i n .

Los reactivos se combinaron (por 25 pl de reacción) de la siguiente manera:

Tabla 9: Mezcla de reacción.

La amplificación se realizó como en el ejemplo 1 y en las Figuras 3A a C se muestran resultados representativos de varios experimentos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la detección de uno o más productos de amplificación de polinucleótidos, comprendiendo el método las etapas de:

a) proporcionar uno o más grupos de cebadores oligonucleotídicos, comprendiendo cada grupo uno o más conjuntos de cebadores oligonucleotídicos, cada conjuntocaracterizado por que:

ii) uno o más cebadores oligonucleotídicos específicos de la diana;

b) proporcionar uno o más conjuntos de oligonucleótidos del casete, cada conjuntocaracterizado por que:

d) detectar la señal que se genera.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el primer cebador oligonucleotídico (cebador directo) tiene una parte en 5' cadena arriba específica de la diana o de autohibridación con respecto a la parte específica del casete de fluorescencia.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el primer cebador oligonucleotídico (cebador directo) tiene una parte en 5' cadena arriba específica de la diana con respecto a la parte específica del casete de fluorescencia, tal como en donde la reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica es una amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación de cebado cruzado (CPA) o amplificación inteligente (SMAP).

4. El método de la reivindicación 2, en donde el primer cebador oligonucleotídico (cebador directo) tiene una parte de autohibridación en 5' cadena arriba con respecto a la parte específica del casete de fluorescencia, tal como en donde la reacción de amplificación isotérmica de polinucleótidos es amplificación inteligente (SMAP).

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer y segundo oligonucleótidos del casete de cada conjunto no comprenden una parte específica de la diana.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la Tm (Tm A) del par o pares desactivados fluorescentes está dentro de (±) 20 °C, tal como dentro de (±) 10 °C de la Ta de la reacción de amplificación; opcionalmente

en donde la Tm (Tm A) del par o pares desactivados fluorescentes está por encima de la Ta de la reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica, tal como hasta 15 °C, hasta 10 °C, o entre 1 y 10 °C por encima de la Ta de la reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde uno del primer o segundo casetes de oligonucleótidos de cada conjunto tiene una Tm que está en o por debajo de la Ta de la reacción de amplificación de polinucleótidos isotérmica.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la señal se detecta al final de la reacción.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la señal se detecta en tiempo real.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos una de las bases de al menos uno de los oligonucleótidos, por ejemplo, al menos uno de los oligonucleótidos del casete, opcionalmente el oligonucleótido del casete marcado fluorescente, es un fosforotioato; opcionalmente

en donde del 20 al 80 % de las bases de al menos uno de los oligonucleótidos, por ejemplo, al menos uno de los oligonucleótidos del casete, opcionalmente el oligonucleótido del casete marcado fluorescente, son fosforotioatos.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde hay al menos 2 y opcionalmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 grupos de cebadores oligonucleotídicos y los correspondientes conjuntos de oligonucleótidos de casete.

12. Un kit adecuado para su uso en un método para la detección de uno o más productos de amplificación de polinucleótidos, comprendiendo el kit:

a) uno o más grupos de cebadores oligonucleotídicos, comprendiendo cada grupo uno o más conjuntos de cebadores oligonucleotídicos, cada conjuntocaracterizado por que:

ii) uno o más cebadores oligonucleotídicos específicos de la diana;

b) uno o más conjuntos de oligonucleótidos del casete, cada conjuntocaracterizado por que:

13. Un kit adecuado para su uso en un método para la detección de uno o más productos de amplificación de polinucleótidos, comprendiendo el kit:

ii) uno o más cebadores oligonucleotídicos específicos de la diana;

c) una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el genotipado de SNP específico de alelo, detección de mutaciones somáticas, detección de patógenos, estudios de expresión genética o estudios de variación del número de copias.