ES2841624T3 - Mejoras en o relacionadas con procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos - Google Patents

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Abstract

Un método para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico no isotérmica, comprendiendo el método las etapas de: (a) mezclar una secuencia diana con uno o más cebadores monocatenarios complementarios en condiciones que permitan un suceso de hibridación en el que los cebadores se hibridan con la diana, cuyo suceso de hibridación, directa o indirectamente, conduce a la formación de una estructura dúplex que comprende dos sitios de mella en o cerca de los extremos opuestos del dúplex; y llevar a cabo un procedimiento de amplificación al; (b) producir una mella en cada uno de dichos sitios de mella en las cadenas del dúplex; (c) usar una polimerasa para extender las cadenas melladas para así formar ácido nucleico recién sintetizado, cuya extensión con la polimerasa recrea los sitios de mella; (d) repetir las etapas (b) y (c) según se desee para causar la producción de múltiples copias del ácido nucleico recién sintetizado; caracterizado por que la temperatura a la que se lleva a cabo el método no es isotérmica, y se somete a una reducción de al menos 2ºC durante el procedimiento de amplificación de las etapas (b)-(d), y en donde la temperatura de la reacción no vuelve a una temperatura predeterminada.

Description

DESCRIPCIÓN
Mejoras en o relacionadas con procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para amplificar un ácido nucleico y a un aparato para llevar a cabo el método.
Antecedentes de la invención
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue el primer método in vitro ampliamente usado para la amplificación de ADN. Aunque es extremadamente potente, la técnica requiere el uso de un aparato de ciclos térmicos para someter la mezcla de reacción a cambios de temperatura periódicos con el fin de realizar la amplificación. Por consiguiente, la PCR no es especialmente adecuada para usar fuera de un contexto de laboratorio, por ejemplo, en el contexto de un dispositivo de diagnóstico en el lugar de asistencia ("PoC" por sus siglas en inglés Point-of-care).
En parte para superar esta desventaja, se idearon numerosas técnicas de amplificación isotérmica diferentes, que evitaban la necesidad de ciclos térmicos. Dichas técnicas incluyen, por ejemplo: amplificación mediada por señales de tecnología de ARN ("SMART"; documento WO 99/037805); amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos ("NASBA" Compton 1991 Nature 350, 91-92); amplificación por círculo rodante ("RCA", p. ej., véase Lizardi et al., 1998 Nature Genetics 19, 225-232); amplificación mediada por bucle ("LAMP", véase Notomi et al., 2000 Nucl. Acids Res. 28, (12) e63); amplificación de la polimerasa recombinasa ("RPA", véase Piepenberg et al., 2006 PLoS Biology 4 (7) e204); amplificación por desplazamiento de cadena ("SDA"); amplificación dependiente de helicasa ("HDA" Vincent et al., 2004 EMBO Rep. 5, 795-800): amplificación mediada por transcripción ("TMA"), amplificación isotérmica de cebador único ("SPIA" véase Kurn et al., 2005 Clinical Chemistry 51, 1973-81); replicación de secuencia autosostenida ("3SR"); y reacción de amplificación con enzimas de mellado ("NEAR").
La SDA es una técnica (descrita por Walker et al., 1992 Nucl. Acids Res. 20, 1691 -1696) que implica el uso de un par de cebadores cortos "amortiguadores" (bumper) en la dirección 5' de un par de cebadores que comprenden una porción complementaria de la diana y, 5' de la porción complementaria de la diana, un sitio de reconocimiento y de corte para una endonucleasa. Los cebadores "amortiguadores" ayudan a iniciar la reacción de SDA generando una diana complementaria monocatenaria para la amplificación del cebador. Los cebadores se hibridan con las respectivas moléculas diana monocatenarias complementarias. El extremo 3' de las cadenas diana se extiende usando una mezcla de reacción que incluye una ADN polimerasa y al menos un trifosfato de nucleótido modificado, usando el cebador como molde (y de la misma manera, los extremos 3' de los cebadores se extienden usando la diana como molde).
La extensión de las cadenas diana genera un sitio de reconocimiento bicatenario para la endonucleasa. Sin embargo, debido a que la diana se extiende usando un trifosfato modificado, la endonucleasa no escinde ambas cadenas, sino que crea una mella de una sola cadena en el cebador. Los extremos 3' en las mellas después se extienden mediante la ADN polimerasa (típicamente el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, que carece de actividad de exonucleasa). A medida que los cebadores con mella se extienden, desplazan el producto de extensión producido inicialmente. El producto desplazado queda entonces libre para hibridar con el cebador opuesto, ya que esencialmente replica la secuencia de la diana para el cebador opuesto. De esta forma, se consigue una amplificación exponencial de ambas cadenas de la secuencia diana.
La etapa de amplificación del procedimiento de SDA es esencialmente isotérmica, típicamente realizada a 37°C, la temperatura óptima para la endonucleasa y la polimerasa. Sin embargo, antes de alcanzar la etapa de amplificación, es necesario disociar completamente la diana bicatenaria en sus cadenas simples constituyentes, con el fin de permitir que el par de cebadores se hibride con sus cadenas diana complementarias.
Esta disociación o "fusión" se logra normalmente calentando la diana bicatenaria a una temperatura alta, normalmente aproximadamente 90°C, para romper los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas de la diana. La mezcla de reacción después se enfría para permitir la adición de las enzimas que son necesarias para la reacción de amplificación. Debido a la alta temperatura usada para generar las dianas monocatenarias, la técnica de SDA no es ideal para un contexto de PoC.
El documento US 6.191.267 describe la clonación y expresión de la enzima de mellado N.BstNBI y su uso en la SDA, en lugar de endonucleasas de restricción y trifosfatos modificados.
Otra técnica de amplificación, que es similar a la SDA, es la reacción de amplificación con enzimas de mellado (o "NEAR").
En "NEAR" (p. ej., como se describe en los documentos US2009/0017453 y EP 2.181.196), los cebadores directos e inversos (a los que se denomina en los documentos US 2009/0017453 y EP 2.181.196 "moldes") se hibridan con las cadenas respectivas de una diana bicatenaria y se extienden. Copias adicionales de los cebadores directos e inversos (presentes en exceso) se hibridan con el producto de extensión del cebador opuesto y se extienden ellos mismos, creando un "dúplex de amplificación". Cada dúplex de amplificación así formado comprende un sitio de mella hacia el extremo 5' de cada cadena, que es mellado por una enzima de mellado, permitiendo la síntesis de productos de extensión adicionales. Mientras tanto, los productos de extensión sintetizados previamente se pueden hibridar con copias adicionales de los cebadores complementarios, lo que hace que los cebadores se extiendan y de ese modo se creen copias adicionales del "dúplex de amplificación". De esta forma, se puede lograr la amplificación exponencial. El documento US 2009/0017453 enseña explícitamente que la técnica de amplificación isotérmica descrita en el mismo se realiza "a una temperatura constante".
NEAR difiere de SDA, en particular, en que no se requieren cebadores "amortiguadores" ni una etapa de disociación térmica inicial. El suceso inicial de hibridación de cebador/diana necesario para desencadenar el procedimiento de amplificación tiene lugar mientras la diana todavía es sustancialmente bicatenaria: se cree que la hibridación inicial de cebador/diana aprovecha la disociación localizada de las cadenas diana, un fenómeno conocido como "respiración" (véase Alexandrov et al., 2012 Nucl. Acids Res. y revisión de Von Hippel et al., 2013 Biopolymers 99 (12), 923-954). La respiración es el aflojamiento localizado y transitorio del emparejamiento de bases entre las cadenas de ADN. La temperatura de fusión (Tm) del heterodúplex inicial de cebador/diana es típicamente mucho más baja que la temperatura de reacción, por lo que la tendencia es que el cebador se disocie, pero la hibridación transitoria dura lo suficiente para que la polimerasa extienda el cebador, lo que aumenta la Tm del heterodúplex y lo estabiliza.
La etapa de amplificación en NEAR se realiza de forma isotérmica, a una temperatura constante. De hecho, es convencional realizar tanto la hibridación inicial de diana/cebador, como las rondas de amplificación posteriores, a la misma temperatura constante, normalmente en el intervalo de 54 a 562C.
Evitar la necesidad de ciclos térmicos significa que las técnicas isotérmicas son potencialmente más útiles que la PCR en contextos de PoC. Además, se puede lograr la síntesis de cantidades significativas de producto de amplificación, incluso cuando se empieza con un número muy pequeño de copias de moléculas diana (p. ej., tan pocas como 10 moléculas diana bicatenarias).
El documento WO 2011/030145 (Enigma Diagnostics Limited) describe una reacción de amplificación de ácido nucleico "isotérmica" realizada en condiciones de oscilación de temperatura, en la que una reacción se realiza inicialmente a una temperatura predeterminada, se permite que la temperatura se desvíe hacia arriba o hacia abajo de la temperatura predeterminada, y después se hace que la temperatura vuelva a la temperatura predeterminada al menos una vez durante la reacción de amplificación. Más típicamente, se permite que la temperatura "oscile" en una pequeña cantidad (aproximadamente 5°C) hacia arriba y hacia abajo de la temperatura predeterminada.
La presente invención tiene como objetivo proporcionar, entre otras cosas, una técnica de amplificación de ácidos nucleicos mejorada que tiene una o más ventajas frente a las técnicas existentes que incluyen, por ejemplo, menor tiempo de reacción y/o mayor rendimiento y/o menos productos de amplificación no específicos.
Resumen de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona un método para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico no isotérmica, comprendiendo el método las etapas de:
(a) mezclar una secuencia diana con uno o más cebadores monocatenarios complementarios en condiciones que permitan un suceso de hibridación en el que los cebadores se hibridan con la diana, cuyo suceso de hibridación, directa o indirectamente, conduce a la formación de una estructura dúplex que comprende dos sitios de mella dispuestos en o cerca de los extremos opuestos del dúplex; y llevar a cabo un procedimiento de amplificación al;
(b) producir una mella en cada uno de dichos sitios de mella en las cadenas de los dúplex;
(c) usar una polimerasa para extender las cadenas melladas para así formar ácido nucleico recién sintetizado, cuya extensión con la polimerasa recrea dichos sitios de mella;
(d) repetir las etapas (b) y (c) según se desee para producir la producción de múltiples copias del ácido nucleico recién sintetizado;
caracterizado por que la temperatura a la que se lleva a cabo el método no es isotérmica, y se somete a una reducción de al menos 2°C, preferiblemente al menos 5°C, durante el procedimiento de amplificación de las etapas (b)-(d); y en donde la temperatura de la reacción no vuelve a una temperatura predeterminada.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un aparato para llevar a cabo el método del primer aspecto de la invención, comprendiendo el aparato medio de regulación de la temperatura y medio de control programable, estando programado el medios de control programable para hacer funcionar el medio de regulación de temperatura para realizar una reducción de temperatura de al menos 2°C, preferiblemente al menos 5°C, durante el procedimiento de amplificación de una mezcla de reacción usada para llevar a cabo el método del primer aspecto, y en donde el medio de regulación de temperatura está programado para no volver a una temperatura predeterminada durante el procedimiento de amplificación.
El procedimiento de amplificación del método de la invención se puede aplicar a técnicas de amplificación generalmente conocidas y convencionales que incluyen SDA y NEAR.
Así, por ejemplo, el procedimiento de amplificación se puede basar en el procedimiento de amplificación empleado en la amplificación por desplazamiento de cadena, o basar en el usado en NEAR o de hecho en cualquier otro procedimiento de amplificación de ácido nucleico que se base en la creación de una mella en una sola cadena y la posterior extensión del extremo 3' de la cadena mellada. Por consiguiente, las enseñanzas de la técnica anterior en relación con las etapas de amplificación de SDA o NEAR serán, en general, igualmente aplicables al procedimiento de amplificación del método de la presente invención (aparte de las enseñanzas de la técnica anterior en relación con el mantenimiento de temperatura constante durante la amplificación).
Preferiblemente, la etapa (a) comprende mezclar una muestra que contiene una diana bicatenaria con dos cebadores de una sola cadena, siendo uno de dichos cebadores complementario de una primera cadena de la diana, y el otro de dichos cebadores complementario de una segunda cadena de la diana, de modo que los dos cebadores se hibridan con la diana y los extremos 3' libres de dichos cebadores se enfrentan entre sí.
Los dos cebadores pueden describirse convenientemente como cebadores "directo" e "inverso".
De manera deseable, los cebadores tanto directo como inverso comprenderán la secuencia de un sitio de reconocimiento de la enzima de mellado. Típicamente, la mella creada por una enzima de mellado estará justo fuera y típicamente en 3' del sitio de reconocimiento de la enzima de mellado.
En una realización preferida, el cebador directo comprenderá una porción en o cerca de su extremo 3' que es complementaria y se puede hibridar con el extremo 3' de la cadena de sentido contrario de la secuencia diana, mientras que el cebador inverso comprende una porción en o cerca de su extremo 3' que es complementaria y se puede hibridar con el extremo 3' de la cadena del mismo sentido de la secuencia diana.
De esta manera, se introduce un sitio de reconocimiento de la enzima de mellado en los extremos opuestos de la secuencia diana, y la amplificación de la secuencia diana (junto con cualquier secuencia intermedia de los cebadores en la dirección 3' del sitio de mella) se logra realizando múltiples ciclos de extensión de polimerasa de los cebadores directos e inversos para formar así un sitio de mella de doble cadena, y por el mellado de los sitios de mella con una enzima de mellado, permite una mayor extensión de los cebadores mellados por una polimerasa, etc., esencialmente como se describe en, por ejemplo, el documento US 2009/0017453.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere, entre otros, a un método para la amplificación de un ácido nucleico diana seleccionado.
La diana puede ser monocatenaria, bicatenaria o comprender una mezcla de los dos. La diana puede comprender ARN, ADN o una mezcla de los dos. En particular, la diana podría incorporar uno o más trifosfatos de nucleótidos modificados (es decir, un trifosfato de nucleótido que no se encuentra normalmente en los ácidos nucleicos de origen natural), aunque esto no es esencial y de hecho no es preferido.
La diana se puede seleccionar de la siguiente lista no exhaustiva: ácido nucleico genómico (término que abarca el ácido nucleico genómico de cualquier animal, planta, hongo, bacteria o virus), ADN plasmídico, ADN mitocondrial, ADNc, ARNm, ARNr, ARNt, o un oligonucleótido sintético u otra molécula de ácido nucleico.
En particular, el método puede comprender adicionalmente un etapa de transcripción inversa inicial. Por ejemplo, se puede usar ARN (p. ej., ARN genómico viral, o ARNm celular, o ARN de alguna otra fuente) para sintetizar ADN o ADNc usando una transcriptasa inversa por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Después, el ADN se puede usar como una secuencia diana en el método de la invención. El ARN original se degradará típicamente por la actividad de ribonucleasa de la transcriptasa inversa, pero si se desea, se puede añadir ARNasa H adicional después de que se haya completado la transcripción inversa. Las moléculas de ARN a menudo están presentes en muestras con un número de copias mayor que las secuencias de ADN correspondientes (p. ej., genómicas), por lo que puede ser conveniente hacer transcripciones de ADN a partir de la molécula de ARN con el fin de aumentar de manera efectiva el número de copias de la secuencia de ADN.
La "secuencia diana" es la secuencia de bases en el ácido nucleico diana, y puede referirse a la cadena homosentido y/o de sentido contrario de una diana bicatenaria, y también abarca, salvo que el contexto indique lo contrario, la misma secuencia de bases que se reproduce o replica en copias amplificadas, productos de extensión o productos de amplificación del ácido nucleico diana inicial.
La secuencia diana puede estar presente en cualquier tipo de muestra, p. ej. biológica o medioambiental (agua, aire, etc.). Una muestra biológica puede ser, por ejemplo, una muestra de alimento o una muestra clínica. Las muestras clínicas pueden incluir las siguientes: orina, saliva, sangre, suero, plasma, moco, esputo, líquido lagrimal o heces.
La muestra se puede o no someter a procesamiento antes de poner en contacto con los cebadores. Dicho procesamiento puede incluir uno o más de: filtración, concentración, purificación parcial, sonicación, lisis y similares. Dichos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
El método de la presente invención implica el uso de un sitio de mella y medios para crear una mella en el sitio de mella. Una "mella" es la escisión de la cadena principal de fosfodiéster de solamente una cadena de una molécula de ácido nucleico de doble cadena completa, o al menos parcialmente. El sitio de mella es la ubicación en la molécula donde se hace una mella.
En realizaciones preferidas, estará presente un "sitio de reconocimiento de mella" en, dentro o cerca de un sitio de mella. ("Cerca de" en este contexto significa que la base más cercana del sitio de reconocimiento de mella está en el espacio de 10 bases del sitio de mella, preferiblemente en el espacio de 5 bases del sitio de mella).
El sitio de reconocimiento de mella puede comprender al menos una cadena del sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restricción, y el sitio de mella puede comprender al menos una cadena de una secuencia de bases de ácido nucleico que, cuando está presente como una molécula bicatenaria, es cortada por una endonucleasa de restricción. Típicamente, una endonucleasa de restricción cortará ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico bicatenario. En la presente invención, se puede evitar una rotura de la doble cadena por la incorporación de una o más bases modificadas en o cerca del sitio de mella, cuyas bases modificadas hacen que una cadena de ácido nucleico no sea susceptible de escisión por la endonucleasa de restricción. De esta manera, se puede usar una endonucleasa de restricción, que normalmente corta ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico bicatenario, para introducir una mella en una sola cadena en una molécula de doble cadena. Las bases modificadas y similares adecuadas para lograr esto son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, todos los trifosfatos de nucleósidos modificados con alfa fosfato y trifosfatos de nucleósidos modificados con alfa borano, específicamente; 2'-desoxiadenosina 5'-O-(tiotrifosfato), 5-metildesoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-desoxiuridina 5'-trifosfato, 7-desaza-2'-desoxiguanosina 5'-trifosfato, 2'-desoxiguanosina-5'-O-(1-boranotrifosfato) y otros. Los trifosfatos que incluyen la base modificada pueden estar presentes dentro de una mezcla de reacción usada para llevar a cabo el procedimiento de amplificación, de modo que se incorporan bases modificadas en posiciones relevantes durante las rondas posteriores de amplificación para prevenir la formación de un sitio escindible por la endonucleasa.
Sin embargo, en realizaciones preferidas, la mella se hace en el sitio de mella por medio de una enzima de mellado. Estas son enzimas que, en circunstancias normales, producen la rotura de una sola cadena en una molécula de ácido nucleico bicatenario. La enzima de mellado tiene un sitio de reconocimiento de mella y el sitio de mella puede estar dentro del sitio de reconocimiento de mella o puede estar en 5' o 3' del sitio de reconocimiento. Los expertos en la técnica conocen muchas enzimas de mellado y están disponibles en el mercado. Una lista no exhaustiva de ejemplos de enzimas de mellado incluye: Nb.Bsml, Nb.Bts, Nt.Alwl, Nt.BbvC, Nt.BstNBI y Nt.Bpu101. Esta última enzima está disponible en el mercado en ThermoFisher Scientific; las demás están disponibles en p. ej. New England Biolabs.
En realizaciones preferidas, la enzima de mellado se introduce en la mezcla de reacción al comienzo del método (p. ej., en el plazo de un minuto después de poner en contacto la muestra con cebadores y ADN polimerasa). Sin embargo, en algunos casos puede ser deseable introducir la enzima de mellado en la mezcla de reacción después de un retraso más largo (p. ej., para permitir que la temperatura baje más cerca de la temperatura óptima de la enzima de mellado).
El método de la invención implica el uso de una ADN polimerasa. Preferiblemente, el método de la invención comprende el uso de al menos una ADN polimerasa termófila (es decir, que tiene una temperatura óptima superior a 60°C). Preferiblemente, la ADN polimerasa es una polimerasa de desplazamiento de cadena. Preferiblemente, la ADN polimerasa no tiene actividad de exonucleasa. Preferiblemente, la ADN polimerasa es una polimerasa de desplazamiento de cadena sin actividad de exonucleasa, y también es preferiblemente termófila.
Ejemplos de ADN polimerasas preferidas incluyen polimerasa Bst, ADN polimerasa Vent®, polimerasa 9°N, polimerasa Manta 1.0 (Qiagen), polimerasa BstX (Qiagen) y ADN polimerasa Bsm, fragmento grande (ThermoFisher Scientific).
En algunas realizaciones, el método de la invención puede comprender convenientemente una etapa de pre­ amplificación o enriquecimiento. Esta es una etapa en la que la secuencia diana se pone en contacto con cebadores directos e inversos y ADN polimerasa, pero sin enzima de mellado. Típicamente, esto dura aproximadamente 2-5 minutos y produce una amplificación inicial (lineal) de la secuencia diana de aproximadamente 1.000 veces, lo que puede ser especialmente útil si la secuencia diana está presente en la muestra con un número de copias bajo.
En algunas realizaciones, la etapa de pre-amplificación o enriquecimiento se lleva a cabo usando una ADN polimerasa mesófila tal como la ADN polimerasa Exo-Minus Klenow o la ADN polimerasa psicrófila Exo-Minus de Cenarchaeum symbiosum, a una temperatura inferior a 50°C, y la mezcla posteriormente se calienta por encima de 50°C para desnaturalizar o inactivar la ADN polimerasa termolábil, y después se añade una ADN polimerasa termófila para la amplificación en la dirección 3'.
Típicamente, el método de la invención comprende una etapa de detección, en la que uno o más de los productos directos o indirectos del procedimiento de amplificación se detectan y opcionalmente se cuantifican, indicando esto la presencia y/o cantidad de la diana en la muestra. Hay muchas técnicas adecuadas de detección y/o cuantificación conocidas, que incluyen: electroforesis en gel, espectrometría de masas, captura de flujo lateral, incorporación de nucleótidos marcados, colorantes intercalantes, balizas moleculares y otras sondas, en especial oligonucleótidos de hibridación específica u otras moléculas que contienen ácidos nucleicos.
El producto o productos que se detectan en la etapa de detección pueden denominarse en el presente documento "diana de detección". La "diana" en relación con la etapa de detección, no es necesariamente lo mismo que la "diana" en el procedimiento de amplificación y, de hecho, las dos moléculas normalmente serán diferentes al menos en cierta medida, aunque pueden tener alguna secuencia (típicamente 10- 20 bases) en común, cuando la diana de detección comprende una molécula de ácido nucleico u oligonucleótido.
Los métodos de detección de ácidos nucleicos pueden emplear el uso de colorantes que permitan la detección específica de ADN bicatenario. Son bien conocidos los colorantes intercalantes que presentan una fluorescencia potenciada tras unirse al ADN o al ARN. Los colorantes pueden ser, por ejemplo, fluoróforos intercalantes de ADN o ARN y pueden incluir, entre otros, los siguientes: naranja de acridina, bromuro de etidio, Pico Green, yoduro de propidio, SYBR I, SYBR II, SYBR Gold, TOTO-3 (un dímero de naranja tiaxol) Oli Green y YOYO (un dímero amarillo oxazol).
Los métodos de detección de ácidos nucleicos también pueden emplear el uso de nucleótidos marcados incorporados directamente en la secuencia diana de detección o en sondas que contienen secuencias complementarias o sustancialmente complementarias de la diana de detección de interés. Los marcadores adecuados pueden ser radiactivos y/o fluorescentes y se pueden resolver de cualquiera de las formas convencionales en la técnica. Los nucleótidos marcados, que se pueden detectar, pero por lo demás funcionan como nucleótidos naturales (p. ej., son reconocidos por y pueden actuar como sustratos de enzimas naturales), deben distinguirse de los nucleótidos modificados, que no funcionan como nucleótidos naturales.
La presencia y/o cantidad de ácidos nucleicos diana y secuencias de ácidos nucleicos se puede detectar y controlar usando balizas moleculares. Las balizas moleculares son oligonucleótidos en forma de horquilla que contienen un fluoróforo en un extremo y un colorante de atenuación ("atenuador") en el extremo opuesto. El bucle de la horquilla contiene una secuencia de sonda que es complementaria o sustancialmente complementaria de una secuencia diana de detección y el tallo está formado por la reasociación de secuencias autocomplementarias o sustancialmente autocomplementarias situadas a ambos lados de la secuencia de la sonda.
El fluoróforo y el atenuador están unidos en extremos opuestos de la baliza. En condiciones que impiden que la baliza molecular se hibride con su diana o cuando la baliza molecular está libre en solución, el fluoróforo y el atenuador están próximos entre sí, evitando la fluorescencia. Cuando la baliza molecular encuentra una molécula diana de detección, se produce hibridación; la estructura de bucle se convierte en una conformación estable más rígida que produce la separación del fluoróforo y el atenuador, permitiendo que se produzca la fluorescencia (Tyagi et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 303-308). Debido a la especificidad de la sonda, la generación de fluorescencia se debe sustancialmente exclusivamente a la presencia de la diana de detección/producto amplificado previsto.
Las balizas moleculares son altamente específicas y pueden distinguir secuencias de ácidos nucleicos que difieren en una sola base (p. ej., polimorfismos de un solo nucleótido). Las balizas moleculares se pueden sintetizar con fluoróforos de diferentes colores y diferentes secuencias complementarias de dianas de detección, permitiendo detectar y/o cuantificar simultáneamente varias dianas de detección diferentes en la misma reacción, lo que permite la "multiplexación" de un único ensayo de PoC para detectar una pluralidad de diferentes patógenos o marcadores bioquímicos. Para los procedimientos de amplificación cuantitativa, las balizas moleculares se pueden unir específicamente a la diana de detección amplificada después de amplificación, y debido a que las balizas moleculares no hibridadas no emiten fluorescencia, no es necesario aislar los híbridos sonda-diana para determinar cuantitativamente la cantidad de producto amplificado. La señal resultante es proporcional a la cantidad de producto amplificado. Esto se puede hacer en tiempo real. Al igual que con otros formatos en tiempo real, las condiciones de reacción específicas deben optimizarse para cada conjunto de cebador/sonda para garantizar la exactitud y precisión.
La producción o presencia de ácidos nucleicos y secuencias de ácidos nucleicos diana de detección también se puede detectar y controlar por transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). FRET es un mecanismo de transferencia de energía entre dos fluoróforos: una molécula donadora y una aceptora. De forma breve, una molécula de fluoróforo donadora se excita a una longitud de onda de excitación específica. La posterior emisión de la molécula donadora cuando vuelve a su estado fundamental puede transferir energía de excitación a la molécula aceptora (a través de una interacción dipolo-dipolo de largo alcance). FRET es una herramienta útil para cuantificar la dinámica molecular, por ejemplo, en interacciones ADN-ADN como se ve con balizas moleculares. Para controlar la producción de un producto específico, se puede marcar una sonda con una molécula donadora en un extremo y una molécula aceptora en el otro. La hibridación de sonda-diana de detección produce un cambio en la distancia u orientación del donador y el aceptor y se observa un cambio en las propiedades de FRET. (Joseph R. Lakowicz. "Principles of Fluorescent Spectroscopy", Plenum Publishing Corporation, 2a edición (1 de julio de 1999)).
La producción o presencia de ácidos nucleicos diana de detección también se puede detectar y controlar mediante dispositivos de flujo lateral. Los dispositivos de flujo lateral son bien conocidos. Estos dispositivos generalmente incluyen una ruta de flujo permeable a fluido de fase sólida a través de la cual fluye el fluido por fuerza capilar. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, ensayos con tira reactiva y placas cromatográficas de capa fina con varios revestimientos adecuados. Inmovilizados en o sobre la ruta de flujo hay varios reactivos de unión para la muestra, parejas de unión o conjugados que implican parejas de unión para la muestra y sistemas productores de señales. La detección de analitos se puede lograr de varias formas diferentes, que incluyen: detección enzimática, detección de nanopartículas, detección colorimétrica y detección de fluorescencia. La detección enzimática puede implicar sondas marcadas con enzima que se hibridan con dianas de detección de ácido nucleico complementarias o sustancialmente complementarias en la superficie del dispositivo de flujo lateral. El complejo resultante se puede tratar con marcadores adecuados para desarrollar una señal legible. La detección de nanopartículas implica tecnología de perlas que puede usar oro coloidal, látex y nanopartículas paramagnéticas. En un ejemplo, las perlas se pueden conjugar con un anticuerpo anti-biotina. Las secuencias diana se pueden biotinilar directamente, o las secuencias diana se pueden hibridar con sondas biotiniladas específicas de secuencia. El oro y el látex dan lugar a señales colorimétricas visibles a simple vista y las partículas paramagnéticas dan lugar a una señal no visual cuando se excitan en un campo magnético y pueden ser interpretadas por un lector especializado.
También se conocen métodos de detección de flujo lateral basados en fluorescencia, por ejemplo, métodos de oligosonda marcada con biotina y fluoresceína dual, o el uso de puntos cuánticos.
Los ácidos nucleicos también se pueden capturar en dispositivos de flujo lateral. Los medios de captura pueden incluir métodos dependientes e independientes de anticuerpos. La captura independiente de anticuerpos generalmente usa interacciones no covalentes entre dos parejas de unión, por ejemplo, la alta afinidad y la unión irreversible entre una sonda biotinilada y una molécula de captura de estreptavidina. Las sondas de captura se pueden inmovilizar directamente en las membranas de flujo lateral.
Todo el método de la invención, o al menos la parte del procedimiento de amplificación del método, se puede llevar a cabo en un recipiente de reacción (tal como un tubo de reactivo de plástico de laboratorio convencional, p. ej., de Eppendorf®) o se puede llevar a cabo en y/o sobre un soporte sólido. El soporte sólido puede ser poroso o no poroso. En una realización particular, el soporte sólido puede comprender un material de membrana poroso (tal como nitrocelulosa o similar). Más especialmente, el soporte sólido puede comprender o formar parte de un dispositivo de ensayo de flujo lateral poroso, como se ha descrito antes. Alternativamente, el soporte sólido puede comprender o formar parte de un ensayo de tipo microfluídico, en el que se usan uno o más tubos capilares sólidos de calibre pequeño para transportar un líquido a lo largo de un dispositivo de ensayo.
En realizaciones preferidas, todo o al menos parte del método de la invención se puede llevar a cabo usando un dispositivo de ensayo en el lugar de asistencia (PoC). Un dispositivo PoC típicamente tiene las siguientes características: es barato de fabricar, se desecha después de un solo uso, generalmente es autónomo, no requiere ningún otro aparato o equipo para realizar o interpretar el ensayo y, de manera conveniente, no requiere conocimientos clínicos o entrenamiento para usarlo.
En el presente documento se describen ejemplos de cebadores adecuados para usar en la invención. Otros ejemplos que pueden ser adecuados para usar en el método de la invención se describen, entre otros, en los documentos US 2009/0017453 y EP 2.181.196, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia. El experto en la técnica podrá diseñar fácilmente otros cebadores adecuados para la amplificación de otras secuencias diana sin experimentación excesiva.
Como se explica en otra parte, los cebadores de uso en la invención comprenderán preferiblemente no solo una porción complementaria de la diana, sino también un sitio de unión de endonucleasa de mellado y un sitio de mella, y una porción estabilizadora. Los cebadores preferidos pueden contener una secuencia autocomplementaria que puede formar una estructura de tallo-bucle en la molécula del cebador.
Los cebadores de uso en el método de la invención pueden comprender nucleótidos modificados (es decir, nucleótidos que no se encuentran en moléculas de ácido nucleico de origen natural). Dichos nucleótidos modificados pueden estar presentes convenientemente en la porción complementaria de la diana del cebador y/o en cualquier otra parte del cebador. Los ejemplos preferidos de nucleótidos modificados son nucleótidos modificados en 2', especialmente nucleótidos modificados con 2'O-metilo, aunque los expertos en la técnica conocen muchos otros nucleótidos modificados.
Perfil de temperaturas
El método de la presente invención, aunque no es isotérmico, no requiere ciclos térmicos. Como resultado, el método de la invención no requiere el uso del aparato de ciclos térmicos relativamente complejo usado en la PCR y, en consecuencia, se presta más fácilmente a la aplicación en un contexto de PoC.
"Ciclos térmicos" o ciclos de temperatura significa que, en particular, la temperatura de una mezcla de reacción se mantiene a una temperatura particular (por ejemplo, t 1) durante un periodo de tiempo particular (típicamente al menos 30 segundos). Después, la temperatura se ajusta (ya sea hacia arriba o hacia abajo) antes de volver a la temperatura previamente mantenida.
Típicamente, las reacciones de amplificación de ácido nucleico no isotérmicas, tales como la PCR, requieren la realización de múltiples etapas térmicas por ciclo (es decir, al menos dos o más) y múltiples ciclos térmicos por reacción.
La reducción de temperatura en el método de la presente invención es deliberada y controlada, en el sentido de que la magnitud de la reducción de temperatura está por encima de un nivel mínimo predeterminado y por debajo de un nivel máximo predeterminado. Además, la tasa de disminución de la temperatura se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo predeterminado.
La etapa inicial (a) en el método de la invención implica poner en contacto una secuencia diana con un cebador que tiene al menos una porción que es complementaria de la secuencia diana, en condiciones que permiten que el cebador se hibride con la diana, al menos temporalmente. Esto se puede describir como la fase de "inicio".
Esta etapa se realiza típicamente a una temperatura en el intervalo de 50-65°C, preferiblemente en el intervalo de 52-62°C, más preferiblemente en el intervalo de 54-62°C, lo más preferiblemente en el intervalo de 58-62°C. La mezcla de reacción que comprende la diana y el cebador se puede mantener a esta temperatura durante un periodo de tiempo adecuado. La temperatura óptima, y el periodo de tiempo óptimo durante el cual la mezcla de reacción se mantiene a esta temperatura, pueden ser determinados por el experto en la técnica dado el beneficio de la presente descripción, y estos pueden estar afectados por parámetros tales como la longitud de la secuencia diana, la longitud de los cebadores, y especialmente la longitud de la parte del cebador que es complementaria a la diana, el contenido de G :C del híbrido diana:cebador, el pH y la concentración de sal de la mezcla de reacción. Un tiempo de mantenimiento de la temperatura inicial típico podría estar en el intervalo de 5 segundos a 5 minutos, preferiblemente de 10 segundos a 3 minutos. Las condiciones típicas para permitir el suceso de hibridación inicial en la etapa (a) serán conocidas por los expertos en la técnica y se describen en los ejemplos adjuntos.
Se prefiere el intervalo de temperatura de 58-62°C para la fase de inicio. Se cree que esta es suficientemente alta para minimizar la formación de dímeros de cebadores (y por lo tanto para reducir la cantidad de amplificación no específica) y aumentar la probabilidad de crear potenciales "sitios de inicio" en el dúplex diana, mientras que es suficientemente baja para permitir que al menos algunas de las moléculas de cebador se hibriden con la diana.
La posterior reducción de temperatura ayuda a estabilizar la hibridación de los cebadores relativamente cortos y los productos de extensión, en lugar de la hibridación de los cebadores con la molécula diana original. Se plantea además la hipótesis de que el enfriamiento adicional de la mezcla de reacción facilita la hibridación de la sonda de detección con la diana de detección.
Durante el procedimiento de amplificación expuesto en las etapas (b) -(d) del método, se reduce la temperatura de la mezcla de reacción. Esto se puede hacer de manera regulada, por ejemplo, usando un medio de regulación de la temperatura para reducir la temperatura de la mezcla de reacción de acuerdo con un perfil de temperatura predeterminado. La reducción de temperatura puede comenzar inmediatamente después de la fase de inicio (etapa a). Ventajosamente, el volumen de la mezcla de reacción es pequeño, de modo que se reduce la capacidad térmica de la mezcla de reacción (y el recipiente o sustrato de reacción en o sobre el que se realiza la reacción).
Convenientemente, la mezcla de reacción tiene un volumen de menos de 100 pl, preferiblemente menos de 50 pl, más preferiblemente menos de 25 pl y lo más preferiblemente menos de 20 pl. De esta manera, la temperatura de la mezcla de reacción se puede regular con mayor precisión y rapidez por el medio de regulación de la temperatura. En realizaciones adecuadas, el medio de regulación de la temperatura puede ser muy simple (p. ej., un ventilador) o se puede prescindir de ellos enteramente, habiendo logrado suficiente enfriamiento en gran parte o totalmente por medios pasivos (p. ej., por radiación térmica de la mezcla de reacción). Típicamente, el volumen de la mezcla de reacción puede estar en el intervalo de 1-50 pl, preferiblemente 1-20 pl y más preferiblemente 1-10 pl.
El volumen de la mezcla de reacción puede ser inferior a 10 pl. En particular, el método de la invención puede emplear un enfoque de tipo "PCR digital" (véase la revisión de Morley 2014 Biomolecular Detection and Quantification 1, 1-2) en el que la muestra se diluye y se divide en muchas (normalmente varios cientos, algunos miles, o incluso millones) partes alícuotas que se procesan en paralelo: algunas de las partes alícuotas contendrán una secuencia diana y otras no: si no hay una secuencia diana presente, no se genera ninguna señal. La proporción de partes alícuotas negativas se puede usar para deducir el número y/o la concentración de la secuencia diana en la muestra original. En dichas realizaciones, el volumen de la mezcla de reacción en cada parte alícuota puede ser muy pequeño, sin embargo, típicamente el volumen mínimo sería 2500 nl, preferiblemente al menos 50 pl.
La temperatura se puede reducir en cualquier perfil deseado. Por ejemplo, la temperatura se puede reducir de acuerdo con un perfil sustancialmente lineal (es decir, con una tasa esencialmente constante de reducción de temperatura), o se puede reducir de cualquier manera no lineal, incluyendo una curva o una forma escalonada, o cualquier combinación de perfiles lineales y no lineales (p. ej., uno o más periodos de reducción de temperatura de tasa constante, cuya tasa puede ser cero o relativamente baja, alternando con periodos de tasas de reducción de temperatura relativamente altas).
El perfil de temperatura de la reacción según la invención es tal que no se permite que la temperatura de la reacción vuelva a la temperatura a la que se lleva a cabo la fase de "inicio". Por lo tanto, en el método de la presente invención no hay oscilación alrededor de una temperatura predeterminada y no hay "retorno" a una temperatura predeterminada, al contrario, por ejemplo, de la descripción del documento WO 2011/030145.
La temperatura de la mezcla de reacción al inicio del procedimiento de amplificación será típicamente la misma que la de la etapa (a), p. ej. preferiblemente en el intervalo 54-622C y lo más preferiblemente 58-622C. Durante el procedimiento de amplificación, la temperatura desciende al menos 2°C, preferiblemente al menos 3, 4 o 5°C, más preferiblemente al menos 8, 9 o 10°C, y lo más preferiblemente al menos 13, 14 o 15°C, aunque se apreciará que la magnitud preferida de la disminución de temperatura, en términos absolutos, puede ser al menos parcialmente dependiente de la temperatura inicial seleccionada al comienzo del procedimiento de amplificación, en donde una temperatura inicial más baja (p. ej., en el intervalo de 45-55°C) podría predicar una disminución de temperatura más baja y/o una tasa menor de reducción de temperatura. Típicamente, la magnitud máxima de la disminución de temperatura durante el procedimiento de amplificación es de aproximadamente 20°C, aunque se apreciará que la disminución máxima de temperatura podría ser menor que esto (p. ej., 16, 17, 18 o 19°C) o más (p. ej., 25 o 30°C).
En realizaciones preferidas, la magnitud de la reducción de temperatura de la mezcla de reacción durante el procedimiento de amplificación puede estar en el intervalo de 5-40°C, preferiblemente en el intervalo de 8-35°C, más preferiblemente en el intervalo de 8-30°C o incluso 8-25°C, y lo más preferiblemente en el intervalo de 8-20°C. La temperatura inicial típica de la mezcla de reacción al inicio del procedimiento de amplificación está en el intervalo 50-62°C, preferiblemente 54-62°C, más preferiblemente en el intervalo 56-60°C, y lo más preferiblemente en el intervalo 58-60°C.
En realizaciones preferidas, la reducción de temperatura durante el procedimiento de amplificación (etapas (b) - (d) del método de la invención) incluye una reducción que abarca el intervalo de 54 a 50°C, 56 a 50 o 58 a 50, más preferiblemente 58 a 45, 58 a 40 o incluso 60 a 40°C. Se entenderá que la reducción de temperatura durante el procedimiento de amplificación puede ser mayor que los intervalos expuestos definidos anteriormente. Es decir, la temperatura máxima puede superar la temperatura superior del intervalo expuesto y/o la temperatura mínima puede estar por debajo de la temperatura más baja del intervalo expuesto.
La temperatura final de la reacción de amplificación se selecciona preferiblemente por compatibilidad con el método de detección elegido. Por ejemplo, si el método de detección implica el uso de un marcador de enzima, puede ser deseable arreglar la temperatura final de la reacción de amplificación para que sea compatible con la enzima y, por ejemplo, dentro de ±5°C de la temperatura óptima del enzima. Alternativamente, cuando el método de detección implica el uso de una sonda de detección que se hibrida, tal como una baliza molecular o similar, será ventajoso arreglar la temperatura final de la reacción de amplificación para que se seleccione de manera que sea compatible con la Tm del dúplex de sonda de detección/diana de detección.
Por ejemplo, la temperatura final puede estar convenientemente por debajo de la Tm del dúplex de sonda de detección/diana de detección, preferiblemente al menos 2°C por debajo, para así facilitar la hibridación de la sonda con la diana de detección.
La tasa media típica de reducción de temperatura durante el procedimiento de amplificación está en el intervalo de -0,10 a -6,0°C min-1, preferiblemente en el intervalo de -0,20 a -3,5°C min-1, más preferiblemente en el intervalo de -0,30 a -3,5°C min-1, y lo más preferiblemente en el intervalo de -0,40 a -3,5°C min-1. Como resultará evidente a partir de lo anterior, la tasa real de reducción de temperatura en cualquier instante durante el procedimiento de amplificación podría desviarse de la tasa media preferida, dependiendo de la naturaleza del gradiente de reducción de temperatura.
En algunas realizaciones, el gradiente de reducción de temperatura es sustancialmente lineal durante al menos 3 minutos, más preferiblemente al menos 4 minutos y lo más preferiblemente a lo largo de la mayor parte de la duración del procedimiento de amplificación. Típicamente, el gradiente de reducción de temperatura es sustancialmente lineal a lo largo de un periodo en el intervalo de 3-12 minutos, preferiblemente en el intervalo de 4-10 minutos, más preferiblemente en el intervalo de 4-8 minutos. Para los propósitos actuales, "sustancialmente lineal" significa que, para cualquier polinomio de segundo orden que describa el gradiente de temperatura, la magnitud del coeficiente de X es menos del 5% del valor del coeficiente de Y.
Puede contemplarse un gran número de técnicas diferentes para lograr la reducción de temperatura deseada durante el procedimiento de amplificación. Estas pueden incluir una o ambas de las siguientes: (a) dejar de aplicar calor a la mezcla de reacción y/o retirar la mezcla de reacción de un ambiente calentado y/o aislado y dejar que la mezcla de reacción se enfríe esencialmente por pérdida pasiva de calor al medio ambiente; (b) aplicación de enfriamiento activo a la mezcla de reacción. El enfriamiento activo puede implicar exponer la mezcla de reacción a un ambiente frío, p. ej., colocando la mezcla de reacción en contacto de comunicación térmica (conductor, radiante o convección) con un medio enfriado, especialmente un fluido. Esto podría comprender, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de reacción con un baño de agua fría, usar un ventilador para soplar aire frío u otro gas sobre o a través de la mezcla de reacción, poner en contacto la mezcla de reacción con un refrigerante compatible con la mezcla de reacción, que puede ser un gas, líquido o sólido, o el uso de un dispositivo de enfriamiento tipo Peltier. Por ejemplo, el refrigerante compatible con la mezcla de reacción puede ser un tampón compatible con la mezcla de reacción en forma líquida congelada o enfriada. La adición de un tampón frío tendería a diluir la mezcla de reacción, por lo que si se adopta este enfoque, puede ser preferible usar volúmenes pequeños (p. ej., menos de 1-2 pl) de refrigerante a una temperatura muy por debajo (es decir, más de 20°C más fría que) la temperatura de la mezcla de reacción.
Cualquier etapa de enfriamiento activo se puede aplicar de manera discontinua durante el procedimiento de amplificación para así lograr un nivel de reducción de temperatura deseado y/o un perfil de reducción de temperatura deseado. En particular, el enfriamiento activo se puede realizar en dos o más intervalos intercalados durante el procedimiento de amplificación y, opcionalmente, se puede combinar con enfriamiento pasivo, de forma simultánea o alterna.
En general, se prefiere lograr la cantidad y tasa de reducción de temperatura deseadas sustancialmente por medios puramente pasivos, ya que esto simplifica el método y cualquier aparato o kit requerido para llevar a cabo el método. Con el fin de conseguir la cantidad y tasa de enfriamiento deseadas por medios sustancialmente puramente pasivos, es deseable que el volumen de la mezcla de reacción sea pequeño, para así reducir su capacidad térmica, como se ha indicado previamente.
Es una característica preferida del método de la invención que el procedimiento de amplificación puede usar una primera polimerasa que tiene una temperatura óptima, y una segunda polimerasa que tiene una temperatura óptima, en donde la temperatura óptima de la segunda polimerasa es menor que la temperatura óptima de la primera polimerasa. Por consiguiente, la primera polimerasa puede ser especialmente activa cerca del comienzo del procedimiento de amplificación, puesto que la temperatura de la mezcla de reacción puede estar en o cerca de la temperatura óptima de la primera polimerasa.
Así, por ejemplo, la primera polimerasa puede ser ventajosamente una enzima "termófila" (es decir, que tiene una temperatura óptima superior a 60°C).
Por el contrario, la segunda polimerasa tiene una temperatura óptima más baja que la primera polimerasa. A medida que continúa el procedimiento de amplificación, la temperatura de la mezcla de reacción desciende y se acerca a la temperatura óptima de la segunda polimerasa. Por lo tanto, la segunda polimerasa se vuelve cada vez más activa, lo que al menos compensa parcialmente una disminución de la velocidad de reacción, cuya disminución se debe a (i) una ralentización termodinámica general de la reacción debido a la temperatura más baja y (ii) la temperatura de la mezcla de reacción que posiblemente disminuye por debajo de la temperatura óptima de la primera polimerasa, dando como resultado una catálisis reducida.
Ventajosamente, la temperatura óptima de la segunda polimerasa está en el intervalo de 30-55°C, más preferiblemente en el intervalo de 30-45°C.
En una realización particular, la segunda polimerasa puede ser un fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I o la polimerasa Bsu.
Es concebible que se pueda usar incluso una tercera o más polimerasa, preferiblemente con una tercera temperatura óptima aún más baja.
La segunda polimerasa está preferiblemente en la mezcla de reacción desde el comienzo del procedimiento de amplificación, pero, si se desea, la segunda polimerasa se podría añadir después de un retraso, permitiendo que la temperatura de la mezcla de reacción se reduzca desde una temperatura inicial alta. Esto puede ser ventajoso si, por ejemplo, la segunda polimerasa es especialmente termolábil y es probable que se desnaturalice sustancialmente si está presente a las temperaturas relativamente altas normalmente empleadas al comienzo del procedimiento de amplificación.
De una manera exactamente análoga a lo anterior, el procedimiento de amplificación puede usar una primera y segunda enzimas de mellado con, respectivamente, temperaturas óptimas más altas y más bajas. La primera y segunda enzimas de mellado se pueden usar junto con una única polimerasa o múltiples polimerasas, según sea el caso.
Como antes, el uso de una segunda enzima de mellado con una temperatura óptima más baja puede compensar al menos parcialmente las velocidades reducidas de reacción esperadas a medida que la temperatura desciende durante el procedimiento de amplificación.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la temperatura de la mezcla de reacción puede comenzar en, o se puede reducir durante el transcurso del procedimiento de amplificación, a una temperatura por debajo de la temperatura óptima de la primera polimerasa y/o la primera enzima de mellado y tenderá a aproximarse, e incluso puede alcanzar, la temperatura óptima de la segunda polimerasa y/o la segunda enzima de mellado.
Convenientemente, en algunas realizaciones, el método de la invención puede comprender la etapa de poner en contacto la mezcla de reacción con una enzima de degradación que degrada el ácido nucleico. De manera conveniente, esta etapa, no se efectúa hasta que un usuario haya obtenido el resultado deseado de la reacción de amplificación (p. ej., detección de un patógeno). Por lo tanto, típicamente, la enzima de degradación se añade a la mezcla de reacción después de que el procedimiento de amplificación haya alcanzado el punto final deseado.
Preferiblemente, la enzima de degradación es termolábil de modo que, en el caso de que se introduzca inadvertidamente o se ponga en contacto con la mezcla de reacción antes de que el procedimiento de amplificación haya alcanzado el punto final deseado, la temperatura es suficiente para desnaturalizar sustancialmente o inactivar de otro modo la enzima. Los ejemplos adecuados incluyen uracil-ADN glicosilasa de bacalao ("UDG") disponible en ArcticZymes® y UDG termolábil antártica (disponible en New England BioLabs). Estas enzimas se inactivan rápida e irreversiblemente tras la exposición a una temperatura de 55°C o 50°C respectivamente, y el término "termolábil" en relación con la enzima de degradación, debe interpretarse en consecuencia. Alternativamente, se podría usar una enzima de degradación térmicamente sensible (es decir, una que sea al menos parcialmente activa por debajo de 50°C pero, de manera reversible, sustancialmente inactiva por encima de 55°C).
La invención se describirá ahora con más detalle por medio de ejemplo ilustrativo y con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
Las figuras 1A-1C son representaciones esquemáticas de una realización típica de un cebador útil para llevar a cabo el método de la invención;
Las figuras 2A y 2B son representaciones esquemáticas de la fase de inicio y la fase de amplificación exponencial, respectivamente, de una reacción de amplificación de ácido nucleico adecuada para llevar a cabo el método de la invención;
Las figuras 3 a 11 son gráficos de fluorescencia (señal de fondo restada) (unidades arbitrarias) y temperatura (°C) frente al tiempo (minutos);
Las figuras 12A-12C son gráficos de fluorescencia (señal de fondo restada) (unidades arbitrarias) frente al tiempo para réplicas individuales de reacciones de amplificación;
La figura 13 es un diagrama de dispersión que compara el tiempo necesario para lograr la amplificación a partir de 10 copias de la secuencia de molde en condiciones "STAR" de acuerdo con la invención o en condiciones isotérmicas;
Las figuras 14A y 14B son gráficos de fluorescencia (señal de fondo restada) (unidades arbitrarias) y temperatura (°C) frente al tiempo usando condiciones de amplificación isotérmica (63°C o 49°C respectivamente);
Las figuras 15A, 15B y 15C son gráficos de fluorescencia (señal de fondo restada) (unidades arbitrarias) y temperatura (°C) frente al tiempo (minutos) para réplicas individuales (10 copias o 100 copias; líneas discontinuas y continuas respectivamente) para reacciones de amplificación de acuerdo con la invención con varios perfiles de temperatura;
Las figuras 16A y 16B son gráficos de fluorescencia (señal de fondo restada) (unidades arbitrarias) y temperatura frente al tiempo (minutos) para reacciones de amplificación de acuerdo con la invención con diferentes perfiles de temperatura;
Las figuras 17A y 17B son gráficos de fluorescencia (señal de fondo restada) (unidades arbitrarias) y temperatura (°C) frente al tiempo (minutos) para reacciones de amplificación de acuerdo con la invención llevada a cabo usando cebadores que contienen 6 (Fig. 17A) o 7 (Fig. 17B) bases O-metiladas; y
La Figura 18 es un gráfico de fluorescencia (señal de fondo restada) (unidades arbitrarias) frente al tiempo (minutos) para reacciones de amplificación realizadas de acuerdo con la invención usando una diana de ADN generada por transcripción inversa de ARN 23 S de Listeria monocytogenes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Protocolos para ensayar disminuciones de temperatura
El efecto de la disminución de temperatura en una reacción de amplificación se ensayó comparando amplificaciones usando disminuciones de temperatura a lo largo del tiempo frente a condiciones isotérmicas estándar. La amplificación de temperatura decreciente se denomina en el presente documento "STAR" (reacción de amplificación de temperatura selectiva). Estas comparaciones se llevaron a cabo usando un protocolo como se describe a continuación, a menos que se indique.
Enzimas, oligonucleótidos y diana
Se usó Chlamydia trachomatis (Ct) como la diana inicial para el desarrollo del mecanismo de STAR. El ADN genómico de Chlamydia trachomatis Serovariedad J (ATCC VR-886) se adquirió de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). La región 6 del marco de lectura abierto del plásmido críptico se amplificó con cebadores STARctF61a (SEQ ID NO: 1, 5'-CGACTCCATATGGAGTCGATTTCCCCGAATTA-3') y STARctR61c (SEQ ID NO: 2, 5'-GGACTCCACACGGAGTCTTTTTCCTTGTTTAC-3'). El molde de ADN resultante se detectó usando una sonda molecular STARctMB1 (SEQ ID NO: 3, 5'- FAM/ccattCCTTGTTTACTCGTATTTTTAGGaatgg/BHQ1-3') como se describe en el documento EP N° 0728218. La ADN polimerasa Manta 1.0 se adquirió en Enzymatics (Beverly, MA). La endonucleasa de mellado Nt.BstNBI se adquirió en New England BioLabs (Ipswich, MA) descrita en la patente de EE.UU. n26.191.267.
Los oligonucleótidos y balizas moleculares fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) y Bio-Synthesis (Lewisville, TX). Las características generales de los cebadores usados en las reacciones STAR fueron las siguientes:
Se construyeron conjuntos de cebadores con una región estabilizadora 5' del sitio de mella y una región de unión específica de la diana 3' del sitio de mella (Figura 1A). Los cebadores se construyeron de tal manera que se puede formar una estructura de tallo y bucle en el extremo 5' del oligonucleótido creando una estructura autocomplementaria que forma al menos parte del tallo. La Tm de esta estructura se eligió para dirigir la amplificación lineal o exponencial dependiendo de la temperatura de la reacción en un momento dado. El tallo incluía además al menos una parte de la secuencia de reconocimiento de la enzima de mellado. La secuencia de reconocimiento de la enzima de mellado en los cebadores es parte de la estructura del tallo bicatenario, pero al menos un nucleótido es monocatenario para evitar la mella. Si se desea, la secuencia que es complementaria de la secuencia diana puede comprender una estructura secundaria o puede carecer de estructura secundaria. Además, esta secuencia puede contener nucleótidos modificados tales como modificaciones 2' o enlaces fosforotioato.
Con referencia a la Figura 1A, la "región de cebador" es la secuencia que es complementaria y se reasocia con la secuencia diana. La "región NEB" es la región de unión de la endonucleasa de mellado, es decir, la región de reconocimiento de la enzima de mellado que, en este caso, mella el cebador en un sitio cuatro nucleótidos en la dirección 3' del extremo de la región NEB. El "bucle de amplificación" proporciona estabilización e hibridación del cebador para el procedimiento de amplificación y forma un bucle sobre sí mismo por autocomplementariedad durante la fase de inicio para reducir la amplificación no específica de fondo. Las figuras 1B y 1C muestran realizaciones ligeramente diferentes de cebadores útiles en el método de la invención. La estructura del cebador es esencialmente idéntica a la realización mostrada en la figura 1A, pero los cebadores alterados incluyen bases modificadas en la "región del cebador". Específicamente en el extremo 3' de la región del cebador hay una serie de bases 2'O-metiladas consecutivas. En la figura 1B esta serie tiene 7 bases de longitud y en la figura 1C la serie tiene 6 bases de longitud. Se usaron cebadores del tipo mostrado en la figura 1B y 1C en el ejemplo 8 a continuación.
El resumen de los oligonucleótidos y el mecanismo de amplificación encontrados en una reacción comprende (1) una molécula de ácido nucleico diana; (2) dos o más moléculas de oligonucleótidos cebadores que comprenden cierto número de oligonucleótidos que son complementarios de la molécula de ácido nucleico diana y (3) un sitio dentro del cebador que puede ser mellado por una enzima de mellado. El método implica poner en contacto una molécula de ácido nucleico diana con una polimerasa, dos o más oligonucleótidos cebadores, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de nucleótidos diana y una enzima de mellado; y, en condiciones no isotérmicas, generar un amplicón detectable que comprende al menos una parte de un oligonucleótido cebador que se une a una secuencia diana. Se puede entender que la reacción general de STAR experimenta dos fases distintas; iniciación y amplificación exponencial. La fase de inicio es la formación inicial de un dúplex molde exponencial a partir del cual puede ocurrir la amplificación exponencial. Estas dos fases se ilustran esquemáticamente en las Figuras 2A y 2B. En esas figuras, el símbolo del triángulo representa la enzima de mellado y el símbolo del hexágono representa la ADN polimerasa. Se produce contacto inicial del cebador con un ácido nucleico diana seguido de la extensión y generación de molde de inicio directo. Después, el cebador de la cadena opuesta se une al molde de inicio directo recién generado, extendiéndose en la dirección hacia, y a través del sitio de mella del molde de inicio. Puede entenderse que este proceso inicial implica la polimerasa para la extensión y es muy propenso a la formación de dímeros de cebadores y a la falsa amplificación de productos truncados o de fondo. Una vez que comienza el mellado en cualquiera de las cadenas, la polimerasa se infiltrará en el sitio de mella y se extenderá hacia el cebador opuesto y a través del sitio de la mella.
Una vez que se ha producido este ciclo de mellado seguido de extensión de la polimerasa tanto en la cadena de inicio directa como en la cadena de inicio inversa, se forma un dúplex conocido como dúplex exponencial. Comienza la segunda fase de la reacción; este proceso exponencial de amplificación se alimenta a sí mismo ya que cada nuevo molde generado a partir de una mella y extensión es ahora una diana para otro cebador.
Ahora se entiende que la segunda fase requiere una endonucleasa de mellado activa para la generación rápida de molde. Se sabía previamente que esta replicación por desplazamiento de la cadena de mella ocluía la necesidad de ciclos de temperatura, por lo que la reacción podía llevarse a cabo, y siempre se ha llevado a cabo a temperatura constante. El presente nuevo descubrimiento permite métodos de amplificación únicos y distintos con un rendimiento significativamente mayor que los métodos existentes, incluyendo un alto rendimiento de producto con gran especificidad en un periodo de tiempo corto.
Condiciones de amplificación
La mezcla de reacción de amplificación de temperatura selectiva (STAR) básica contiene dos cebadores, polimerasa y enzima de mellado (mencionado antes). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 20 gl, que incluía cebador directo 0,41 gM, cebador inverso 0,2 gM del, baliza molecular 0,18 gM, 10 gl de mezcla maestra de STAR y 5 gl de muestra de ADN. La mezcla maestra de STAR contiene los siguientes reactivos; MgSÜ4 15 mM, Tris-HCl 90 mM (pH 8,5), dNTP 300 gM de cada uno, (NH4)2SÜ4 15 mM, Na2SÜ4 15 mM, DTT 1 mM, Triton X-100 al 0,01%, endonucleasa de mellado 7 U, polimerasa 48 U. La temperatura de las reacciones era isotérmica o variaba en función de la cantidad de reducción de temperatura. Si la temperatura durante la amplificación en cada reacción comienza a 602C y disminuye una cantidad específica cada 15 segundos o 1 minuto, entonces, por ejemplo, una tasa negativa de 0,5°C (es decir, una disminución de 0,5°C en la temperatura cada 15 segundos) durante 10 minutos daría como resultado una reducción de la temperatura de 60°C a 40°C a lo largo del transcurso de la reacción. La amplificación y detección del producto STAR se llevaron a cabo con el aparato Agilent Mx3005 P QPCR (Agilent). La siguiente tabla da los perfiles de temperatura ensayados, excepto donde se indique:
Tabla 1
Figure imgf000013_0001
La incubación previa a la reacción es para permitir que los reactivos alcancen la temperatura para ensayar el efecto de temperaturas decrecientes en la cinética de amplificación, rendimiento de la enzima y fluorescencia de la señal. Realizar las reacciones de esta manera elimina las variables de temperatura creciente y permite una comparación directa entre las técnicas de amplificación isotérmica existentes y el nuevo método de STAR.
Procedimiento de amplificación
Las etapas exactas en las que se llevaba a cabo una reacción de amplificación eran las siguientes: 1) preparación de la mezcla maestra; 2) preparación de cebadores con diana o sin diana; 3) adición de mezclas de cebadores a la fila A-G de una placa de 96 pocillos dependiendo del número de reacciones que se van a hacer por placa; 4) adición de la mezcla maestra a la fila H de la misma placa de 96 pocillos; 5) sellado de la placa y realizar una incubación previa a la reacción durante 2 minutos; 6) transferencia de la mezcla maestra de la fila H a cada fila de mezcla de cebadores, esperando 15 segundos entre transferencias; 7) sellado e inicio del perfil de temperatura preseleccionado y recogida de datos.
Durante el transcurso de una reacción, se midió el producto amplificado cada 15 segundos usando la baliza molecular como se ha descrito antes. Se vigiló la fluorescencia de la baliza molecular en la mezcla de reacción para medir la cantidad de producto específico que se genera durante una reacción. El producto específico generado durante una reacción se une a la baliza molecular que separa el fluoróforo del atenuador, generando fluorescencia. De las mediciones de fluorescencia se restó la señal de fondo basándose en la media de las primeras 3 lecturas de cada pocillo de reacción, antes de empezar la amplificación. Se hizo una caracterización adicional basada en un aumento desde el nivel umbral de la línea base (TL). El TL se eligió cerca de la línea base de la fluorescencia con la señal de fondo restada, pero por encima del intervalo de fluctuaciones aleatorias. La disminución de la temperatura hace que la fluorescencia de la línea base de la baliza molecular disminuya debido a la mayor resistencia del tallo, que produce una disminución lineal constante de la línea base a medida que el atenuador y el fluoróforo tienen una interacción mayor. Se eligió el TL de 2000 para todas las reacciones. Para comparación, se determinó un número exacto basado en el tiempo de amplificación para alcanzar el TL, denominado valor At . El uso del valor At permite realizar comparaciones de una placa a otra.
Ejemplo 2: Resultados usando cebadores sin modificar
Para demostrar la mejora que proporciona STAR frente a las tecnologías isotérmicas actuales, se llevaron a cabo amplificaciones usando 18 duplicaciones para la diana y 6 duplicaciones sin diana. Las reacciones de STAR muestran una mejora espectacular en la velocidad, sensibilidad y fluorescencia total en comparación con las condiciones isotérmicas. En particular, el intervalo de -0,82C minuto a -3,22C minuto era notablemente mejor que todas las condiciones isotérmicas (Figuras 3 a 11). Es sorprendente e inesperado que una reducción de temperatura tan significativa siga generando excelentes resultados. Sin limitar a los autores de la invención a ninguna teoría en particular, se cree que las mejoras en la amplificación se pueden atribuir a al menos tres características, que se describen más adelante.
Los resultados de experimentos que usan cebadores no modificados se muestran en las figuras 3-11. En esas figuras, el perfil de temperatura está indicado por el sombreado de fondo. La cantidad de señal (fluorescencia) para los controles negativos "sin diana" se indica mediante el gráfico oscuro. La cantidad de señal generada en presencia de 10 o 100 copias de la diana (ADN genómico de C. trachomatis) se indica mediante los gráficos más claros.
Las Figuras 3, 4 y 5 muestran los resultados para las amplificaciones isotérmicas (es decir, no según el método de la invención) a 50, 56 y 60°C respectivamente. Como se puede ver en la figura 3, esencialmente no había amplificación específica a 50°C, amplificaciones fuertes a 56°C (Figura 4), al menos para un número de copias de dianas de 100, y una amplificación baja a 60°C (Figura 5).
Las Figuras 6-10 muestran los resultados obtenidos para reacciones de amplificación no isotérmicas (STAR) de acuerdo con la invención, en las que la temperatura se redujo durante la amplificación. La tasa de reducción de temperatura era lineal, variando entre -0,1°C por 15 segundos (es decir, -0,4°C por minuto) en la figura 6, a -1,0°C por 15 segundos (es decir, -4,0°C por minuto) en la figura 10. Se puede ver que, en todos los casos, las reacciones con 100 copias de la diana generaban más señal de fluorescencia que las reacciones con 10 copias de la diana, como era de esperar. Más significativamente, las reacciones producían mucha más señal que las amplificaciones isotérmicas equivalentes, especialmente para las reacciones de número de copias de diana 10. Además, la señal detectable se produjo más rápidamente que en las reacciones isotérmicas equivalentes.
Se obtuvieron resultados similares cuando el método de la invención se llevó a cabo usando una reducción de temperatura escalonada no lineal (como se muestra en la figura 11).
Los autores de la invención también encontraron (datos omitidos por brevedad) que la variación en la cantidad de señal entre diferentes duplicaciones en reacciones de STAR era mucho menor que entre duplicaciones en reacciones isotérmicas, proporcionando que el método de la invención generaba resultados mucho más consistentes. Los siguientes comentarios ofrecen un posible mecanismo por el cual el método de la invención podría conferir las ventajas indicadas antes.
En la mayoría de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos se forman eventualmente dímeros de cebadores, que compiten por reactivos limitados y, con concentraciones de diana bajas, los dímeros de cebadores pueden convertirse en la ruta de amplificación principal para una reacción. Limitar o retrasar la formación de dímeros de cebadores, incluso en una pequeña cantidad, proporciona beneficios significativos a una reacción. Debido a la naturaleza rápida de la reacción de amplificación, retrasar la formación de dímeros de cebadores permite favorecer las rutas de amplificación preferidas (es decir, generación de molde) mejorando todos los aspectos de la amplificación. Al iniciar las reacciones a temperaturas elevadas, se favorecen estas rutas del molde e incluso son preferidas. Esto se ve por la mayor sensibilidad en el método de STAR, mejor señal de fluorescencia, agrupación más estrecha de duplicaciones (es decir, mayor reproducibilidad) y mayor velocidad.
Después de la fase de inicio de la reacción comienza la fase exponencial. Puesto que se ha favorecido la ruta del molde frente a rutas errantes, es deseable generar la mayor cantidad de producto lo más rápidamente posible, y esto es facilitado por STAR. Una de las etapas más probablemente limitante para esta generación es la mella de los sitios por la endonucleasa de mellado. A medida que se reduce la temperatura de la mezcla de reacción, se acerca a la temperatura más favorable para la endonucleasa de mellado y se aumenta la eficiencia de la reacción, generando tanto molde como, es posible para la detección.
A medida que la temperatura disminuye, las balizas moleculares adicionales favorecen la detección del molde y la disminución de la señal de fondo de fluorescencia. La temperatura de fusión de los moldes con las balizas moleculares se vuelve significativamente más alta que la temperatura de detección, generando una señal mejorada a medida que se funden menos moldes de la baliza molecular. Además, debido a la menor temperatura, las temperaturas de fusión del tallo se vuelven más altas que las temperaturas de reacción. Así, la baliza molecular favorece una fase cerrada cuando no hay molde presente, generando menos señal de fondo.
El nuevo método de reacción no isotérmico de la invención proporciona una mejora sustancial con respecto a las condiciones isotérmicas y de ciclos térmicos existentes. Al favorecer la actividad enzimática y la cinética de reacción óptima, el método ha mejorado el cambio de At, ha aumentado la cantidad total de fluorescencia generada, ha mejorado la consistencia de la amplificación y ha aumentado la sensibilidad de detección.
Ejemplo 3: Resultados usando SYBR Green II
Debido a que las balizas moleculares solo miden un aumento de la cantidad total de producto de ADN monocatenario específico, no se mide el producto de amplificación no específico independientemente del producto de amplificación previsto. Para medir la producción de productos de amplificación no específicos (p. ej., que proceden de la formación de dímeros de cebadores), se llevaron a cabo reacciones separadas en presencia de SYBR Green II. SYBR Green II es uno de los colorantes más sensibles conocidos para detectar ADN monocatenario, ARN y ADN bicatenario. Debido a que SYBR Green II tiene una fluorescencia intrínseca baja, es una elección natural para la detección de amplificación total en una reacción o amplificación no específica si la amplificación se realiza sin presencia de diana. Las reacciones se llevaron a cabo directamente en dos condiciones, isotérmicas y no isotérmicas (STAR) como se presenta a continuación en la Tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000015_0001
Además, las reacciones comparaban 50 copias de ADN genómico frente a ninguna diana. SYBR Green II se adquirió con una concentración de 10.000x, se usó 0,5x por reacción (Life Technologies, Carlsbad). Se usó un TL más alto, 9000, para calcular el At debido a la naturaleza intrínseca de los colorantes intercalantes. SYBR Green II tiene una relación inversa de fluorescencia a temperatura. Cuanto menor es la temperatura, mayor es la señal fluorescente, como se describe en "Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperatura" (Gudnason et al., 2007 Nucl. Acids Res. 35 (19) e 127). Los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3
Figure imgf000015_0002
El método STAR presenta múltiples mejoras; primero, reduce la producción de señal de fondo, lo cual es evidente por el mayor tiempo que tarda "sin diana" en mostrar la amplificación por SYBR Green II en relación con la señal con diana. En segundo lugar, ha mejorado la amplificación del producto, observado por el tiempo de amplificación más rápido cuando la diana está presente. Combinadas, estas mejoras más que cuadriplican la diferencia entre los At en relación con los métodos isotérmicos.
Debe indicarse que los valores de At de reacciones isotérmicas tenían más variabilidad que los valores de At de STAR. Esto muestra el beneficio que tiene el nuevo método en el control del procedimiento de amplificación y refleja la impredecibilidad de las rutas de amplificación no específicas usando métodos tradicionales.
Ejemplo 4: Resultados usando cebadores modificados con 2' O-metilo
Como se describe en las patentes de EE.UU. 6.794.142 y 6.130.038, se sabe que el uso de cebadores modificados con 2' O-metilo reduce la formación de dímeros de cebadores durante la amplificación. El documento US 2005­ 0059003 describe el uso de modificaciones 2' O-metilo situadas en el 3' de los cebadores de la SDA, por lo que la ADN polimerasa I Bst y sus derivados pueden usar de manera eficaz ribonucleótidos modificados en 2' como cebadores para la síntesis de ADN. Regiones de cebadores específicas de la diana que comprenden uno o más nucleótidos modificados en 2' (p. ej., 2'-O-metilo, 2'-metoxietoxi, 2'-fluoro, 2'-alilo, 2'-O-[2-(metilamino)-2-oxoetilo], 2'-hidroxilo (ARN), 4'-tio, 4'-CH3-O-2'-puente, 4'-(CH3) 3-O-2'-puente, 2'-LN A, y 2'-O-(N-metilcarbamato 2'-Suc-OH)) debería mejorar las reacciones isotérmicas. Si los nucleótidos modificados en 2' eliminaran completamente la formación de dímeros de cebadores, sería sorprendente que el método de STAR pudiera mejorar más la amplificación. Las reacciones se llevaron a cabo directamente entre dos condiciones, isotérmicas y no isotérmicas (STAR) como se presenta a continuación.
Tabla 4
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Los resultados de la amplificación usando nucleótidos modificados en 2' en el extremo 3' de los cebadores se muestran en la tabla 5 a continuación. Las reacciones se llevaron a cabo con un mínimo de seis duplicaciones en reacciones sin diana y doce duplicaciones con reacciones con diana.
Tabla 5
Figure imgf000016_0002
Los datos demuestran que el uso de al menos un cebador que incorpora 2' O-metil-nucleótidos retrasa la formación de dímeros de cebadores mejorando la reacción, aunque ralentizándola. Además, el uso del método de STAR no solo mejoró el uso de la amplificación de 2' O-metilo, recuperando parte de la velocidad perdida, sino que también mejoró tres veces la diferencia entre la amplificación con diana y sin diana. Esto indica que aunque las modificaciones 2' O­ metilo reducen la producción de amplificación errante, no específica, no la eliminan. Los datos sugieren además que el método de STAR usa mejor las mejoras generadas por las modificaciones de 2' O-metilo que las técnicas existentes descritas previamente.
Sin limitar la invención a ninguna teoría particular, se plantea la hipótesis de que las potenciales mejoras obtenidas usando uno o más nucleótidos modificados en 2' en la región del cebador se deben en gran medida a mejoras en la fase de inicio de la amplificación.
Durante la extensión inicial de la región del cebador en una diana, la incorporación de uno o más nucleótidos modificados en 2' en la región del cebador de STAR hace que estos nucleótidos no sean adecuados para servir como molde para la extensión de la polimerasa en complejos no específicos formados por interacciones de cebadores, que reducen la señal de fondo. Es muy posible que la polimerasa se detenga cuando el nucleótido entre en el bolsillo de unión. En reacciones no productivas (es decir, formación fuera de la diana o de dímero de cebadores), el efecto de detención es suficiente para minimizar la extensión aberrante porque la unión del molde está cerca de su temperatura de fusión. Por consiguiente, las modificaciones 2' pueden restringir rutas de amplificación indeseables porque la reacción se ha estancado. Sin embargo, durante las amplificaciones favorables, las modificaciones 2' reducen las temperaturas de fusión, afectando así negativamente a la amplificación, ralentizando el tiempo hasta la amplificación. STAR puede aprovechar las modificaciones en 2' a la vez que minimiza los inconvenientes negativos de la amplificación de la diana.
Esta detención de la polimerasa explica además por qué STAR junto con las modificaciones 2' O-metilo se mejoran entre sí. El aumento inicial de temperatura encontrado en el método STAR, además de reducir naturalmente los dímeros de cebadores, exacerba la detención de la modificación 2' y la fusión de los cebadores antes de que pueda ocurrir la amplificación errante, por lo que ambos métodos se complementan entre sí. Además, puesto que STAR implica reducir la temperatura, las disminuciones en la temperatura de fusión causadas por las modificaciones en 2' en los cebadores se pueden minimizar a medida que avanza la reacción.
Ejemplo 5: Resultados usando múltiples polimerasas
Las tecnologías de amplificación existentes realizan ciclos térmicos o se realizan a temperatura constante. El método de la presente invención no hace ninguno, sino que se realiza disminuyendo la temperatura sin ciclos. Una característica novedosa particular de la invención es la capacidad de usar enzimas de función similar, pero con diferentes temperaturas óptimas. Por ejemplo, esta tecnología permitirá el uso de múltiples cebadores diseñados para endonucleasas de mellado que funcionan a diferentes temperaturas óptimas, junto con diferentes polimerasas de desplazamiento de cadena con diferentes óptimos. Sin limitar la invención a ninguna teoría particular, este método abre métodos de amplificación rápidos, permitiendo nuevas combinaciones de enzimas y cebadores no vistas en las tecnologías existentes. Las reacciones a continuación (Tabla 6) se llevaron a cabo directamente entre tres condiciones, isotérmicas, no isotérmicas (STAR) y no isotérmicas (STAR) con polimerasa BSU (además de la polimerasa Manta 1.0 inicial) como se presenta a continuación. La polimerasa BSU se adquirió de New England BioLabs (Ipswich, MA) y se usaron 0,5 U por reacción. Todas las condiciones se llevaron a cabo usando 18 duplicaciones de diana y 6 duplicaciones sin diana.
Tabla 6
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Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo usando muestras que contenían 10 copias de ADN genómico de C. trachomatis, y los resultados se muestran en las figuras 12A-12C.
La figura 12A muestra los resultados para la reacción isotérmica (no según la invención). La figura 12B muestra los resultados para la reacción de STAR en presencia de polimerasa Manta sola, y la figura 12C muestra los resultados para la reacción de STAR en presencia de polimerasa BSU adicional.
La primera diferencia obvia es la falta de detección de 10 copias de ADN genómico por el método isotérmico, solo 9 de 18 duplicaciones superaron el nivel umbral de fluorescencia (TL) y se podía decir que se habían amplificado. Ambos métodos de STAR detectaron 17 de 18 duplicaciones. (Debe indicarse que la duplicación perdida en cada método STAR se debió a una pipeta multicanal defectuosa).
Aunque las diferencias entre los métodos de STAR son menos marcadas, la adición de una segunda polimerasa con una temperatura óptima más baja, 37°C, mejoraba la fluorescencia total después de 10 minutos. Además, la segunda polimerasa también estrecha las duplicaciones, disminuyendo la variabilidad del At. Esta diferencia se demostraría más si una polimerasa de desplazamiento de cadena comercial estuviera disponible en el mercado con una temperatura óptima de 45°C a 50°C. Los resultados indican que el método de STAR es superior a las condiciones isotérmicas y además que esta tecnología permite nuevas mecánicas novedosas, combinaciones de enzimas y esquemas de amplificación de cebadores.
Ejemplo 6: Reproducibilidad
Para validar la consistencia de la tecnología de STAR se llevó a cabo un gran estudio de duplicaciones comparando las condiciones de STAR y las isotérmicas publicadas como se describe en la patente de EE.UU. 9.562.263. Las amplificaciones, STAR frente a isotermia, se llevaron a cabo usando más de 100 duplicaciones para las reacciones que contienen diana y 16 duplicaciones para las mezclas de reacción de control sin diana. Ambas condiciones usaban los mismos tampones, polimerasa, enzima de mellado y diana. Como se muestra en el gráfico de dispersión en la figura 13, la tecnología de STAR muestra una clara mejora en el tiempo medio (At) para lograr la amplificación al nivel umbral de fluorescencia (TL), mejor sensibilidad y una desviación estándar reducida entre duplicaciones. El tiempo At para las reacciones realizadas según la invención era de 3,35 minutos, mientras que el valor de At para las reacciones realizadas según los protocolos isotérmicos convencionales era de 4,88 minutos, una diferencia que es estadísticamente significativa considerado por la prueba t bilateral. Sin limitar a los autores de la invención a ninguna teoría en particular, se cree que la reducción significativa en el tiempo de amplificación se debe al mejor inicio de la reacción, que permite una amplificación de un número bajo de copias más eficiente, minimiza los sucesos de dímeros de cebadores y aumenta las extensiones de productos específicos que generan moldes más rápidamente que los métodos previamente descritos.
Ejemplo 7: Reacciones de amplificación realizadas más allá de los intervalos de temperatura isotérmicos convencionales
Otro beneficio de la tecnología de STAR es la capacidad de amplificar fuera de los intervalos de temperatura de amplificación isotérmica más comunes. Como se describe en las patentes de EE.UU. 5.712.124 y 9.562.263, la mayoría de las tecnologías de amplificación isotérmica tienen un intervalo de temperatura estrecho en el que se puede producir la amplificación. Fuera de estos intervalos de temperatura típicos, las técnicas isotérmicas convencionales tienen dificultades para la amplificación. Para demostrar la versatilidad de STAR, se llevaron a cabo amplificaciones como se describe en la Tabla 7 a continuación.
Tabla 7
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Figure imgf000018_0002
Las reacciones isotérmicas se llevaron a cabo como se describe en la patente de EE.UU. 9.562.263. Las figuras 14A y 14B son gráficos que muestran la cantidad de señal de fluorescencia (señal de fondo restada; unidades arbitrarias) frente al tiempo (minutos) para reacciones de amplificación isotérmica realizadas a 63°C (Figura 14A) o 49°C (Figura 14B). En ambas figuras, los gráficos de puntos representan los resultados obtenidos de las reacciones de control negativo sin molde; los gráficos de línea continua son los resultados de las reacciones de ensayo que contienen molde.
Está claro a partir de la figura 14A que sustancialmente no se produce amplificación específica de molde cuando la temperatura de reacción se mantiene a 63°C. En la figura 14B, los resultados parecen sugerir que a 49°C la amplificación se está produciendo desde aproximadamente 9 minutos en adelante, pero en realidad esta es probablemente una señal falsa que procede de interacciones de balizas moleculares con cebadores (datos no mostrados).
En contraste con las reacciones isotérmicas, las reacciones de "STAR" llevadas a cabo de acuerdo con la invención se podrían iniciar a temperaturas elevadas y lograr todavía una buena amplificación. Los resultados de estas reacciones se muestran en las figuras 15A, B y C. Estos son gráficos de fluorescencia (señal de fondo restada, unidades arbitrarias) frente al tiempo (minutos). El sombreado negro indica la temperatura (°C) durante las reacciones. Los gráficos de puntos representan los resultados obtenidos usando 10 copias de la diana, los gráficos continuos representan los resultados obtenidos con 100 copias de la diana. En la figura 15A, la temperatura inicial era 62°C y la tasa de disminución de temperatura era -0,82C por 15 segundos (es decir, -3,2°C por minuto). En la figura 15B, la temperatura inicial era 63°C y la tasa de disminución de la temperatura era -0,8°C por 15 segundos. En la figura 15C, la temperatura inicial era 64°C y la velocidad de disminución de temperatura era -0,9°C por 15 segundos (es decir, -3,6°C por minuto). Es evidente a partir de las figuras que una temperatura inicial de 62 o incluso 63°C proporciona buenos resultados para las reacciones de STAR, e incluso hay algo de amplificación usando una temperatura inicial de 64°C, aunque esto es claramente subóptimo.
Además, se llevaron a cabo experimentos usando disminuciones de temperatura grandes. Los resultados se muestran en las figuras 16A y 16B. Los gráficos muestran los resultados para controles negativos sin diana (sin señal de fluorescencia por encima del nivel umbral) y para reacciones de STAR realizadas en presencia de 10 o 100 copias del ADN genómico diana de C. trachomatis.
La figura 16A muestra los resultados obtenidos usando una temperatura inicial de 63°C, seguida de una tasa de reducción de temperatura de -0,8°C por 15 segundos durante 1 minuto, seguida de una reducción repentina a 49°C, y luego una reducción gradual de la temperatura de -0,2°C por 15 segundos (es decir, -0,8°C por minuto) durante la duración de la reacción. El gráfico muestra que se logró la amplificación para las reacciones de número de copias tanto de 10 como de 100, aunque había aproximadamente el doble de señal de fluorescencia para las reacciones de 100 copias de diana en comparación con las reacciones de 10 copias de diana, y había una variabilidad considerable intragrupo.
La figura 16B muestra los resultados obtenidos usando la misma temperatura inicial de 63°C durante 1 minuto, seguida de la reducción repentina a 49°C. A continuación, la temperatura de reacción se mantuvo a 49°C durante la duración del experimento. Se puede ver a partir del gráfico que hay una buena amplificación específica y mucha menos variación intragrupo (reacciones realizadas con un número de copias de 100 de diana o solo sin diana).
La capacidad de STAR para amplificar en un intervalo de temperatura de 40°C indica claramente que STAR es muy diferente de las reacciones de amplificación convencionales. Las temperaturas de reacción atípicas con intervalos grandes son inusuales y no se espera que funcionen. Sin limitar a los autores de la invención a ninguna teoría en particular, es inesperado que estos intervalos de temperatura grandes parezcan ser menos restrictivos para la amplificación para STAR que para los métodos de amplificación convencionales. Posiblemente, la capacidad de STAR para lograr una amplificación superior en un intervalo mayor de temperaturas se debe a la mejora de la especificidad del cebador y la unión junto con el uso estratégico de la temperatura óptima de la enzima. Al usar una temperatura más alta para la fase de inicio, se favorece la verdadera amplificación del producto y, por lo tanto, se mejora la eficiencia de todas las fases posteriores, la amplificación exponencial y detección. Esta selección y la posterior caída de temperatura abren la caja de herramientas de la amplificación, ya que se pueden realizar nuevos esquemas para enzimas, cebadores y temperaturas.
Ejemplo 8: Resultados usando seis y siete-2'-O-metilo
Como se ha descrito previamente, se sabe que los cebadores modificados con 2'-O-metilo reducen la formación de dímeros de cebadores durante la amplificación. Una ilustración adicional de la naturaleza cooperativa de estas modificaciones con la tecnología de STAR es la capacidad de incorporar cadenas grandes de modificaciones 2'-O-metilo y aún lograr la amplificación. Típicamente, las modificaciones 2'-O-metilo detienen la polimerasa, retardando permanentemente la amplificación; se cree que seis o más hacen que la polimerasa se "caiga" del complejo en lugar de simplemente detenerse. Las figuras 17A y 17B demuestran la capacidad de STAR para tolerar estas modificaciones y lograr una amplificación significativa con cadenas de 2'-O-metilo más largas que las identificadas previamente. La estructura de los cebadores que contienen bases 2'-O-metiladas se muestra en las figuras 1B y 1C.
Las figuras 17A y 17B son gráficos de fluorescencia (restada la señal de fondo) (unidades arbitrarias) frente al tiempo (minutos). El sombreado indica el perfil de temperatura (°C) a lo largo del tiempo durante el curso de las reacciones de amplificación. La figura 17A muestra los resultados para reacciones llevadas a cabo usando cebadores que contienen 6 bases modificadas con 2'-O-metilo, y la figura 17B muestra los resultados para reacciones llevadas a cabo usando bases modificadas con 7 2'-O-metilos. En ambos casos, las reacciones de control negativo sin diana no generaban ninguna señal de fluorescencia, mientras que había una buena amplificación usando cualquiera de los cebadores modificados, aunque la señal media de fluorescencia era ligeramente mayor para los cebadores de 6 bases modificadas, y la variación intragrupo era considerablemente menor en comparación con los resultados de los cebadores de 7 bases modificadas.
Como se ve en las figuras, los cebadores que contienen cadenas de seis y siete 2'-O-metilos se amplifican bien con STAR. Esto podría deberse a la capacidad de STAR para comenzar la amplificación en las regiones de temperatura altamente favorables de las polimerasas de desplazamiento de cadena, de aproximadamente 65°C. Esta región favorable puede permitir que la polimerasa extienda cadenas modificadas en 2' más largas, permitiendo el inicio del que carecen otras tecnologías. Por brevedad, no se muestran los datos, pero también se puede describir que la longitud completa de las regiones de cebadores se ha modificado con 2'-O-metilo y muestra una amplificación, aunque más lenta y con una señal fluorescente más baja.
Ejemplo 9: Resultados usando ácido ribonucleico
STAR puede amplificar a partir de cualquier ácido nucleico, usando cualquier composición de ADN (ADNc y ADNg), ARN (ARNm, ARNt, ARNr, ARNip, microARN), análogos de ARN/ADN, análogos de azúcar, híbridos, poliamida-ácido nucleico y otros análogos conocidos. La amplificación del ARN ribosómico se llevó a cabo como se describe a continuación.
Enzimas, oligonucleótidos y diana:
Se usó Listeria monocytogenes como diana para el desarrollo del ensayo de ARN de STAR. El ADN genómico de Listeria monocytogenes (ATCC VR-886) se adquirió de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). El cribado inicial se realizó en ADNg, y se encontró que una región de 23S de ARN ribosómico estaba amplificada con los cebadores LMONF72 (SEQ ID NO: 4, 5'-GGACTCGATATCGAGTCCAGTTACGATTTGTTG-3') y LMONR86 (SEQ ID NO: 5, 5'- gGACTCCATATGGAGTcCTACGGCTCCGCTTTT-3'). El molde de ADN resultante se detectó usando una baliza molecular LMONMB1 (SEQ ID NO: 6, 5'-FAM/gctgcGTTCcAATTCGCCTTTTTCGCagc/BHQ1-3') como se describe en el documento EP N° 0728218. El ARN total se aisló usando el mini kit RNeasy Plus Qiagen (Hilden, Alemania) combinado con lisis mecánica rápida en un dispositivo Mini Bead Mill 4 (VWR). Listeria monocytogenes (ATCC BAA-2660) se adquirió de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se revivió cultivando en placas de agar-infusión de cerebro-corazón (BHI). Se usó una sola colonia para inocular 25 ml de medio BHI que se cultivó durante 18 horas a 37°C para alcanzar la fase estacionaria. Después, el cultivo se volvió a diluir y se hizo crecer durante cuatro horas adicionales antes de la recolección. Los sedimentos de bacterias se resuspendieron en tampón de lisis RLT y se homogeneizaron en el Mini Bead Mill (VWR). El ARN total se purificó según las instrucciones del fabricante (Qiagen). El ADN genómico se separó pasando los lisados sobre una columna de unión a ADN proporcionada en el kit de purificación RNeasy Plus. La contaminación por ADN genómico se minimizó aún más mediante una digestión en columna de ADNasa I de muestras en la columna de unión de ARN RNeasy. La ADN polimerasa Bst X se adquirió de Beverly Qiagen (Beverly, MA). Omniscript, una transcriptasa inversa, se adquirió de Qiagen (Hilden, Alemania). La endonucleasa de mellado Nt BstNBI se adquirió de New England BioLabs (Ipswich, MA) como se describe en la patente de EE.UU. n° 6.191.267. Los oligonucleótidos y las balizas moleculares fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA).
Condiciones de amplificación:
La mezcla de STAR básica contenía todo como se describe en el ejemplo 1 anterior con la inclusión adicional de lo siguiente: 4 U de transcriptasa inversa (mencionada antes) y reemplazo de Manta 1.0 por Bst.X.
Los resultados se muestran en la figura 18, que es un gráfico de fluorescencia (unidades arbitrarias) frente al tiempo (minutos). El sombreado indica el perfil de temperatura durante el curso de la reacción. Las reacciones de control negativo no generaron ninguna señal de fluorescencia, mientras que las reacciones con diana de 10, 100 o 1000 copias generaron señal de fluorescencia por encima del umbral en cantidades de tiempo decrecientes (aproximadamente 3,5 minutos, 3,0 y 2,75 minutos respectivamente). Los resultados muestran que STAR podía amplificarse eficazmente a partir de una diana de ARN transcrito de forma inversa.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un método para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico no isotérmica, comprendiendo el método las etapas de:
(a) mezclar una secuencia diana con uno o más cebadores monocatenarios complementarios en condiciones que permitan un suceso de hibridación en el que los cebadores se hibridan con la diana, cuyo suceso de hibridación, directa o indirectamente, conduce a la formación de una estructura dúplex que comprende dos sitios de mella en o cerca de los extremos opuestos del dúplex; y llevar a cabo un procedimiento de amplificación al;
(b) producir una mella en cada uno de dichos sitios de mella en las cadenas del dúplex;
(c) usar una polimerasa para extender las cadenas melladas para así formar ácido nucleico recién sintetizado, cuya extensión con la polimerasa recrea los sitios de mella;
(d) repetir las etapas (b) y (c) según se desee para causar la producción de múltiples copias del ácido nucleico recién sintetizado;
caracterizado por que la temperatura a la que se lleva a cabo el método no es isotérmica, y se somete a una reducción de al menos 2°C durante el procedimiento de amplificación de las etapas (b)-(d), y en donde la temperatura de la reacción no vuelve a una temperatura predeterminada.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en la etapa (a) la diana comprende dos cadenas complementarias de ácido nucleico, y el cebador comprende cebadores directo e inverso que son cada uno complementario de una cadena respectiva de la diana, de modo que los extremos 3' de los cebadores directo e inverso están orientados unos hacia los otros.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la temperatura se somete a una reducción controlada de al menos 5°C, preferiblemente al menos 10°C, más preferiblemente al menos 15°C durante la reacción de amplificación, y en donde la tasa media de reducción de temperatura durante la reacción de amplificación está en el intervalo de -0,10 a -6,0°C min-1, preferiblemente de -0,20 a -3,5°C min-1, más preferiblemente de -0,30 a -3,5°C min-1, y lo más preferiblemente de -0,40 a -3,5°C min-1.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las etapas (b)-(d) se llevan a cabo sustancialmente inmediatamente después de la etapa (a), y en donde las etapas (a)-(d) se llevan a cabo preferiblemente en el mismo recipiente de reacción o en el mismo soporte sólido.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de 55-62°C, preferiblemente 57-61 °C, más preferiblemente 58-60°C.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de detectar, directa o indirectamente, el ácido nucleico recién sintetizado.
7. El método según la reivindicación 6, en donde dicha etapa de detección comprende el uso de una baliza molecular o un colorante fluorescente, una sonda marcada de flujo lateral o una enzima que cataliza una reacción electroquímica.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa (b) comprende el uso de una enzima de mellado.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende el uso de una primera polimerasa y/o una primera enzima de mellado que tiene una temperatura óptima, y una segunda polimerasa y/o una segunda enzima de mellado que tiene una temperatura óptima, en donde la temperatura óptima de la segunda polimerasa y/o segunda enzima de mellado es menor que la temperatura óptima de la respectiva primera polimerasa y/o primera enzima de mellado, y en donde la segunda polimerasa es preferiblemente polimerasa Bsu o fragmento Klenow de ADN polimerasa.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la temperatura inicial de la reacción de amplificación es igual o superior a la temperatura óptima de la primera enzima de mellado, y la temperatura se reduce durante el curso de la reacción de amplificación a una temperatura por debajo de la temperatura óptima de la primera enzima de mellado, y preferiblemente en donde la temperatura de la reacción de amplificación se reduce a, o por debajo de la temperatura óptima de la segunda polimerasa y/o segunda enzima de mellado.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de poner en contacto la mezcla obtenida llevando a cabo el método, con una enzima termolábil que degrada el ácido nucleico, poniendo en contacto la mezcla con la enzima termolábil a una temperatura a la que la enzima termolábil es sustancialmente activa, y en donde la enzima es preferiblemente uracil-ADN glicosilasa de bacalao (UDG) o UDG antártica termolábil.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa (a) está precedida por la realización de una etapa de transcripción inversa, que comprende poner en contacto un analito de ARN de interés con una transcriptasa inversa para así formar un transcrito de ADN del analito de ARN de interés, que comprende además opcionalmente la etapa de hacer ADN bicatenario a partir del transcrito de ADN.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una etapa de pre-amplificación o enriquecimiento.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde uno o más de los cebadores comprenden un nucleótido modificado, preferiblemente en donde el nucleótido modificado está en una parte del cebador complementaria de la diana.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde uno o más cebadores comprenden un nucleótido modificado en 2', preferiblemente un nucleótido modificado con 2' O-metilo, más preferiblemente una pluralidad de nucleótidos modificados con 2' O-metilo y lo más preferiblemente hasta siete nucleótidos modificados con 2' O-metilo.
16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la temperatura de la reacción durante las etapas (b)-(d) no vuelve a la temperatura a la que se lleva a cabo la etapa (a).
17. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde uno o más de los cebadores comprenden una parte autocomplementaria, cuya parte autocomplementaria típicamente forma una estructura de horquilla, y en donde dicha estructura de horquilla comprende preferiblemente de 5 a 10 pares de bases.
18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la magnitud de la reducción de temperatura durante las etapas (b)-(d) está en el intervalo de 8-20°C.
19. Aparato para llevar a cabo el método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo el aparato medio de regulación de temperatura y medio de control programables, estando programados el medio de control programable para hacer funcionar el medio de regulación de temperatura para realizar una reducción de temperatura de al menos 2°C, preferiblemente al menos 5°C, durante el procedimiento de amplificación de una mezcla de reacción usada para llevar a cabo el método, y en donde el medio de regulación de temperatura está programado para no volver a una temperatura predeterminada durante el procedimiento de amplificación.
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