KR102392010B1 - 핵산 증폭 방법의 개선 또는 핵산 증폭 방법과 관련한 개선 - Google Patents

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Abstract

비등온 핵산 증폭 반응의 수행 방법으로서, 상기 방법이 (a) 프라이머가 표적에 혼성화하는 혼성화 사건을 허용하는 조건에서 하나 이상의 상보적 단일 가닥 프라이머와 표적 서열을 혼합하는 단계로서, 혼성화 사건이 듀플렉스의 반대편 말단에 또는 그 가까이에 배치된 2개의 닉킹 부위를 포함하는 듀플렉스 구조의 형성을 직접적으로 또는 간접적으로 야기하는 단계; 및 (b) 듀플렉스의 가닥 내의 상기 닉킹 부위의 각각에서 닉을 야기하는 단계; (c) 중합효소를 사용하여 닉킹된 가닥을 연장시켜, 새로 합성된 핵산을 형성하는 단계로서, 중합효소를 사용한 연장이 닉킹 부위를 재생성하는 단계; (d) 단계 (b) 및 (c)를 원하는 대로 반복하여 다수의 카피의 새로 합성된 핵산의 생성을 야기하는 단계에 의해 증폭 과정을 수행하는 것을 포함하며; 상기 방법이 수행되는 온도가 비등온이며, 단계 (b) 내지 (d)의 증폭 과정 동안 적어도 2℃의 감소를 겪는 것을 특징으로 하는 방법이 개시된다.

Description

핵산 증폭 방법의 개선 또는 핵산 증폭 방법과 관련한 개선
본 발명은 핵산의 증폭 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 장치에 관한 것이다.
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 DNA의 증폭을 위해 처음으로 널리 사용된 시험관 내 방법이었다. 상기 기법은 매우 강력하지만, 증폭을 시행하기 위하여 반응 혼합물을 주기적인 온도 변화로 처리하는 열 사이클링 장치의 이용을 필요로 한다. 따라서, PCR은 특히 실험실 환경 외부에서, 예를 들어, 현장 진료(point-of-care; "PoC") 진단 장치의 환경에서 사용하기에 적합하지 않다.
이러한 단점을 부분적으로 극복하기 위하여, 수많은 상이한 등온 증폭 기법이 고안되었으며, 이는 열 사이클링에 대한 필요를 피하였다. 이러한 기법은 예를 들어, RNA의 신호 매개의 증폭 기술("SMART"; WO 99/037805호); 핵산 서열 기반의 증폭("NASBA" 문헌[Compton 1991 Nature 350, 91-92]); 회전환 증폭("RCA" 예를 들어, 문헌[Lizardi et al., 1998 Nature Genetics 19, 225-232] 참조); 루프-매개의 증폭("LAMP" 문헌[Notomi et al., 2000 Nucl. Acids Res. 28, (12) e63] 참조); 재조합효소 중합효소 증폭("RPA" 문헌[Piepenberg et al., 2006 PLoS Biology 4 (7) e204] 참조); 가닥 치환 증폭("SDA"); 헬리카제(helicase)-의존적 증폭("HDA" 문헌[Vincent et al., 2004 EMBO Rep. 5, 795-800]): 전사 매개의 증폭("TMA"), 단일 프라이머 등온 증폭("SPIA" 문헌[Kurn et al., 2005 Clinical Chemistry 51, 1973-81] 참조); 자가-유지 서열 복제("3SR"); 및 닉킹(nicking) 효소 증폭 반응("NEAR")을 포함한다.
SDA는 표적-상보적 부분, 및 표적-상보적 부분의 5', 엔도뉴클레아제에 대한 인식 및 절단 부위를 포함하는 한 쌍의 프라이머에 대해 업스트림의 한 쌍의 짧은 "범퍼(bumper)" 프라이머의 이용을 수반하는 기법(문헌[Walker et al., 1992 Nucl. Acids Res. 20, 1691-1696]에 의해 개시)이다. "범퍼" 프라이머는 프라이머 증폭을 위해 상보적 단일 가닥 표적을 생성함으로써 SDA 반응을 개시하는 것을 돕는다. 프라이머는 각각의 상보적 단일 가닥 표적 분자에 혼성화한다. 표적 가닥의 3' 말단은 주형으로서 프라이머를 사용하여 DNA 중합효소 및 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 반응 믹스를 사용하여 연장된다(마찬가지로, 프라이머의 3' 말단은 주형으로서 표적을 사용하여 연장된다).
표적 가닥의 연장에 의해, 엔도뉴클레아제를 위한 이중 가닥 인식 부위가 생성된다. 그러나, 표적이 변형된 트리포스페이트를 사용하여 연장되기 때문에, 엔도뉴클레아제는 두 가닥 모두를 절단하지 않고, 대신에, 프라이머에 단일 가닥 닉을 만든다. 이어서, 닉에서 3' 말단은 DNA 중합효소(전형적으로 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 중합효소 I의 클레나우 단편)에 의해 연장된다. 닉킹된 프라이머가 연장되므로, 그들은 초기에 생성된 연장 산물을 치환한다. 이어서, 치환된 산물은 그것이 본질적으로 반대편 프라이머에 대한 표적의 서열을 복제하기 때문에, 반대편 프라이머에 자유롭게 혼성화한다. 이러한 방식으로 표적 서열의 두 서열 모두의 지수적 증폭이 달성된다.
SDA 방법의 증폭 단계는 본질적으로 등온이며, 전형적으로 엔도뉴클레아제 및 중합효소에 대한 최적 온도인 37℃에서 수행된다. 그러나, 증폭 단계에 도달하기 전에, 이중 가닥 표적을 그의 구성 단일 가닥으로 완전하게 해리시켜, 프라이머의 쌍이 그들의 상보적 표적 가닥에 혼성화되게 하는 것이 필요하다.
이러한 해리 또는 "융해"는 보통 이중 가닥 표적을 고온, 보통 약 90℃로 가열하여, 표적의 2개의 가닥 사이의 수소 결합을 파단시킴으로써 달성된다. 이어서 반응 믹스를 냉각시켜, 증폭 반응에 필수적인 효소의 첨가를 가능하게 한다. 단일 가닥 표적을 생성하기 위하여 사용되는 고온 때문에, SDA 기법은 이상적으로 PoC 환경에 적합하지 않다.
미국 특허 제6,191,267호에는 N.BstNBI 닉킹 효소의 클로닝 및 발현, 및 제한 엔도뉴클레아제 및 변형된 트리포스페이트 대신에 SDA에서의 그의 이용이 개시되어 있다.
SDA와 유사한 또 다른 증폭 기법은 닉킹 효소 증폭 반응(또는 "NEAR")이다.
'NEAR'(예를 들어, US2009/0017453호 및 EP 2,181,196호에 개시된 바와 같음)에서, 정방향 및 역방향 프라이머(US 2009/0017453호 및 EP 2,181,196호에 "주형"으로 지칭)는 이중 가닥 표적의 각각의 가닥에 혼성화하며, 연장된다. 정방향 및 역방향 프라이머의 추가의 카피(과잉으로 존재)는 반대편 프라이머의 연장 산물에 혼성화하며, 그들 자체가 연장되어, "증폭 듀플렉스"를 생성한다. 그렇게 형성된 각각의 증폭 듀플렉스는 각 가닥의 5' 말단을 향한 닉킹 부위를 포함하며, 이는 닉킹 효소에 의해 닉킹되어, 추가의 연장 산물의 합성을 가능하게 한다. 한편, 이전에 합성된 연장 산물은 추가의 카피의 상보적인 프라이머와 혼성화하여, 프라이머가 연장되게 하고, 그에 의해, 추가의 카피의 "증폭 듀플렉스"를 생성할 수 있다. 이러한 방식으로, 지수적 증폭이 달성될 수 있다.
NEAR은 특히 "범퍼" 프라이머 및 초기 열 해리 단계가 필요하지 않다는 점에서 SDA와 상이하다. 표적이 여전히 실질적으로 이중 가닥인 동안 증폭 과정을 촉발시키는데 필요한 초기 프라이머/표적 혼성화 사건이 일어난다: 초기 프라이머/표적 혼성화가 표적 가닥의 국소화된 해리 - "브리딩(breathing)"으로 알려져 있는 현상을 이용하는 것으로 여겨진다(문헌[Alexandrov et al., 2012 Nucl. Acids Res] 및 문헌[Von Hippel et al., 2013 Biopolymers 99 (12), 923-954]에 의한 검토 참조). 브리딩은 DNA의 가닥 사이의 염기 쌍형성의 국소화된 일시적인 풀림이다. 초기 프라이머/표적 헤테로듀플렉스의 융해 온도(Tm)는 전형적으로 반응 온도보다 훨씬 더 낮으므로, 프라이머가 해리되는 경향이 있지만, 일시적인 혼성화는 중합효소가 프라이머를 연장시키기에 충분히 오래 지속되며, 이는 헤테로듀플렉스의 Tm을 증가시키고, 그것을 안정화시킨다.
NEAR에서 증폭 단계는 일정 온도에서 등온으로 수행된다. 실제로, 초기 표적/프라이머 혼성화 및 이후의 증폭 라운드 둘 모두를 동일한 일정 온도, 보통 54℃ 내지 56℃에서 수행하는 것이 일반적이다.
열 사이클링에 대한 필요를 피하는 것은 등온 기법이 PoC 환경에서 PCR보다 잠재적으로 더 유용한 것을 의미한다. 또한, 심지어 매우 낮은 카피 수의 표적 분자(예를 들어, 10개 만큼 적은 이중 가닥 표적 분자)로부터 시작하는 경우에도 유의미한 양의 증폭 산물의 합성이 달성될 수 있다.
WO 2011/030145호(이니그마 디아그노스틱스 리미티드(Enigma Diagnostics Limited))에는 반응이 초기에 소정의 온도에서 수행되며, 온도가 소정의 온도로부터 높게 또는 낮게 벗어나도록 한 다음, 온도가 증폭 반응 동안 적어도 1회 소정의 온도로 복귀되게 하는 온도 변동의 조건 하에 수행되는 "등온" 핵산 증폭 반응이 개시되어 있다. 더욱 전형적으로, 온도는 소정의 온도로부터 약간(약 5℃) 높게 그리고 낮게 동요"(wobble)"되게 한다.
본 발명은 특히, 예를 들어, 감소된 반응 시간 및/또는 증가된 수율 및/또는 감소된 비-특이적 증폭 산물을 포함하는, 기존의 기법에 비한 하나 이상의 이점을 갖는 개선된 핵산 증폭 기법을 제공하는 것이 목적이다.
제1 양태에서, 본 발명은 비등온 핵산 증폭 반응의 수행 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 표적 서열을 프라이머가 표적에 혼성화하는 혼성화 사건을 허용하는 조건에서 하나 이상의 상보적 단일 가닥 프라이머와 혼합하는 단계로서, 혼성화 사건이 듀플렉스의 반대편 말단에 또는 그 가까이에 배치된 2개의 닉킹 부위를 포함하는 듀플렉스 구조의 형성을 직접적으로 또는 간접적으로 야기하는 단계; 및
(b) 듀플렉스의 가닥 내의 상기 닉킹 부위의 각각에서 닉을 야기하는 단계
(c) 중합효소를 사용하여 닉킹된 가닥을 연장시켜, 새로 합성된 핵산을 형성하는 단계로서, 중합효소를 사용한 연장이 상기 닉킹 부위를 재생성하는 단계;
(d) 단계 (b) 및 (c)를 원하는 대로 반복하여 다수의 카피의 새로 합성된 핵산의 생성을 야기하는 단계에 의해 증폭 과정을 수행하는 것을 포함하며,
상기 방법이 수행되는 온도가 비등온이며, 단계 (b) 내지 (d)의 증폭 과정 동안 적어도 2℃, 바람직하게는 적어도 5℃의 감소를 겪는 것을 특징으로 한다.
제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태의 방법을 수행하기 위한 장치를 제공하며, 상기 장치는 온도 조절 수단 및 프로그래밍 가능한 제어 수단을 포함하며, 프로그래밍 가능한 제어 수단은 제1 양태의 방법을 수행하기 위해 사용되는 반응 혼합물의 증폭 과정 동안 적어도 2℃, 바람직하게는 적어도 5℃의 온도 감소를 수행하기 위하여 온도 조절 수단을 작동시키도록 프로그래밍된다.
본 발명의 방법의 증폭 과정은 SDA 및 NEAR을 포함하는 일반적으로 알려져 있는 통상의 증폭 기법에 적용될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 증폭 과정은 가닥 치환 증폭에 사용되는 증폭 과정에 기초하거나, NEAR 또는 실제로 단일 가닥 닉의 생성 및 닉킹된 가닥의 3' 말단으로부터의 이후의 연장에 의존하는 임의의 다른 핵산 증폭 과정에 사용되는 증폭 과정에 기초할 수 있다. 따라서, SDA 또는 NEAR의 증폭 단계에 관한 종래 기술의 교시는 일반적으로 본 발명의 방법의 증폭 과정에 동일하게 적용 가능할 것이다(증폭 동안 일정 온도의 유지에 관한 종래 기술의 교시 제외).
바람직하게는, 단계 (a)는 이중 가닥 표적을 함유하는 시료를 2개의 단일 가닥 프라이머와 혼합하는 것을 포함하며, 상기 프라이머 중 하나는 표적의 제1 가닥에 상보적이며, 상기 프라이머 중 다른 것은 표적의 제2 가닥에 상보적이어서, 2개의 프라이머가 표적에 혼성화되고, 상기 프라이머의 유리 3' 말단이 서로를 향하게 된다.
2개의 프라이머는 편리하게 '정방향' 및 '역방향' 프라이머로 기재될 수 있다.
바람직하게, 정방향 및 역방향 프라이머 둘 모두는 닉킹 효소 인식 부위의 서열을 포함할 것이다. 전형적으로 닉킹 효소에 의해 생성된 닉은 닉킹 효소 인식 부위의 바로 외측이며, 전형적으로 이의 3'일 것이다.
바람직한 구현예에서, 정방향 프라이머는 그의 3' 말단에 또는 그 가까이에, 표적 서열 안티센스 가닥의 3' 말단에 상보적이며, 이와 혼성화할 수 있는 부분을 포함할 것이며, 역방향 프라이머는 그의 3' 말단에 또는 그 가까이에, 표적 서열 센스 가닥의 3' 말단에 상보적이며, 이와 혼성화할 수 있는 부분을 포함한다.
이러한 방식으로, 닉킹 효소 인식 부위는 표적 서열의 반대편 말단에 도입되며, (닉 부위의 다운스트림의 프라이머의 임의의 개재 서열과 함께) 표적 서열의 증폭은 본질적으로 예를 들어, 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 US 2009/0017453호에 개시된 바와 같이, 정방향 및 역방향 프라이머의 다수의 사이클의 중합효소 연장을 수행하여, 이중 가닥 닉 부위를 형성하고, 닉킹 효소로의 닉 부위의 닉킹에 의해, 중합효소 등에 의한 닉킹된 프라이머의 추가의 연장을 가능하게 함으로써 달성된다.
본 발명은 특히, 선택된 표적 핵산의 증폭 방법에 관한 것이다.
표적은 단일 가닥, 이중 가닥 또는 둘의 혼합물을 포함할 수 있다. 표적은 RNA, DNA 또는 둘의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히, 표적은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 트리포스페이트(즉, 천연 발생 핵산에 보통 관찰되지 않는 뉴클레오티드 트리포스페이트)를 혼입할 수 있지만, 이것은 필수적이지 않으며, 실제로 바람직하지 않다.
표적은 하기의 비-포괄적인 목록으로부터 선택될 수 있다: 게놈 핵산(이 용어는 임의의 동물, 식물, 진균, 박테리아 또는 바이러스의 게놈 핵산을 포함함), 플라스미드 DNA, 미토콘드리아 DNA, cDNA, mRNA, rRNA, tRNA 또는 합성 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산 분자.
특히, 상기 방법은 초기 역전사 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, RNA(예를 들어, 바이러스 게놈 RNA 또는 세포 mRNA, 또는 몇몇의 다른 공급원으로부터의 RNA)를 사용하여 해당 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있는 방법에 의해 역전사효소를 사용하여 DNA 또는 cDNA를 합성할 수 있다. 이어서, DNA는 본 발명의 방법에서 표적 서열로 사용될 수 있다. 원래의 RNA는 전형적으로 역전사효소의 리보뉴클레아제 활성에 의해 분해될 것이지만, 원한다면, 역전사가 완료된 후에 추가의 RNAse H를 첨가할 수 있다. RNA 분자는 종종 상응하는(예를 들어, 게놈) DNA 서열보다 더 큰 카피수로 시료에 존재하므로, DNA 서열의 카피수를 효율적으로 증가시키기 위하여 RNA 분자로부터 DNA 전사물을 제조하는 것이 편리할 수 있다.
"표적 서열"은 표적 핵산 내의 염기의 서열이며, 이중 가닥 표적의 센스 및/또는 안티센스 가닥을 지칭할 수 있으며, 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 초기 표적 핵산의 증폭된 카피, 연장 산물 또는 증폭 산물에서 재현되거나 복제되는 것과 동일한 염기 서열을 포함한다.
표적 서열은 임의의 종류의, 예를 들어, 생물학적 또는 환경적 시료(물, 공기 등)에 존재할 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들어, 식품 시료 또는 임상 시료일 수 있다. 임상 시료는 하기를 포함할 수 있다: 소변, 타액, 혈액, 혈청, 혈장, 점액, 객담, 누액 또는 대변.
시료는 프라이머와 접촉시키기 전에 처리를 겪을 수 있거나, 처리를 겪지 않을 수 있다. 이러한 처리는 여과, 농축, 부분-정제, 초음파분해, 용해 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 과정은 해당 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있다.
본 발명의 방법은 닉 부위 및 닉 부위에서 닉을 생성하기 위한 수단의 이용을 수반한다. "닉"은 완전히 또는 적어도 부분적으로 이중 가닥인 핵산 분자의 단지 한 가닥만의 포스포디에스테르 백본의 절단이다. 닉 부위는 닉이 이루어지는 분자 내의 위치이다.
바람직한 구현예에서, "닉킹 인식 부위"는 닉 부위에, 그 내에 또는 그 가까이에 존재할 것이다. (이러한 맥락에서 "그 가까이에"는 닉킹 인식 부위의 가장 가까운 염기가 닉 부위의 10개 염기 이내, 바람직하게는 닉 부위의 5개 염기 이내임을 의미한다).
닉킹 인식 부위는 제한 엔도뉴클레아제의 인식 부위의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있으며, 닉 부위는 이중 가닥 분자로서 존재하는 경우 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 핵산 염기 서열의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 전형적으로, 제한 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 분자의 두 가닥 모두를 절단할 것이다. 본 발명에서, 이중 가닥 파단은 닉 부위에서의 또는 그 가까이의 하나 이상의 변형된 염기의 혼입에 의해 회피될 수 있으며, 이 변형된 염기는 핵산의 한 가닥이 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 민감하지 않게 한다. 이러한 방식으로 통상 이중 가닥 핵산 분자의 두 가닥 모두를 절단하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 단일 가닥 닉을 이중 가닥 분자 내로 도입할 수 있다. 이를 달성하기에 적합한 변형된 염기 등은 해당 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있으며, 예를 들어, 모든 알파 포스페이트 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 알파 보라노 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트, 구체적으로; 2'-데옥시아데노신 5'-O-(티오트리포스페이트), 5-메틸데옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-데옥시우리딘 5'트리포스페이트, 7-데아자-2'데옥시구아노신 5'-트리포스페이트, 2'데옥시구아노신-5'-O-(1-보라노트리포스페이트) 등을 포함한다. 변형된 염기를 포함하는 트리포스페이트는 증폭 과정를 수행하기 위해 사용되는 반응 혼합물 내에 존재하여, 변형된 염기가 이후의 증폭 라운드 동안 관련 위치에 혼입되게 하여, 엔도뉴클레아제에 의해 절단 가능한 부위의 형성을 방지할 수 있다.
그러나, 바람직한 구현예에서, 닉은 닉킹 효소에 의해 닉 부위에서 이루어진다. 이들은 보통의 환경 하에서 이중 가닥 핵산 분자 내에 오직 단일 가닥 파단부만을 만드는 효소이다. 닉킹 효소는 닉킹 인식 부위를 가지며, 닉 부위는 닉킹 인식 부위 내에 존재하거나, 인식 부위의 5' 또는 3'에 존재할 수 있다. 많은 닉킹 효소는 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있으며, 상업적으로 입수 가능하다. 닉킹 효소의 예의 비-포괄적인 목록은 하기를 포함한다: Nb.Bsml, Nb.Bts, Nt.Alwl, Nt.BbvC, Nt.BstNBI 및 Nt.Bpu101. 후자의 효소는 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)으로부터 상업적으로 입수 가능하며; 다른 것들은 예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 입수 가능하다.
바람직한 구현예에서, 닉킹 효소는 방법의 시작에(예를 들어, 시료와 프라이머 및 DNA 중합효소의 접촉 1분 이내에) 반응 혼합물 내로 도입된다. 그러나, 일부 예에서, (예를 들어, 온도가 닉킹 효소의 최적 온도에 더 가깝게 떨어지게 하기 위하여) 더 긴 지연 후에 닉킹 효소를 반응 혼합물 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법은 DNA 중합효소의 이용을 수반한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 고온성 DNA 중합효소(즉, 60℃ 초과의 최적 온도를 가짐)의 이용을 포함한다. 바람직하게는, DNA 중합효소는 가닥 치환 중합효소이다. 바람직하게는, DNA 중합효소는 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는다. 바람직하게는 DNA 중합효소는 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 가닥 치환 중합효소이며, 바람직하게는 또한 고온성이다.
바람직한 DNA 중합효소의 예에는 Bst 중합효소, Vent® DNA 중합효소, 9oN 중합효소, Manta 1.0 중합효소(퀴아젠(Qiagen)), BstX 중합효소(퀴아젠) 및 Bsm DNA 중합효소, 거대 단편(써모피셔 사이언티픽)이 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 편리하게 사전증폭 또는 농축 단계를 포함할 수 있다. 이것은 표적 서열을 정방향 및 역방향 프라이머 및 DNA 중합효소와 접촉시키지만, 닉킹 효소와는 접촉시키지 않는 단계이다. 이것은 전형적으로 약 2분 내지 5분 동안 지속되며, 약 1,000배의 표적 서열의 초기(선형) 증폭을 야기하며, 이는 표적 서열이 낮은 카피수로 시료에 존재하는 경우에 특히 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 사전증폭 또는 농축 단계를 50℃ 미만의 온도에서 중온성 DNA 중합효소, 예를 들어, 엑소-마이너스(Exo-Minus) 클레나우(Klenow) DNA 중합효소 또는 케나르카이움 심비오숨(Cenarchaeum symbiosum)으로부터의 엑소-마이너스 저온성 DNA 중합효소를 사용하여 수행한 후에, 혼합물을 50℃를 초과하여 가열하여, 열불안정성 DNA 중합효소를 변성시키거나 불활성화시킨 다음, 고온성 DNA 중합효소를 다운스트림 증폭을 위하여 첨가한다.
전형적으로, 본 발명의 방법은 증폭 과정의 직접적인 또는 간접적인 산물 중 하나 이상이 검출되고 임의로 정량화되는 검출 단계를 포함하며, 이는 시료 중 표적의 존재 및/또는 양을 나타낸다. 하기를 포함하는 알려져 있는 매우 많은 적합한 검출 및/또는 정량화 기법이 존재한다: 겔 전기영동, 질량 분석법, 측방 유동 포획(lateral flow capture), 표지된 뉴클레오티드, 끼어들기 염료, 분자 비콘(molecular beacon) 및 특히 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산 함유 분자에 특이적으로 혼성화하는 다른 프로브의 혼입.
검출 단계에서 검출되는 산물 또는 산물들은 본원에서 "검출 표적"으로 지칭될 수 있다. 검출 단계와 관련하여 '표적'은 증폭 과정에서의 '표적'과 본질적으로 동일하지 않으며, 실제로 2개의 분자는 통상 적어도 어느 정도 상이할 것이지만, 그들은 일부 공통 서열(전형적으로, 10 내지 20개 염기)을 가질 수 있으며, 검출 표적은 핵산 분자 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
핵산 검출 방법은 이중 가닥 DNA의 특이적인 검출을 가능하게 하는 염료의 이용을 채용할 수 있다. DNA 또는 RNA로의 결합 시에 향상된 형광을 나타내는 끼어들기 염료는 널리 알려져 있다. 염료는 예를 들어, DNA 또는 RNA 끼어들기 형광단일 수 있으며, 특히 하기의 것을 포함할 수 있다: 아크리딘 오렌지(acridine orange), 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 피코 그린(Pico Green), 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide), SYBR I, SYBR II, SYBR 골드(Gold), TOTO-3(티악솔 오렌지(thiaxole orange) 이량체) 올리 그린(Oli Green) 및 YOYO(옥사졸 옐로우(oxazole yellow) 이량체).
또한, 핵산 검출 방법은 검출 표적 서열 내로 또는 관심 검출 표적에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 서열을 함유하는 프로브 내로 직접 혼입되는 표지된 뉴클레오티드의 이용을 채용할 수 있다. 적합한 표지는 방사성 및/또는 형광일 수 있으며, 해당 분야에 통상적인 임의의 방식으로 분석될 수 있다. 검출될 수 있지만, 다르게는 고유 뉴클레오티드로서 기능하는(예를 들어, 천연 효소에 의해 인식되고, 이에 대한 기질로서 작용할 수 있는) 표지된 뉴클레오티드는 고유 뉴클레오티드로서 기능하지 않는 변형된 뉴클레오티드와 구별되어야 한다.
표적 핵산 및 핵산 서열의 존재 및/또는 양은 분자 비콘을 사용하여 검출되고 모니터링될 수 있다. 분자 비콘은 한 말단에 형광단을 함유하고, 반대편 말단에 소광 염료("소광체(quencher)")를 함유하는 헤어핀 형상의 올리고뉴클레오티드이다. 헤어핀의 루프는 검출 표적 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 프로브 서열을 함유하며, 스템은 프로브 서열의 어느 한 측에 위치한 자가-상보적이거나 실질적으로 자가-상보적인 서열의 어닐링에 의해 형성된다.
형광단 및 소광체는 비콘의 반대편 말단에 결합된다. 분자 비콘이 그의 표적으로 혼성화되는 것을 방지하는 조건 하에서 또는 분자 비콘이 용액 중에 유리되어 존재하는 경우, 형광단 및 소광체는 서로 가까이에 있어, 형광을 방지한다. 분자 비콘이 검출 표적 분자와 접하는 경우, 혼성화가 발생하며; 루프 구조는 안정한, 더욱 강성인 입체형태로 전환되어, 형광단 및 소광체의 분리를 야기하여, 형광이 발생하게 한다(문헌[Tyagi et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 303-308]). 프로브의 특이성으로 인하여, 형광의 생성은 실질적으로 배타적으로 의도된 증폭된 산물/검출 표적의 존재 때문이다.
분자 비콘은 고도로 특이적이며, 단일의 염기가 상이한 핵산 서열(예를 들어, 단일 뉴클레오티드 다형)을 구별할 수 있다. 분자 비콘은 상이한 색상의 형광단 및 상이한 검출 표적 상보적 서열과 함께 합성되어, 몇몇의 상이한 검출 표적이 동일한 반응에서 검출되고/거나 동시에 정량화되게 하여, 복수의 상이한 병원체 또는 생화학적 마커를 검출하기 위하여 단일의 PoC 검정의 "다중화"를 가능하게 한다. 정량적 증폭 과정에 있어서, 분자 비콘은 증폭 후에 증폭된 검출 표적에 특이적으로 결합할 수 있으며, 비-혼성화된 분자 비콘이 형광이 아니기 때문에, 증폭된 산물의 양을 정량적으로 결정하기 위하여 프로브-표적 혼성물을 분리하는 것이 필요하지 않다. 생성된 신호는 증폭된 산물의 양에 비례한다. 이것은 실시간으로 행해질 수 있다. 다른 실시간 형식과 같이, 구체적인 반응 조건을 각 프라이머/프로브 세트에 대하여 최적화시켜, 정확도 및 정밀도를 보장해야 한다.
또한, 검출 표적 핵산 및 핵산 서열의 생성 또는 존재는 형광 공명 에너지 전이(FRET)에 의해 검출되고 모니터링될 수 있다. FRET는 2개의 형광단: 공여자 및 수용자 분자 사이의 에너지 전이 메커니즘이다. 약술하면, 공여자 형광단 분자는 특정 여기 파장에서 여기된다. 공여자 분자가 그의 기저 상태로 돌아가는 경우, 공여자 분자로부터의 이후의 방출은 (장거리 쌍극자-쌍극자 상호작용을 통해) 여기 에너지를 수용자 분자로 전이시킬 수 있다. FRET는 예를 들어, 분자 비콘에서 관찰되는 바와 같은 DNA-DNA 상호작용에서 분자 역학을 정량화하기 위한 유용한 도구이다. 특정 산물의 생성을 모니터링하기 위하여, 프로브는 한 말단에서 공여자 분자로, 그리고 다른 말단에서 수용자 분자로 표지될 수 있다. 프로브-검출 표적 혼성화는 공여자 및 수용자의 거리 또는 배향의 변화를 가져오며, FRET 특성의 변화가 관찰된다(문헌[Joseph R. Lakowicz. "Principles of Fluorescent Spectroscopy", Plenum Publishing Corporation, 2nd edition (July 1, 1999)]).
또한, 검출 표적 핵산의 생성 또는 존재는 측방 유동 디바이스에 의해 검출되고 모니터링될 수 있다. 측방 유동 디바이스는 널리 알려져 있다. 이들 디바이스는 일반적으로 유체가 모세관력에 의해 유동하는 고체상 유체 투과성 유로를 포함한다. 예는 딥스틱(dipstick) 검정 및 다양한 적절한 코팅이 있는 박층 크로마토그래피 플레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 시료를 위한 다양한 결합 시약, 결합 파트너 또는 시료를 위한 결합 파트너를 포함하는 컨쥬게이트 및 신호 생성 시스템이 유로 내에 또는 유로 상에 고정화된다. 분석물의 검출은 효소 검출, 나노-입자 검출, 비색 검출 및 형광 검출을 포함하는 몇몇의 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 효소 검출은 측방 유동 디바이스의 표면 상의 상보적이거나 실질적으로 상보적인 핵산 검출 표적에 혼성화되는 효소-표지된 프로브를 포함할 수 있다. 생성되는 복합체를 적절한 마커로 처리하여, 판독 가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 나노입자 검출은 콜로이드성 금, 라텍스 및 상자성 나노입자를 사용할 수 있는 비드 기술을 포함한다. 일 예에서, 비드는 항-비오틴 항체에 컨쥬게이트될 수 있다. 표적 서열은 직접 비오티닐화될 수 있거나, 표적 서열은 서열 특이적 비오티닐화 프로브에 혼성화될 수 있다. 금 및 라텍스는 육안으로 보이는 비색 신호를 야기하며, 상자성 입자는 자기장에서 여기되는 경우 비-가시적인 신호를 야기하며, 특수 판독기에 의해 해석될 수 있다.
또한, 형광-기반의 측방 유동 검출 방법, 예를 들어, 이중 플루오레세인 및 비오틴-표지된 올리고 프로브 방법 또는 양자점의 이용이 알려져 있다.
또한, 핵산은 측방 유동 디바이스 상에 포획될 수 있다. 포획의 수단은 항체 의존적 및 항체 독립적 방법을 포함할 수 있다. 항체-독립적 포획은 일반적으로 2개의 결합 파트너 간의 비-공유 상호작용, 예를 들어, 비오티닐화된 프로브와 스트렙트아비딘 포획 분자 사이의 높은 친화성 및 비가역적인 결합을 이용한다. 포획 프로브는 측방 유동 막 상에 직접 고정화될 수 있다.
본 발명의 전체 방법 또는 적어도 상기 방법의 증폭 과정 부분은 반응 용기(예를 들어, 에펜도르프(Eppendorf)®로부터의 통상의 실험실 플라스틱 시약 튜브)에서 수행되거나, 고체 지지체 내에서 및/또는 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다. 고체 지지체는 다공성 또는 비-다공성일 수 있다. 특정 구현예에서, 고체 지지체는 다공성 막 물질(예를 들어, 니트로셀룰로스 등)을 포함할 수 있다. 더욱 특히, 고체 지지체는 상기 기재된 바와 같이 다공성 측방 유동 검정 디바이스를 구성하거나, 이의 일부를 형성할 수 있다. 대안적으로, 고체 지지체는 미세유체-형 검정을 구성하거나, 이의 일부를 형성할 수 있으며, 하나 이상의 단단한 좁은-구경의 모세관을 이용하여, 검정 디바이스를 따라 액체를 수송한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법의 전부 또는 적어도 일부는 현장 진료(PoC) 검정 디바이스를 사용하여 수행될 수 있다. PoC 디바이스는 전형적으로 하기의 특징을 갖는다: 이는 제조하기에 저렴하며, 일회 사용 후에 제거되며, 일반적으로 자체-포함되어, 검정을 수행하거나 해석하기 위하여 임의의 다른 장치 또는 장비를 필요로 하지 않고, 바람직하게는 사용하기 위하여 임상 지식 또는 훈련을 필요로 하지 않는다.
본 발명에 사용하기에 적합한 프라이머의 예는 본원에 개시되어 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합할 수 있는 다른 예는 특히 US 2009/0017453호 및 EP 2,181,196호에 개시되어 있으며, 이의 둘 모두의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 해당 분야의 숙련자는 과도한 실험 없이 다른 표적 서열의 증폭에 적합한 다른 프라이머를 용이하게 설계할 수 있을 것이다.
다른 곳에 설명된 바와 같이, 본 발명에 사용되는 프라이머는 바람직하게는 표적 상보적 부분뿐만 아니라, 닉킹 엔도뉴클레아제 결합 부위 및 닉킹 부위, 및 안정화 부분도 포함할 것이다. 바람직한 프라이머는 프라이머 분자에 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 자가-상보적 서열을 함유할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 프라이머는 변형된 뉴클레오티드(즉, 천연 발생 핵산 분자에서 관찰되지 않는 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 이러한 변형된 뉴클레오티드는 편리하게 프라이머의 표적 상보적 부분 및/또는 프라이머 내의 다른 곳에 존재할 수 있다. 많은 다른 변형된 뉴클레오티드가 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있지만, 변형된 뉴클레오티드의 바람직한 예에는 2'-변형된 뉴클레오티드, 특히 2'O-메틸 변형된 뉴클레오티드가 있다.
온도 프로파일
본 발명의 방법은 등온이 아니지만 열 사이클링을 필요로 하지 않는다. 결과적으로, 본 발명의 방법은 PCR에서 사용되는 비교적 복잡한 열 사이클링 장치의 사용을 필요로 하지 않고, 이에 따라 PoC 환경에서의 적용을 더욱 용이하게 한다.
"열 사이클링" 또는 온도 사이클링은 특히, 반응 혼합물의 온도가 특정 기간(전형적으로 적어도 30초) 동안 특정 온도(t1으로 기재)로 유지되는 것을 의미한다. 이어서, 온도가 (높게 또는 낮게) 조정된 후에, 이전에 유지된 온도로 복귀된다.
전형적으로 비등온 핵산 증폭 반응, 예를 들어, PCR은 사이클마다 다수의 열 단계(즉, 적어도 2개 이상) 및 반응마다 다수의 열 사이클의 수행을 필요로 한다.
본 발명의 방법에서 온도 감소는 온도 감소의 세기가 소정의 최소 수준 초과이며, 소정의 최대 수준 미만인 점에서 의도적이며 제어된다. 또한, 온도 감소 속도는 바람직하게는 소정의 범위 이내이다.
본 발명의 방법에서 초기 단계 (a)는 프라이머가 표적에 혼성화되게 하는 조건 하에서 적어도 한 부분이 표적 서열에 상보적인 프라이머와 표적 서열을 적어도 일시적으로 접촉시키는 것을 포함한다. 이것은 "개시" 단계로 기재될 수 있다.
이러한 단계는 전형적으로 50℃ 내지 65℃ 범위, 바람직하게는 52℃ 내지 62℃, 더욱 바람직하게는 54℃ 내지 62℃, 가장 바람직하게는 58℃ 내지 62℃ 범위의 온도에서 달성된다. 표적 및 프라이머를 포함하는 반응 혼합물은 적합한 기간 동안 이러한 온도로 유지될 수 있다. 최적 온도 및 반응 혼합물이 이러한 온도로 유지되는 최적의 기간은 본 발명의 이점을 고려하여 해당 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있으며, 이들은 표적 서열의 길이, 프라이머의 길이 - 특히 표적에 상보적인 프라이머의 부분의 길이, 표적:프라이머 혼성물의 G:C 함량, 반응 혼합물의 pH 및 염 농도와 같은 파라미터에 의해 영향을 받을 수 있다. 전형적인 초기 온도 유지 시간은 5초 내지 5분, 바람직하게는 10초 내지 3분의 범위일 수 있다. 단계 (a)에서 초기 혼성화 사건을 가능하게 하는 전형적인 조건은 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있을 것이며, 첨부된 실시예에 기재되어 있다.
58℃ 내지 62℃의 온도 범위가 개시 단계에 바람직하다. 이것은 프라이머 이량체의 형성을 최소화시키고(이에 따라, 비-특이적 증폭의 양을 감소시키고), 표적 듀플렉스에서 잠재적인 "개시 부위"의 생성 확률을 증가시키기에 충분히 높으면서, 프라이머 분자의 적어도 일부가 표적에 혼성화되게 하기에 충분히 낮은 것으로 여겨진다.
이후의 온도의 감소는 원래의 표적 분자로의 프라이머의 혼성화보다는 비교적 짧은 프라이머와 연장 산물의 혼성화를 안정화시키는 것을 돕는다. 반응 혼합물의 추가의 냉각이 검출 표적으로의 검출 프로브의 혼성화를 용이하게 하는 것이 추가로 가정된다.
상기 방법의 단계 (b) 내지 (d)에서 시작된 증폭 과정 동안, 반응 혼합물의 온도는 감소된다. 이는 조절된 방식으로, 예를 들어, 반응 믹스의 온도를 소정의 온도 프로파일에 따라 감소시키기 위한 온도 조절 수단을 사용하여 행해질 수 있다. 온도 감소는 개시 단계(단계 a) 직후에 시작할 수 있다. 반응 믹스의 부피가 작아서, 반응 믹스(및 반응 용기 또는 반응이 위에서 또는 안에서 수행되는 기재)의 열용량이 감소되게 하는 것이 유리하다.
편리하게, 반응 믹스는 100 ㎕ 미만, 바람직하게는 50 ㎕ 미만, 더욱 바람직하게는 25 ㎕ 미만, 가장 바람직하게는 20 ㎕ 미만의 부피를 갖는다. 이러한 방식으로, 반응 믹스의 온도는 온도 조절 수단에 의해 더욱 정확하고 더욱 신속하게 조절될 수 있다. 적합한 구현예에서, 온도 조절 수단은 매우 단순하거나(예를 들어, 팬(fan)), 수동 수단(예를 들어, 반응 혼합물로부터의 열 방사선)에 의해 주로 또는 전체적으로 달성되는 충분한 냉각으로 전체적으로 제공될 수 있다. 전형적으로, 반응 믹스 부피는 1 ㎕ 내지 50 ㎕, 바람직하게는 1 ㎕ 내지 20 ㎕, 더욱 바람직하게는 1 ㎕ 내지 10 ㎕의 범위일 수 있다.
반응 믹스 부피는 10 ㎕ 미만일 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 시료를 희석하고, 병행하여 처리되는 다수의(통상 수백, 수천 또는 심지어 백만개의) 분취물로 나누는 "디지털 PCR"-유형 접근법(문헌[Morley 2014 Biomolecular Detection and Quantification 1, 1-2]에 의한 검토 참조)을 채용할 수 있으며: 분취물의 일부는 표적 서열을 함유할 것이며, 일부는 그렇지 않을 것이고: 표적 서열이 존재하지 않는다면, 신호가 생성되지 않는다. 음성 분취물의 비를 사용하여 원래의 시료 내의 표적 서열의 수 및/또는 농도를 추론할 수 있다. 이러한 구현예에서, 각 분취물 내의 반응 믹스 부피는 매우 작을 수 있지만, 전형적으로 최소 부피는 2500 nl, 바람직하게는 적어도 50 ㎕일 것이다.
온도는 임의의 원하는 프로파일로 감소될 수 있다. 예를 들어, 온도는 실질적으로 선형의 프로파일에 따라 감소되거나(즉, 본질적으로 일정한 온도 감소 속도 사용), 곡선 또는 단계식 방식, 또는 선형 및 비선형 프로파일의 임의의 조합(예를 들어, 상대적으로 높은 온도 감소 속도의 기간과 교대하는, 0이거나 상대적으로 낮을 수 있는 일정한 온도 감소 속도의 하나 이상의 기간)을 포함하는 임의의 비선형 방식으로 감소될 수 있다.
본 발명에 따른 반응의 온도 프로파일은 반응의 온도가 "개시" 단계가 수행되는 온도로 복귀되지 않게 한다. 따라서, 본 발명의 방법에서, 예를 들어, WO 2011/030145호의 개시내용에 반하여 소정의 온도에 관한 변동이 존재하지 않으며, 소정의 온도로의 "복귀"가 존재하지 않는다.
증폭 과정의 시작 시에 반응 믹스의 온도는 전형적으로 단계 (a)에서의 온도, 예를 들어, 바람직하게는 54℃ 내지 62℃, 가장 바람직하게는 58℃ 내지 62℃와 동일할 것이다. 증폭 과정 동안 온도는 적어도 2℃, 바람직하게는 적어도 3℃, 4℃ 또는 5℃, 더욱 바람직하게는 적어도 8℃, 9℃ 또는 10℃, 가장 바람직하게는 적어도 13℃, 14℃ 또는 15℃ 떨어지지만, 바람직한 온도 강하의 세기는 절대적으로 증폭 과정의 시작 시의 선택된 초기 온도에 적어도 부분적으로 좌우될 수 있으며, 더 낮은 초기 온도(예를 들어, 45℃ 내지 55℃ 범위)가 더 낮은 온도 강하 및/또는 더 낮은 온도 감소 속도를 나타낼 수 있는 것이 인식될 것이다. 전형적으로, 증폭 과정 동안의 최대 온도 감소 세기는 약 20℃이지만, 최대 온도 감소는 이것보다 낮거나(예를 들어, 16℃, 17℃, 18℃ 또는 19℃) 높을(예를 들어, 25℃ 또는 30℃) 수 있는 것이 인식될 것이다.
바람직한 구현예에서, 증폭 과정 동안 반응 믹스의 온도 감소의 세기는 5℃ 내지 40℃ 범위, 바람직하게는 8℃ 내지 35℃의 범위, 더욱 바람직하게는 8℃ 내지 30℃의 범위 또는 심지어 8℃ 내지 25℃, 가장 바람직하게는 8℃ 내지 20℃의 범위일 수 있다. 증폭 과정의 시작 시의 반응 혼합물의 전형적인 초기 온도는 50℃ 내지 62℃의 범위, 바람직하게는 54℃ 내지 62℃, 더욱 바람직하게는 56℃ 내지 60℃의 범위, 가장 바람직하게는 58℃ 내지 60℃의 범위이다.
바람직한 구현예에서, 증폭 과정(본 발명의 방법의 단계 (b) 내지 (d)) 동안 온도 감소는 54℃ 내지 50℃, 56℃ 내지 50℃ 또는 58℃ 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 58℃ 내지 45℃, 58℃ 내지 40℃ 또는 심지어 60℃ 내지 40℃의 범위를 포함하는 감소를 포함한다. 증폭 과정 동안 온도 감소가 상기 정의된 언급된 범위보다 더 클 수 있는 것이 이해될 것이다. 즉, 최대 온도는 언급된 범위의 상한 온도를 초과할 수 있고/거나 최소 온도는 언급된 범위의 하한 온도 아래일 수 있다.
증폭 반응의 최종 온도는 바람직하게는 선택된 검출 방법과의 양립가능성을 위해 선택된다. 예를 들어, 검출 방법이 효소 표지의 이용을 포함한다면, 증폭 반응의 최종 온도를 효소와 양립가능하도록, 그리고 효소의 최적 온도의 ±5℃ 이내로 조정하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 검출 방법이 혼성화 검출 프로브, 예를 들어, 분자 비콘 등의 이용을 포함하는 경우, 선택될 증폭 반응의 최종 온도를 검출 프로브/검출 표적 듀플렉스의 Tm과 양립 가능하도록 조정하는 것이 유리할 것이다.
예를 들어, 최종 온도는 편리하게 검출 프로브/검출 표적 듀플렉스의 Tm 미만, 바람직하게는 적어도 2℃ 미만이어서, 검출 표적으로의 프로브의 혼성화를 용이하게 할 수 있다.
증폭 과정 동안 전형적인 평균 온도 감소 속도는 -0.10℃ 내지 -6.0℃ 분-1의 범위, 바람직하게는 -0.20℃ 내지 -3.5℃ 분-1의 범위, 더욱 바람직하게는 -0.30℃ 내지 -3.5℃ 분-1의 범위, 가장 바람직하게는 -0.40℃ 내지 -3.5℃ 분-1의 범위이다. 상기로부터 명백해질 바와 같이, 증폭 과정 동안 어느 한 순간의 실제 온도 감소 속도는 온도 감소 기울기의 성질에 따라 바람직한 평균 속도로부터 벗어날 수 있다.
일부 구현예에서, 온도 감소 기울기는 적어도 3분, 더욱 바람직하게는 적어도 4분, 가장 바람직하게는 증폭 과정의 대부분의 기간에 걸쳐 실질적으로 선형이다. 전형적으로, 온도 감소 기울기는 3분 내지 12분 범위, 바람직하게는 4분 내지 10분 범위, 더욱 바람직하게는 4분 내지 8분 범위의 기간에 걸쳐 실질적으로 선형이다. 본 발명의 목적을 위하여, "실질적으로 선형"은 온도 기울기를 설명하는 임의의 2차 다항식에 있어서, X의 계수의 크기가 Y의 계수의 값의 5% 미만인 것을 의미한다.
증폭 과정 동안 원하는 온도 감소를 달성하기 위하여 다수의 상이한 기법이 예상될 수 있다. 이들은 하기 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다: (a) 반응 믹스에 열을 가하는 것을 중단하고/거나 가열된 및/또는 단열된 환경으로부터 반응 믹스를 제거하고, 반응 믹스가 본질적으로 수동적인 열-소실에 의해 주위 온도까지 냉각되게 함; (b) 반응 믹스에 능동 냉각을 적용. 능동 냉각은 반응 믹스를 냉각된 환경에 노출시키는 것, 예를 들어, 반응 믹스를 냉각된 매질, 특히 유체와 열 전달(전도, 복사 또는 대류) 접촉되게 배치하는 것을 포함할 수 있다. 이것은 예를 들어, 반응 믹스를 팬을 사용하여 냉각수 배쓰와 접촉시켜, 차가운 공기 또는 다른 기체를 반응 믹스 상으로 또는 이를 통과하여 송풍시키는 것, 반응 믹스를 기체, 액체 또는 고체일 수 있는 반응 믹스-양립 가능한 냉각제와 접촉시키는 것, 또는 펠티에(Peltier)-유형 냉각 디바이스의 이용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응 믹스-양립 가능한 냉각제는 동결된 또는 냉각된 액체 형태의 반응 믹스 양립 가능한 완충제일 수 있다. 차가운 완충제의 첨가는 반응 믹스를 희석시키는 경향이 있을 것이므로, 이러한 방법이 채용된다면, 반응 믹스의 온도보다 훨씬 낮은(즉, 이보다 20℃ 넘게 더 차가운) 온도에서 적은 부피(예를 들어, 1 ㎕ 내지 2 ㎕ 미만)의 냉각제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
임의의 능동 냉각 단계는 증폭 과정 동안 불연속적으로 적용되어, 원하는 온도 감소 수준 및/또는 원하는 온도 감소 프로파일을 달성할 수 있다. 특히, 능동 냉각은 증폭 과정 동안 둘 이상의 산재된 간격으로 수행될 수 있으며, 임의로 동시에 또는 교대하여 수동 냉각과 병용될 수 있다.
일반적으로, 실질적으로 순수하게 수동인 수단에 의해 원하는 온도 감소의 양 및 속도를 달성하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이것이 방법과, 방법을 수행하기 위해 필요한 임의의 장치 또는 키트를 단순화시키기 때문이다. 실질적으로 순수하게 수동의 수단에 의해 원하는 냉각의 양 및 속도를 달성하기 위하여, 이전에 기재된 바와 같이, 반응 믹스의 부피가 작아서, 그의 열 용량이 감소되게 하는 것이 바람직하다.
증폭 과정이 소정의 최적 온도를 갖는 제1 중합효소 및 소정의 최적 온도를 갖는 제2 중합효소를 이용할 수 있는 것이 본 발명의 방법의 바람직한 특징이며, 제2 중합효소의 최적 온도는 제1 중합효소의 최적 온도보다 더 낮다. 따라서, 반응 믹스의 온도가 제1 중합효소의 최적 온도로 또는 이에 가깝게 존재할 수 있기 때문에, 제1 중합효소는 증폭 과정의 시작 근처에 특히 활성일 수 있다.
따라서, 예를 들어, 제1 중합효소는 유리하게는 (즉, 60℃ 초과의 최적 온도를 갖는) "고온성" 효소일 수 있다.
역으로, 제2 중합효소는 제1 중합효소보다 더 낮은 최적 온도를 갖는다. 증폭 과정이 계속되는 경우, 반응 믹스의 온도는 떨어지고, 제2 중합효소의 최적 온도에 더 가깝게 근접한다. 따라서, 제2 중합효소는 점점 더 활성이 되고, 이는 감소하는 반응 속도를 적어도 부분적으로 보상하며, 이 감소는 (i) 더 낮은 온도로 인한 일반적인 열역학적 반응의 둔화 및 (ii) 아마도 제1 중합효소의 최적 온도 미만으로 떨어져 감소된 촉매작용을 초래하는 반응 믹스의 온도 때문이다.
유리하게, 제2 중합효소의 최적 온도는 30℃ 내지 55℃의 범위, 더욱 바람직하게는 30℃ 내지 45℃의 범위이다.
특정 구현예에서, 제2 중합효소는 DNA 중합효소 I의 클레나우 단편 또는 Bsu 중합효소일 수 있다.
심지어 바람직하게는 더 낮은, 제3의 최적 온도를 갖는 제3 또는 추가의 중합효소가 사용될 수 있는 것이 예상된다.
제2 중합효소는 바람직하게는 증폭 과정의 시작부터 반응 믹스에 존재하지만, 원하는 경우, 반응 믹스의 온도가 높은 초기 온도로부터 감소되게 하는 지연 후에 제2 중합효소를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 제2 중합효소가 특히 열불안정하며, 증폭 과정의 시작 시에 보통 사용되는 상대적으로 높은 온도로 존재한다면 실질적으로 변성될 것 같은 경우 이것은 유리할 수 있다.
상기와 정확하게 유사한 방식으로, 증폭 과정은 각각 더 높은 및 더 낮은 최적 온도를 갖는 제1 및 제2 닉킹 효소를 사용할 수 있다. 제1 및 제2 닉킹 효소는 경우에 따라 단일의 중합효소 또는 다수의 중합효소와 함께 사용될 수 있다.
상기와 같이, 더 낮은 최적 온도를 갖는 제2 닉킹 효소의 이용은 온도가 증폭 과정 동안 떨어지는 경우 예상되는 감소된 반응 속도를 적어도 부분적으로 상쇄할 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 반응 믹스의 온도는 제1 중합효소 및/또는 제1 닉킹 효소의 최적 온도에서 시작하거나, 증폭 과정의 진행 동안 그 미만의 온도까지 감소될 수 있으며, 제2 중합효소 및/또는 제2 닉킹 효소의 최적 온도에 접근하는 경향이 있고 심지어 이에 도달할 수 있다.
편리하게, 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 반응 혼합물을 핵산을 분해하는 분해 효소와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 사용자가 원하는 증폭 반응의 결과(예를 들어, 병원체의 검출)를 수득할 때까지, 이러한 단계는 시행되지 않는다. 따라서, 전형적으로, 증폭 과정이 원하는 종점에 도달한 후에 분해 효소를 반응 혼합물에 첨가한다. 바람직하게는 분해 효소는 증폭 과정이 원하는 종점을 달성하기 이전에 이것이 부주의로 반응 믹스 내로 도입되거나 이와 접촉되는 사건에서, 온도가 효소를 실질적으로 변성시키거나 다르게는 불활성화시키기에 충분하도록 열불안정하다. 적합한 예는 ArcticZymes®로부터 입수 가능한 대구(cod) 우라실-DNA 글리코실라제("UDG") 및 남극(Antarctic) 열불안정성 UDG(뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 입수 가능)를 포함한다. 이들 효소는 각각 55℃ 또는 50℃의 온도로의 노출 시에 신속하고 비가역적으로 불활성화되며, 분해 효소와 관련된 용어 "열불안정성"은 이에 따라 해석되어야 한다. 대안적으로, 열-감수성 분해 효소가 사용될 수 있다(즉, 50℃ 미만에서 적어도 부분적으로 활성이지만, 55℃ 초과에서 가역적으로 실질적으로 비활성인 것).
본 발명은 이제 예시적인 실시예를 통해, 그리고 첨부된 도면과 관련하여 추가로 기재될 것이다:
도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 프라이머의 전형적인 구현예의 개략도이며;
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 핵산 증폭 반응의 각각의 개시 단계 및 지수적 증폭 단계의 개략도이며;
도 3 내지 도 11은 시간(분)에 대한 (백그라운드를 제한) 형광(임의 단위) 및 온도(℃)의 그래프이며;
도 12a 내지 도 12c는 증폭 반응의 개별 반복실험을 위한 시간에 대한 (백그라운드를 제한) 형광(임의 단위)의 그래프이며;
도 13은 본 발명에 따른 "STAR" 조건 하에서 또는 등온 조건 하에서 10 카피의 주형 서열로부터의 증폭을 달성하는데 취한 시간을 비교하는 산점도이며;
도 14a 및 도 14b는 등온 증폭 조건(각각 63℃ 또는 49℃)을 사용한 시간에 대한 (백그라운드를 제한) 형광(임의 단위) 및 온도(℃)의 그래프이며;
도 15a, 도 15b 및 도 15c는 다양한 온도 프로파일 하의 본 발명에 따른 증폭 반응을 위한 개별 반복실험(10 카피 또는 100 카피; 각각 파선 및 실선)을 위한 시간(분)에 대한 (백그라운드를 제한) 형광(임의 단위) 및 온도(℃)의 그래프이며;
도 16a 및 도 16b는 상이한 온도 프로파일 하의 본 발명에 따른 증폭 반응을 위한 시간(분)에 대한 (백그라운드를 제한) 형광(임의 단위) 및 온도의 그래프이며;
도 17a 및 도 17b는 6(도 17a) 또는 7(도 17b)개의 O-메틸화 염기를 함유하는 프라이머를 사용하여 수행되는 본 발명에 따른 증폭 반응을 위한 시간(분)에 대한 (백그라운드를 제한) 형광(임의 단위) 및 온도(℃)의 그래프이며;
도 18은 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 23S RNA의 역전사에 의해 생성되는 DNA 표적을 사용하여 본 발명에 따라 수행되는 증폭 반응을 위한 시간(분)에 대한 (백그라운드를 제한) 형광(임의 단위)의 그래프이다.
실시예
실시예 1: 온도 감소를 시험하기 위한 프로토콜
표준 등온 조건에 대하여 시간이 지남에 따라 온도 감소를 사용하는 증폭을 비교함으로써 증폭 반응에 대한 온도 감소의 영향을 시험하였다. 온도 감소 증폭은 본원에서 "STAR"(선택적인 온도 증폭 반응, Selective Temperature Amplification Reaction)로 지칭된다. 달리 언급되지 않는 한, 이들 비교를 하기 기재된 바와 같은 프로토콜을 사용하여 수행하였다.
효소, 올리고뉴클레오티드 및 표적
클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis, Ct)를 STAR 메커니즘의 개발을 위한 초기 표적으로 사용하였다. 클라미디아 트라코마티스 혈청형 J(ATCC VR-886) 게놈 DNA를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(미국 버지니아주 머내서스 소재)으로부터 획득하였다. 잠재 플라스미드의 오픈 리딩 프레임 6 영역을 프라이머 STARctF61a(SEQ ID NO: 1, 5'-CGACTCCATATGGAGTCGATTTCCCCGAATTA-3') 및 STARctR61c(SEQ ID NO: 2, 5'-GGACTCCACACGGAGTCTTTTTCCTTGTTTAC-3')로 증폭시켰다. 생성된 DNA 주형을 EP 제0728218호에 기재된 바와 같이 분자 비콘 STARctMB1(SEQ ID NO: 3, 5'-FAM/ccattCCTTGTTTACTCGTATTTTTAGGaatgg/BHQ1-3')을 사용하여 검출하였다. Manta 1.0 DNA 중합효소를 엔자이머틱스(Enzymatics)(미국 매사추세츠주 비벌리 소재)로부터 구입하였다. 미국 특허 제6,191,267호에 기재된 Nt.BstNBI 닉킹 엔도뉴클레아제를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(미국 매사추세츠주 입스위치 소재)로부터 구입하였다.
올리고뉴클레오티드 및 분자 비콘을 인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies)(미국 아이오와주 코럴빌 소재) 및 바이오-신터시스(미국 텍사스주 루이스빌 소재)에 의해 합성하였다. STAR 반응에 사용되는 프라이머의 일반적인 특징은 하기와 같았다:
닉 부위의 5' 안정화 영역 및 닉 부위의 3' 표적 특이적 결합 영역이 있는 프라이머 세트를 작제하였다(도 1a). 스템의 적어도 일부를 형성하는 자가-상보적 구조를 생성함으로써 스템 및 루프 구조가 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 형성될 수 있는 방식으로 프라이머를 작제하였다. 주어진 시간에 반응의 온도에 따라 선형 또는 지수적 증폭 중 어느 하나를 유도하기 위하여 이러한 구조의 Tm을 선택하였다. 스템은 닉킹 효소 인식 서열의 적어도 일부를 추가로 포함하였다. 프라이머 내의 닉킹 효소 인식 서열은 이중 가닥 스템 구조의 일부이지만, 닉킹을 방지하기 위하여 적어도 하나의 뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 원하는 경우, 표적 서열에 상보적인 서열은 2차 구조를 포함하거나, 2차 구조가 없을 수 있다. 추가로, 이러한 서열은 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 2' 변형 또는 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있다.
도 1a에 관하여, "프라이머 영역"은 표적 서열에 상보적이며, 이에 어닐링되는 서열이다. "NEB 영역"은 닉킹 엔도뉴클레아제 결합 영역, 즉, 이러한 예에서, NEB 영역의 말단의 4개 뉴클레오티드 다운스트림의 부위에서 프라이머를 닉킹시키는 닉킹 효소의 인식 영역이다. "증폭 루프"는 증폭 과정을 위한 프라이머 안정화 및 혼성화를 제공하며, 개시 단계 동안 자가-상보성을 통하여 그 자체에서 루프를 형성하여, 백그라운드 비-특이적 증폭을 감소시킨다. 도 1b 및 도 1c는 본 발명의 방법에 유용한 프라이머의 약간 상이한 구현예를 보여준다. 프라이머 구조는 본질적으로 도 1a에 나타낸 구현예와 동일하지만, 변경된 프라이머는 "프라이머 영역"에 변형된 염기를 포함한다. 구체적으로, 프라이머 영역의 3' 말단에, 연속 2'O-메틸화 염기의 스트링이 존재한다. 도 1b에서 이러한 스트링은 7개 염기 길이이며, 도 1c에서 스트링은 6개 염기 길이이다. 도 1b 및 도 1c에 나타낸 부류의 프라이머를 하기 실시예 8에서 사용하였다.
반응에서 관찰되는 올리고뉴클레오티드 및 증폭 메커니즘의 요약은 (1) 표적 핵산 분자; (2) 표적 핵산 분자에 상보적인 수 개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 둘 이상의 프라이머 올리고뉴클레오티드 분자; 및 (3) 닉킹 효소에 의해 닉킹될 수 있는 프라이머 내의 부위를 포함한다. 상기 방법은 표적 핵산 분자를 비등온 조건 하에서, 중합효소, 각각이 표적 뉴클레오티드 분자 상의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 둘 이상의 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 닉킹 효소와 접촉시켜, 표적 서열에 결합하는 프라이머 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 포함하는 검출 가능한 앰플리콘을 생성하는 단계를 포함한다. 전반적인 STAR 반응은 2개의 별개의 단계; 개시 및 지수적 증폭을 겪는 것으로 이해될 수 있다. 개시 단계는 지수적 증폭이 발생할 수 있는 지수적 - 주형 듀플렉스의 초기 형성이다. 이들 2개의 단계는 도 2a 및 도 2b에 개략적으로 예시되어 있다. 이들 도면에서, 삼각형 기호는 닉킹 효소를 나타내며, 육각형 기호는 DNA 중합효소를 나타낸다. 표적 핵산으로의 프라이머의 초기 접촉이 발생한 후에, 정방향 개시 주형의 연장 및 생성이 일어난다. 이어서, 반대편 가닥 프라이머는 새로 생성된 정방향 개시 주형에 결합하여, 개시 주형의 닉 부위를 향한 방향으로 이를 통과하여 연장된다. 이러한 초기 과정은 연장을 위한 중합효소를 수반하는 것이 이해될 수 있으며, 프라이머 이량체가 형성되기 매우 쉽고, 절두된(truncated) 또는 백그라운드 산물이 오(false) 증폭되기 매우 쉽다. 닉킹이 어느 하나의 가닥에서 시작되면, 중합효소는 닉 부위에 침투하고, 반대편 프라이머를 향해 그리고 닉 부위를 통과하여 연장시킬 것이다.
이러한 닉킹 사이클에 이어서 중합효소 연장이 정방향 개시 가닥 및 역방향 개시 가닥 둘 모두에서 발생하면, 지수적 듀플렉스로 알려져 있는 듀플렉스가 형성된다. 반응의 제2 단계가 시작하며; 닉 및 연장으로부터 생성된 각각의 새로운 주형이 이제 또 다른 프라이머에 대한 표적이 되기 때문에, 이러한 지수적 증폭 과정은 되먹임된다.
제2 단계가 신속한 주형 생성을 위하여 활성 닉킹 엔도뉴클레아제를 필요로 하는 것이 이제 이해된다. 이러한 닉 가닥 치환 복제가 온도 사이클링의 필요성을 막음에 따라, 반응이 일정한 온도에서 수행될 수 있고, 항상 일정한 온도에서 수행되어 온 것이 이전에 알려져 있다. 본 발명의 신규한 발견은 짧은 기간 내의 큰 특이성으로의 높은 수율의 산물을 포함하여, 기존의 방법보다 유의미하게 더 큰 성능을 갖는 독특하고 특유한 증폭 방법을 가능하게 한다.
증폭 조건
기본적인 선택적 온도 증폭 반응(STAR) 혼합물은 2개의 프라이머, 중합효소 및 닉킹 효소(상기 참조)를 함유한다. 반응을 0.41 μM의 정방향 프라이머, 0.2 μM의 역방향 프라이머, 0.18 μM의 분자 비콘, 10 ㎕의 STAR 마스터 믹스(Master Mix) 및 5 ㎕의 DNA 시료를 포함하는 20 ㎕의 최종 부피에서 수행하였다. STAR 마스터 믹스는 하기의 시약을 함유한다; 15 mM MgSO4, 90 mM Tris-HCl(pH 8.5), 300 μM의 각각의 dNTP, 15 mM (NH4)2SO4, 15 mM Na2 SO4, 1 mM DTT, 0.01% 트리톤(Triton) X-100, 7U 닉킹 엔도뉴클레아제, 48U 중합효소. 반응의 온도는 등온이거나, 온도 감소량에 기초하여 달라졌다. 각 반응에서 증폭 동안의 온도가 60℃에서 시작하고, 15초 또는 1분마다 특정량이 감소한다면, 예를 들어, 10분 동안 -0.5℃ 속도(즉, 15초당 0.5℃ 온도 감소)는 반응의 과정에 걸쳐 60℃에서 40℃로의 온도 감소를 초래할 것이다. 증폭 및 STAR 산물 검출을 아질런트(Agilent) Mx3005 P QPCR 장치(아질런트)로 수행하였다. 하기의 표에는 명시된 경우를 제외하고 시험된 온도 프로파일이 열거되어 있다:
Figure 112018123545362-pct00001
사전-반응 인큐베이션은 시약이 증폭 동역학, 효소 성능 및 신호 형광에 대한 온도 감소의 효과를 시험하기 위한 온도가 되게 하기 위한 것이다. 이러한 방식으로의 반응의 시행은 온도 변수의 증가를 없애고, 기존의 등온 증폭 기법과 신규한 STAR 방법 간의 직접적인 비교를 가능하게 한다.
증폭 절차
증폭 반응이 수행되는 정확한 단계는 하기와 같다: 1) 마스터 믹스를 제조하고; 2) 표적이 존재하거나 표적이 존재하지 않는 프라이머를 제조하고; 3) 플레이트마다 행할 반응의 수에 따라 96 웰 플레이트의 A 내지 G줄에 프라이머 믹스를 첨가하고; 4) 마스터 믹스를 동일한 96 웰 플레이트의 H줄에 첨가하고; 5) 플레이트를 밀봉하고, 2분 동안 사전-반응 인큐베이션을 행하고; 6) 마스터 믹스를 H줄로부터 각 프라이머 믹스 줄로 전달하여, 전달 사이에 15분 대기하고; 7) 밀봉하고, 소정의 온도 프로파일 및 데이터 수집을 개시한다.
반응의 과정 동안, 상기 기재된 바와 같은 분자 비콘을 사용함으로써 증폭된 산물을 15초마다 측정하였다. 반응 혼합물 중 분자 비콘의 형광을 모니터링하여, 반응 동안 생성되는 특정 산물의 양을 측정하였다. 반응 동안 생성되는 특정 산물은 분자 비콘에 결합하여, 형광단을 소광체로부터 분리하여, 형광을 생성한다. 형광 측정치는 증폭을 시작하기 전에 각 반응 웰의 처음 3회의 판독의 평균에 기초하여 백그라운드를 제하였다. 추가의 특성화를 기준선 역치 수준(TL)으로부터의 상승에 기초하여 행하였다. 백그라운드를 제한 형광의 기준선에 가깝지만 무작위 변동의 범위를 초과하는 TL을 선택하였다. 온도의 감소는 증가된 스템 세기로 인하여 분자 비콘 기준선 형광이 감소되게 하여, 소광체 및 형광단이 더 큰 상호작용을 갖는 경우 일정한 선형 기준선 감소를 야기한다. 모든 반응을 위하여 2000의 TL을 선택하였다. 비교를 위하여, AT 값으로 지칭되는 TL에 도달하는 증폭까지의 시간에 기초하여 정확한 수를 결정하였다. AT 값의 이용은 한 플레이트와 또 다른 플레이트의 비교를 가능하게 한다.
실시예 2: 변형되지 않은 프라이머를 사용한 결과
현행의 등온 기술에 비하여 STAR이 제공하는 개선을 입증하기 위하여, 표적에 대하여 18개의 반복실험 및 표적 부재에 대하여 6개의 반복실험을 사용하여 증폭을 수행하였다. STAR 반응은 등온 조건에 비하여 속도, 감도 및 총 형광의 현저한 개선을 보여준다. 특히, -0.8℃ 분 내지 -3.2℃ 분의 범위는 모든 등온 조건보다 현저하게 더 나았다(도 3 내지 도 11). 이러한 온도의 유의미한 강하가 여전히 뛰어난 결과를 생성하는 것은 놀랍고 예상치 못한 것이다. 임의의 특정 이론에 출원인을 제한하지 않고, 증폭 개선이 하기 추가로 논의되는 적어도 3가지 특징에 기인할 수 있는 것으로 여겨진다.
변형되지 않은 프라이머를 사용한 실험의 결과는 도 3 내지 도 11에 나타나 있다. 이들 도면에서, 온도 프로파일은 배경 음영으로 나타나 있다. "비-표적" 음성 대조군에 대한 신호(형광)의 양은 진한 플롯으로 나타나 있다. 10 또는 100 카피의 표적(클라미디아 트라코마티스의 게놈 DNA)의 존재 하에 생성되는 신호의 양은 더 연한 플롯으로 나타나 있다.
도 3, 도 4 및 도 5는 각각 50, 56 및 60℃에서의 등온 증폭(즉, 본 발명의 방법에 따르지 않음)에 대한 결과를 보여준다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 50℃에서 본질적으로 특이적인 증폭이 존재하지 않고, 56℃에서 적어도 100 카피수의 표적에 대하여 강력한 증폭(도 4) 및 60℃에서 낮은 증폭(도 5)이 존재하였다.
도 6 내지 도 10은 온도가 증폭 동안 감소되는 본 발명에 따른 비등온(STAR) 증폭 반응에 대하여 수득되는 결과를 보여준다. 온도 감소 속도는 선형이며, 도 6에서의 15초당 -0.1℃(즉, 분당 -0.4℃) 내지 도 10에서의 15초당 -1.0℃(즉, 분당 -4.0℃)의 범위이다. 모든 예에서, 예상될 바와 같이, 100 카피의 표적을 사용한 반응이 10 카피의 표적을 사용한 반응보다 더 큰 형광 신호를 생성하는 것을 알 수 있다. 더욱 유의미하게, 상기 반응은 특히 10 카피수 표적 반응에 있어서 등가의 등온 증폭보다 훨씬 더 많은 신호를 생성하였다. 또한, 검출 가능한 신호는 등가의 등온 반응에서보다 더욱 신속하게 생성되었다.
본 발명의 방법을 비선형 단계식 온도 감소를 사용하여 수행하는 경우 유사한 결과가 수득되었다(도 11에 나타낸 바와 같음).
또한, 본 발명자들은 STAR 반응에서 상이한 반복실험 간의 신호의 양의 변화가 등온 반응에서의 반복실험 간의 변화보다 훨씬 더 낮은 것을 발견하였으며(간결하게 하기 위해 데이터 생략), 이는 본 발명의 방법이 훨씬 더 일관된 결과를 생성하는 것을 입증한다. 하기의 언급은 본 발명의 방법이 상기 기재된 이점을 부여할 수 있는 가능한 메커니즘을 제공한다.
대부분의 핵산 증폭 반응에서, 결국 프라이머 이량체가 생성되어, 제한된 시약을 위해 경쟁하며, 낮은 표적 농도에서, 프라이머 이량체는 반응을 위한 주요 증폭 경로가 될 수 있다. 심지어 소량의 프라이머 이량체의 형성의 제한 또는 지연은 반응에 유의미한 이익을 제공한다. 증폭 반응의 신속한 성질 때문에, 프라이머 이량체 형성의 지연은 바람직한 증폭 경로(즉, 주형 생성)를 유리하게 하여, 증폭의 모든 양태를 개선시킨다. 상승된 온도에서 반응을 개시함으로써, 이들 주형 경로가 유리하게 되며, 훨씬 선호된다. 이것은 STAR 방법에서의 개선된 감도, 개선된 형광 신호, 반복실험의 더 엄격한 그룹화(즉, 더 큰 재현성) 및 증가된 속도에 의해 관찰된다.
반응의 개시 단계 후에, 지수 단계가 시작한다. 주형 경로가 잘못된 경로에 비하여 유리하기 때문에, 가능한 빨리 많은 산물을 생성하는 것이 바람직하며, 이것은 STAR에 의해 용이하게 된다. 이러한 생성에 대한 가장 유력한 제한 단계 중 하나는 닉킹 엔도뉴클레아제에 의한 상기 부위의 닉킹이다. 반응 믹스의 온도가 감소되는 경우, 그것은 닉킹 엔도뉴클레아제에 가장 바람직한 온도에 근접하며, 반응 효율은 증가하여, 검출을 위해 가능한 한 많은 주형을 생성한다.
온도가 감소하는 경우, 추가로 분자 비콘은 주형 검출에 유리하고, 형광 백그라운드를 감소시켰다. 분자 비콘에 대한 주형의 융해 온도는 검출 온도보다 유의미하게 더 높아져서, 분자 비콘으로부터 더 적은 주형이 융해되기 때문에 개선된 신호를 생성한다. 또한, 감소된 온도로 인하여, 스템 융해 온도는 반응 온도보다 더 높아진다. 따라서, 분자 비콘은 주형이 존재하지 않는 경우 닫힌 단계를 유리하게 하여, 더 적은 백그라운드 신호를 생성한다.
본 발명의 신규한 비등온 반응 방법은 기존의 등온 및 열 사이클링 조건에 비하여 실질적인 개선을 제공한다. 효소 활성 및 최적의 반응 동역학을 유리하게 함으로써, 상기 방법은 AT의 변화를 개선시키고, 생성되는 형광의 총량을 증가시키고, 증폭의 일관성을 향상시키고, 검출의 감도를 증가시켰다.
실시예 3: SYBR 그린(Green) II를 사용한 결과
분자 비콘이 특이적인 단일-가닥 DNA 산물의 총량의 증가만을 측정하기 때문에, 의도되는 증폭 산물과 독립적으로 비-특이적인 증폭 산물은 측정되지 않는다. 비-특이적인 증폭 산물(예를 들어, 프라이머 이량체 형성으로부터 발생)의 생성을 측정하기 위하여, 개별 반응을 SYBR 그린 II의 존재 하에 수행하였다. SYBR 그린 II는 단일 가닥 DNA, RNA 및 이중 가닥 DNA를 검출하기 위한 알려져 있는 가장 민감한 염료 중 하나이다. SYBR 그린 II가 낮은 고유 형광을 갖기 때문에, 반응에서 전체 증폭 또는 증폭이 표적의 부재 하에 행해지는 경우 비-특이적 증폭을 검출하기 위한 자연스러운 선택이다. 반응을 2가지 조건, 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 등온 및 비등온(STAR) 하에서 직접적으로 수행하였다.
Figure 112018123545362-pct00002
또한, 반응에서 표적 부재에 비하여 50 카피의 게놈 DNA를 비교하였다. SYBR 그린 II를 10,000x 농도로 획득하고, 반응마다 0.5x를 사용하였다(미국 칼스배드 소재의 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)). 끼어들기 염료의 고유 성질 때문에 더 높은 TL, 9000을 사용하여, AT를 계산하였다. SYBR 그린 II는 온도에 대하여 역관계의 형광을 갖는다. 문헌["Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperature" (Gudnason et al., 2007 Nucl. Acids Res. 35 (19) e 127)]에 기재된 바와 같이, 온도가 더 낮을수록, 형광 신호가 더 높다. 결과는 하기 표 3에 나타나 있다.
Figure 112018123545362-pct00003
STAR 방법은 다수의 개선을 나타낸다; 먼저, 이는 백그라운드 생성을 감소시키며, 이는 "표적 부재"가 표적 신호에 비하여 SYBR 그린 II 증폭을 보이는데 더 긴 시간이 걸림으로써 입증된다. 두번째로, 이는 산물 증폭을 개선시키며, 이는 표적이 존재하는 경우 더 빠른 증폭 시간에 의해 관찰된다. 조합하여, 이들은 등온 방법에 비하여 AT 사이의 차이를 4배 넘게 개선시킨다.
등온 반응으로부터의 AT 값이 STAR로부터의 AT 값보다 더 큰 가변성을 갖는 것을 주의해야 한다. 이것은 새로운 방법이 증폭 과정의 제어에서 갖는 이익을 보여주며, 종래의 방법을 사용한 비-특이적인 증폭 경로의 예측불가능을 반영한다.
실시예 4: 2' O-메틸 변형된 프라이머를 사용한 결과
미국 특허 제6,794,142호 및 제6,130,038호에 기재된 바와 같이 2' O-메틸 변형된 프라이머의 이용은 증폭 동안 프라이머 이량체 형성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. US 2005-0059003호에는 SDA 프라이머의 3'에 위치된 2' O-메틸 변형의 이용이 기재되어 있으며, 이에 따라 Bst DNA 중합효소 I 및 유도체는 DNA 합성을 위한 프라이머로서 2'-변형된 리보뉴클레오티드를 효율적으로 이용할 수 있다. 하나 이상의 2' 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 2'-O-메틸, 2'-메톡시에톡시, 2'-플루오로, 2'-알릴, 2'-O-[2(메틸아미노)-2-옥소에틸], 2'-하이드록실(RNA), 4'-티오, 4'-CH3-O-2'-가교, 4'-(CH3) 3-O-2'-가교, 2'-LN A 및 2'-O-(N-메틸카바메이트 2'-Suc-OH))를 포함하는 표적 특이적 프라이머 영역은 등온 반응을 개선시켜야 한다. 2' 변형된 뉴클레오티드가 프라이머 이량체 형성을 완전히 제거한다면, STAR 방법이 증폭을 추가로 개선시킬 수 있는 것은 놀라울 것이다. 하기 나타낸 바와 같이 2가지 조건, 등온 및 비등온(STAR) 간에 반응을 직접 수행하였다.
Figure 112018123545362-pct00004
프라이머의 3' 말단 상의 2' 변형된 뉴클레오티드를 사용한 증폭의 결과는 하기 표 5에 나타나 있다. 표적 부재 반응에서 최소 6개의 반복실험 및 표적 반응을 사용한 12개의 반복실험으로 반응을 수행하였다.
Figure 112018123545362-pct00005
데이터는 2' O-메틸 뉴클레오티드를 혼입한 적어도 하나의 프라이머의 이용이 프라이머 이량체의 형성을 지연시켜, 반응을 개선시키지만, 반응을 늦추는 것을 보여준다. 또한, STAR 방법의 이용은 2' O-메틸 증폭의 이용을 개선시켜, 손실된 속도의 일부를 회복시킬 뿐 아니라, 표적과 표적 부재의 증폭 간의 차이를 3배 개선시켰다. 이것은 2' O-메틸 변형이 비-특이적인 잘못된 증폭의 생성을 감소시키지만, 그들이 그것을 제거하지 않는 것을 나타낸다. 데이터는 추가로 STAR 방법이 이전에 개시된 기존의 기법보다 2' O -메틸 변형에 의해 생성되는 개선을 더 잘 이용하는 것을 뒷받침한다.
임의의 특정 이론에 본 발명을 제한하지 않고, 프라이머 영역 내에 하나 이상의 2' 변형된 뉴클레오티드를 사용함으로써 수득되는 잠재적인 개선은 대부분 증폭의 개시 단계에서의 향상 때문인 것으로 가정된다.
표적 상의 프라이머 영역의 초기 연장 동안 STAR의 프라이머 영역 내의 하나 이상의 2' 변형된 뉴클레오티드의 혼입은 이들 뉴클레오티드를 프라이머의 상호작용에 의해 형성되는 비특이적 복합체에서 중합효소 연장을 위한 주형으로서 제공하기에 적합하지 않게 하여 백그라운드 신호를 감소시킨다. 뉴클레오티드가 결합 포켓에 진입하는 경우 중합효소가 교착될 가능성이 상당하다. 비-생산적 반응(즉, 오프-표적 또는 프라이머 이량체 형성)에서, 주형 결합이 그의 융해 온도 가까이에서 이루어지기 때문에, 교착 효과는 비정상적인 연장을 최소화하는데 충분하다. 결과적으로, 2' 변형은 반응이 곤경에 처하기 때문에, 바람직하지 않은 증폭 경로를 제한할 수 있다. 그러나, 바람직한 증폭 동안, 2' 변형은 융해 온도를 감소시켜, 이에 따라 증폭에 부정적으로 영향을 미치고, 증폭까지의 시간을 늦춘다. STAR은 부정적인 표적 증폭 단점을 최소화시키면서 2' 변형을 이용할 수 있다.
이러한 중합효소 교착은 STAR가 2' O-메틸 변형과 함께 서로 개선되는 이유를 추가로 설명한다. STAR 방법에서 관찰되는 온도의 초기 증가는 자연적으로 프라이머 이량체를 감소시키는 것 외에, 비정상적인 증폭이 발생하기 이전에 2' 변형 교착 및 프라이머의 융해를 가중시킴에 따라, 두 방법은 서로를 보완한다. 또한, STAR가 온도의 감소를 포함하기 때문에, 프라이머 내의 2' 변형에 의해 야기되는 융해 온도의 감소는 반응이 진행되는 경우 최소화될 수 있다.
실시예 5: 다수의 중합효소를 사용한 결과
기존의 증폭 기술은 열 사이클링되거나 일정한 온도에서 실행된다. 본 발명의 방법은 어느 쪽도 행하지 않고, 오히려 사이클링 없이 온도를 감소시킴으로써 실행된다. 본 발명의 신규한 특정 특징은 기능이 유사하지만 상이한 온도 최적 조건을 갖는 효소를 이용하는 능력이다. 예를 들어, 이러한 기술은 상이한 최적 조건을 갖는 상이한 가닥 치환 중합효소와 함께 상이한 온도 최적 조건에서 기능하는 닉킹 엔도뉴클레아제를 위해 설계된 다수의 프라이머의 이용을 가능하게 할 것이다. 임의의 특정 이론에 본 발명을 제한하지 않고, 이러한 방법은 신속한 증폭 방법을 개시하여, 기존의 기술에서 볼 수 없는 효소와 프라이머의 새로운 조합을 가능하게 한다. 하기의 반응(표 6)을 3가지 조건, 등온, 비등온(STAR) 및 BSU 중합효소(초기 Manta 1.0 중합효소에 더하여)와 함께 비등온(STAR)에서 하기에 나타낸 바와 같이 직접 수행하였다. BSU 중합효소를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(미국 매사추세츠주 입스위치 소재)로부터 구입하고, 반응마다 0.5U에서 실행하였다. 모든 조건을 18개의 표적 반복실험 및 6개의 표적 부재 반복실험을 사용하여 실행하였다.
Figure 112018123545362-pct00006
증폭 반응을 10 카피의 클라미디아 트라코마티스 게놈 DNA를 함유하는 시료를 사용하여 수행하였으며, 결과는 도 12a 내지 도 12c에 나타나 있다.
도 12a는 등온 반응(본 발명에 따르지 않음)에 대한 결과를 보여준다. 도 12b는 단독의 Manta 중합효소의 존재 하의 STAR 반응에 대한 결과를 보여준다. 도 12c는 추가의 BSU 중합효소의 존재 하의 STAR 반응에 대한 결과를 보여준다.
명백한 첫번째 차이는 등온 방법에 의한 10 카피의 게놈 DNA의 검출의 결여이며, 18개의 반복실험 중 오직 9개만이 형광 역치-수준(TL)을 초과하였으며, 증폭된 것으로 말할 수 있었다. STAR 방법 둘 모두는 18개의 반복실험 중 17개에서 검출되었다(각 STAR 방법에서 실패한 반복실험은 잘못된 멀티채널 피펫으로 인한 것이었음을 주의해야 한다).
STAR 방법 간의 차이는 덜 극명하지만, 더 낮은 최적 온도, 37℃를 갖는 제2 중합효소의 첨가는 10분 후에 총 형광을 개선시켰다. 또한, 제2 중합효소는 반복실험을 강화하여, AT 가변성을 감소시킨다. 이러한 차이는 45℃ 내지 50℃의 온도 최적조건을 갖는 상용의 가닥 치환 중합효소가 시장에서 입수 가능한 경우에 추가로 입증될 것이다. 결과는 STAR 방법이 등온 조건보다 뛰어난 것을 나타내며, 또한 이러한 기술이 신규한 새로운 역학, 효소 조합 및 프라이머 증폭 방식을 가능하게 하는 것을 추가로 나타낸다.
실시예 6: 재현성
STAR 기술의 일관성의 입증을 위하여, 대규모 반복실험 연구를 수행하여, STAR 및 미국 특허 제9,562,263호에 기재된 바와 같이 공개된 등온 조건을 비교하였다. STAR 대 등온 증폭을 표적을 함유하는 반응을 위하여 100+개의 반복실험 및 표적 부재의 대조군 반응 혼합물을 위하여 16개의 반복실험을 사용하여 수행하였다. 두 조건 모두는 동일한 완충제, 중합효소, 닉킹 효소 및 표적을 사용하였다. 도 13의 산점도에 나타낸 바와 같이, STAR 기술은 형광의 역치 수준(TL)까지 증폭을 달성하기 위한 평균 시간(AT)의 분명한 개선, 개선된 감도 및 반복실험 간의 감소된 표준 편차를 보여주었다. 본 발명에 따라 수행되는 반응에 대한 AT 시간은 3.35분인 한편, 종래의 등온 프로토콜에 따라 수행되는 반응에 대한 AT 값은 4.88분이었으며, 이러한 차이는 양측 t-검정(Two-tailed t-test)에 의해 판단시 통계적으로 유의미하다. 임의의 특정 이론에 출원인을 제한하지 않고, 증폭 시간의 유의미한 감소는 개선된 반응의 개시로 인한 것으로 여겨지며, 이는 더욱 효율적인 저 카피 증폭, 최소화된 프라이머 이량체 사건을 가능하게 하며, 증가된 특이적 산물 연장은 이전에 개시된 방법보다 더 빨리 주형을 생성한다.
실시예 7: 종래의 등온 온도 범위를 넘어서 수행되는 증폭 반응
STAR 기술의 추가의 이익은 가장 흔한 등온 증폭 온도 범위를 벗어나서 증폭시키는 능력이다. 미국 특허 제5,712,124호, 제9,562,263호 및 제5,399,391호에 기재된 바와 같이, 대부분의 등온 증폭 기술은 증폭이 발생할 수 있는 엄격한 온도 범위를 갖는다. 이들 전형적인 온도 범위를 벗어나서, 종래의 등온 기법은 증폭의 어려움을 갖는다. STAR의 융통성을 입증하기 위하여, 증폭을 하기 표 7에 기재된 바와 같이 수행하였다.
Figure 112018123545362-pct00007
등온 반응을 미국 특허 제9,562,263호에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 14a 및 도 14b는 63℃(도 14a) 또는 49℃(도 14b)에 수행되는 등온 증폭 반응을 위한 시간(분)에 대한 형광 신호의 양(백그라운드를 제함; 임의 단위)을 보여주는 그래프이다. 두 도면 모두에서, 점선 플롯은 주형이 존재하지 않는 음성 대조군 반응으로부터 수득되는 결과를 나타내며; 실선 플롯은 주형을 함유하는 시험 반응으로부터의 결과이다.
반응 온도가 63℃로 유지되는 경우에 실질적으로 주형-특이적 증폭이 발생하지 않는 것이 도 14a로부터 명백하다. 도 14b에서, 결과는 49℃에서 약 9분부터 증폭이 발생하지만, 실제로 이것은 아마도 분자 비콘과 프라이머의 상호작용으로부터 발생하는 오신호일 것임을 시사하는 것으로 보인다(데이터 미도시).
본 발명에 따라 수행되는 "STAR" 반응은 등온 반응과 대조적으로 승온에서 개시될 수 있으며, 여전히 우수한 증폭을 달성한다. 이들 반응으로부터의 결과는 도 15a, 도 15b 및 도 15c에 나타나 있다. 이들은 시간(분)에 대한 형광(백그라운드를 제함, 임의 단위)의 그래프이다. 채워진 음영은 반응 동안의 온도(℃)를 나타낸다. 점선 플롯은 10 카피의 표적을 사용하여 수득되는 결과를 나타내며, 실선 플롯은 100 카피의 표적을 사용하여 수득되는 결과를 나타낸다. 도 15a에서, 초기 온도는 62℃였으며, 온도 감소 속도는 15초당 -0.8℃(즉, 분당 -3.2℃)였다. 도 15b에서, 초기 온도는 63℃였으며, 온도 감소 속도는 15초당 -0.8℃였다. 도 15c에서, 초기 온도는 64℃였으며, 온도 감소 속도는 15초당 -0.9℃(즉, 분당 -3.6℃)였다. 62 또는 심지어 63℃의 초기 온도가 STAR 반응에 있어서 우수한 결과를 제공하며, 심지어 64℃의 초기 온도가 명백하게 최적은 아니지만 이를 이용하여 일부 증폭이 존재하는 것이 도면으로부터 명백해진다.
또한, 큰 온도 강하를 사용하여 실험을 수행하였다. 결과는 도 16a 및 도 16b에 나타나 있다. 그래프는 표적 부재 음성 대조군(역치 수준을 초과하는 형광 신호 부재)에 대한, 및 10 또는 100 카피의 표적 클라미디아 트라코마티스 게놈 DNA의 존재 하에 수행되는 STAR 반응에 대한 결과를 보여준다.
도 16a는 63℃의 초기 온도에 이어서 1분 동안 15초당 -0.8℃의 온도 감소 속도에 이어서 49℃로의 급격한 감소 후에, 반응의 기간 동안 15초당 -0.2℃(즉, 분당 -0.8℃)의 완만한 온도 감소를 사용하여 수득되는 결과를 보여준다. 그래프는 증폭이 10 카피 및 100 카피수 반응 둘 모두에 대하여 달성되었지만, 10 카피 표적 반응에 비하여 100 카피 표적 반응에 대하여 대략 2배 더 많은 형광 신호가 존재하였으며, 상당한 군-내 가변성이 존재하였음을 보여준다.
도 16b는 1분 동안 동일한 63℃의 초기 온도에 이어서 49℃로의 급격한 감소를 사용하여 수득되는 결과를 보여준다. 이후에, 실험 기간 동안 반응 온도를 49℃로 유지하였다. 우수한 특이적인 증폭 및 훨씬 더 적은 군-내 가변성(오직 100 카피수 표적 또는 표적 부재로만 수행된 반응)이 존재하는 것을 그래프로부터 알 수 있다.
40℃ 온도 범위에 걸쳐 증폭시키는 STAR의 능력은 STAR이 종래의 증폭 반응과 매우 상이한 것을 명백하게 나타낸다. 큰 범위를 갖는 이례적인 반응 온도는 특이한 것이며, 작동이 예상되지 않을 것이다. 임의의 특정 이론에 출원인을 제한하지 않고, 이들 큰 온도 범위가 종래의 증폭 방법보다 STAR에 대한 증폭에서 덜 제한적인 것으로 보이는 것은 예상치 못한 것이다. 더 큰 온도 범위에 걸쳐 뛰어난 증폭을 달성하는 STAR의 능력은 아마도 효소 온도 최적조건의 전략적인 사용과 함께 프라이머 특이성 및 결합의 개선에 기인할 것이다. 개시 단계를 위하여 더 높은 온도를 사용함으로써, 정확한 산물 증폭을 유리하게 하며, 이에 따라 모든 후속 단계, 지수적 증폭 및 검출의 효율을 개선시킨다. 이러한 선택 및 이후의 온도 강하는 효소, 프라이머 및 온도에 대한 새로운 방식이 실현될 수 있기 때문에, 증폭 도구상자를 여는 것이다.
실시예 8: 6- 및 7- 2'-O-메틸을 사용한 결과
이전에 기재된 바와 같이, 2'-O-메틸 변형된 프라이머는 증폭 동안 프라이머 이량체 형성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. STAR 기술과 이들 변형의 협력적 성질을 추가로 보여주는 것은 2'-O-메틸 변형의 큰 스트링을 혼입하고, 여전히 증폭을 달성하는 능력이다. 전형적으로, 2'-O-메틸 변형은 중합효소를 교착시켜, 증폭을 영구적으로 지연시키며; 6개 이상은 중합효소를 그저 교착시키는 것보다는 복합체로부터 "분리"되게 하는 것으로 여겨진다. 도 17a 및 도 17b는 이들 변형을 용인하고, 이전에 확인된 것보다 더 긴 2'-O-메틸 스트링을 사용하여 유의미한 증폭을 달성하는 STAR의 능력을 보여준다. 2'-O-메틸화된 염기를 함유하는 프라이머의 구조는 도 1b 및 도 1c에 나타나 있다.
도 17a 및 도 17b는 시간(분)에 대한 (백그라운드를 제한) 형광(임의 단위)의 그래프이다. 음영은 증폭 반응의 과정 동안의 시간이 지남에 따른 온도 프로파일(℃)을 나타낸다. 도 17a는 6개의 2'-O-메틸 변형된 염기를 함유하는 프라이머를 사용하여 수행되는 반응에 대한 결과를 보여주며, 도 17b는 7개의 2'-O-메틸 변형된 염기를 사용하여 수행되는 반응에 대한 결과를 보여준다. 두 경우 모두에서, 표적 부재의 음성 대조군 반응은 어떠한 형광 신호도 생성하지 않은 한편, 변형된 프라이머 중 어느 하나를 사용하여 우수한 증폭이 존재하였지만, 평균 형광 신호는 6개의 변형된 염기 프라이머에 대하여 약간 더 높았으며, 군-내 변이는 7개의 변형된 염기 프라이머로부터의 결과에 비하여 상당히 더 낮았다.
도면에서 알 수 있는 바와 같이, 6 및 7개의 2' O-메틸의 스트링을 함유하는 프라이머는 STAR를 사용하여 잘 증폭시켰다. 이것은 가닥 치환 중합효소의 매우 바람직한 온도 영역, 대략 65℃에서 증폭을 시작하는 STAR의 능력 때문일 수 있다. 이러한 바람직한 영역은 중합효소가 더 긴 2' 변형된 스트링을 연장시키게 하여, 다른 기술에서 결여된 개시를 가능하게 할 수 있다. 간결하게 하기 위하여, 데이터는 도시되어 있지 않으나, 더 느리고 더 낮은 형광 신호를 갖지만, 프라이머 영역의 전체 길이가 2'-O-메틸로 변형되고, 증폭을 나타낸 것이 또한 기재될 수 있다.
실시예 9: 리보핵산을 사용한 결과
STAR은 임의의 조성의 DNA(cDNA 및 gDNA), RNA(mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, 마이크로RNA), RNA/DNA 유사체, 당 유사체, 혼성물, 폴리아미드 핵산 및 기타 알려져 있는 유사체를 사용하여 임의의 핵산으로부터 증폭시킬 수 있다. 리보솜 RNA의 증폭을 하기 기재된 바와 같이 수행하였다.
효소, 올리고뉴클레오티드 및 표적:
리스테리아 모노사이토게네스를 STAR RNA 검정의 개발을 위한 표적으로서 사용하였다. 리스테리아 모노사이토게네스(ATCC VR-886) 게놈 DNA를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버니지아주 머내서스 소재)으로부터 획득하였다. 초기 스크리닝을 gDNA에서 수행하였으며, 리보솜 RNA의 23S 영역이 프라이머 LMONF72(SEQ ID NO: 4, 5'- GGACTCGATATCGAGTCCAGTTACGATTTGTTG-3') 및 LMONR86(SEQ ID NO: 5, 5'- gGACTCCATATGGAGTCCTACGGCTCCGCTTTT-3')으로 증폭되는 것으로 관찰되었다. 생성된 DNA 주형을 EP 제0728218호에 기재된 바와 같이 분자 비콘 LMONMB1(SEQ ID NO: 6, 5'-FAM/gctgcGTTCCAATTCGCCTTTTTCGCagc/BHQ1-3')을 사용하여 검출하였다. 전체 RNA를 미니 비드 밀(Mini Bead Mill) 4(VWR)에서의 신속한 기계적 용해와 병용하여 RNeasy 플러스 미니 키트 퀴아젠(plus mini kit Qiagen)(독일 힐덴 소재)을 사용하여 분리하였다. 리스테리아 모노사이토게네스(ATCC BAA-2660)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버니지아주 머내서스 소재)으로부터 획득하고, 뇌-심장 침출 한천 플레이트(BHI) 상에 플레이팅함으로써 회복시켰다. 단일의 콜로니를 사용하여 25 ㎖의 BHI 배지를 접종하고, 이를 37℃에서 18시간 동안 성장시켜, 정지상에 도달하였다. 이어서 배양물을 다시-희석하고, 추가 4시간 동안 성장시킨 후 수확하였다. 박테리아 펠렛을 RLT 용해 완충제에 재현탁화시키고, 미니 비드 밀(VWR) 상에서 균질화시켰다. 전체 RNA를 제조처의 지침(퀴아젠)에 따라 정제하였다. 용해물을 RNeasy 플러스 정제 키트에 제공되는 DNA-결합 컬럼을 통과시킴으로써 게놈 DNA를 제거하였다. RNeasy RNA-결합 컬럼에서 시료의 컬럼-상 DNAse I 분해에 의해 게놈 DNA 오염을 추가로 최소화시켰다. Bst X DNA 중합효소를 비벌리 퀴아젠(미국 매사추세츠주 비벌리 소재)으로부터 구입하였다. 옴니스크립트(Omniscript), 역전사효소를 퀴아젠(독일 힐덴 소재)으로부터 구입하였다. Nt.BstNBI 닉킹 엔도뉴클레아제를 미국 특허 제6,191,267호에 기재된 바와 같이 뉴 잉글랜드 바이오랩스(미국 매사추세츠주 입스위치 소재)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드 및 분자 비콘을 인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈(미국 아이오와주 코럴빌 소재)에 의해 합성하였다.
증폭 조건:
기본 STAR 혼합물은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같은 모든 것을 함유하며, 하기를 추가로 포함하였다: 4U의 역전사효소(상기 참조) 및 Bst.X로의 Manta 1.0의 대체.
결과는 도 18에 나타나 있으며, 이는 시간(분)에 대한 형광(임의 단위)의 그래프이다. 음영은 반응의 과정 동안의 온도 프로파일을 나타낸다. 음성 대조군 반응은 어떠한 형광 신호도 생성하지 않은 한편, 10, 100 또는 1000 카피수 표적 반응은 감소하는 양의 시간(각각 대략 3.5분, 3.0분 및 2.75분) 내에 역치를 초과하는 형광 신호를 생성하였다. 결과는 STAR이 역전사된 RNA 표적으로부터 효율적으로 증폭시킬 수 있음을 보여준다.

Claims (32)

  1. 비등온 핵산 증폭 반응의 수행 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 프라이머가 표적에 혼성화하는 혼성화 사건(hybridisation event)을 허용하는 조건에서 하나 이상의 상보적 단일 가닥 프라이머와 표적 서열을 혼합하는 단계로서, 상기 혼성화 사건이 듀플렉스에 배치된 2개의 닉킹 부위를 포함하는 듀플렉스 구조의 형성을 직접적으로 또는 간접적으로 야기하는 단계; 및
    (b) 상기 듀플렉스의 가닥 내의 상기 닉킹 부위(nicking site)의 각각에서 닉을 야기하는 단계;
    (c) 중합효소를 사용하여 상기 닉킹된 가닥을 연장시켜, 새로 합성된 핵산을 형성하는 단계로서, 상기 중합효소를 사용한 연장이 닉킹 부위를 재생성하는 단계;
    (d) 단계 (b) 및 (c)를 원하는 대로 반복하여 다수의 카피의 새로 합성된 핵산의 생성을 야기하는 단계에 의해 증폭 과정을 수행하는 것을 포함하며;
    상기 방법이 수행되는 온도가 비등온이고, 단계 (b) 내지 (d)의 증폭 과정 동안 적어도 2℃의 감소를 겪으며, 상기 온도가 감소 전 온도로 복귀되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 상기 표적이 제1 핵산 가닥 및 제2 핵산 가닥을 포함하고, 각각의 상기 가닥은 프라이머 각각에 대해 상보적인 부분을 포함하며, 상기 프라이머가 상기 표적의 각각의 가닥에 각각 상보적인 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하여, 상기 정방향 및 역방향 프라이머의 3' 말단이 서로를 향해 배향되게 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 온도가 상기 증폭 반응 동안 적어도 5℃의 제어된 감소를 겪는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 증폭 반응 동안 평균 온도 감소 속도가 -0.10℃ 내지 -6.0℃ 분-1의 범위인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 (b) 내지 (d)가 단계 (a) 직후에 수행되며, 단계 (a) 내지 (d)가 동일한 반응 용기 내에서 또는 동일한 고체 지지체 상에서 수행되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 55℃ 내지 62℃의 범위의 온도에서 수행되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 새로 합성된 핵산을 직접적으로 또는 간접적으로 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 검출 단계가 분자 비콘(molecular beacon) 또는 형광 염료, 측방 유동(lateral flow) 표지된 프로브, 또는 전기화학적 반응을 촉매작용시키는 효소의 이용을 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단계 (b)가 닉킹 효소의 이용을 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 최적 온도를 갖는 제1 중합효소, 제1 닉킹 효소, 또는 제1 중합효소 및 제1 닉킹 효소, 및 최적 온도를 갖는 제2 중합효소, 제2 닉킹 효소, 또는 제2 중합효소 및 제2 닉킹 효소의 이용을 포함하는 방법으로서, 상기 제2 중합효소, 제2 닉킹 효소, 또는 제2 중합효소 및 제2 닉킹 효소의 최적 온도가 상기 각각의 제1 중합효소, 제1 닉킹 효소, 또는 제1 중합효소 및 제1 닉킹 효소의 최적 온도보다 더 낮은 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제2 중합효소가 Bsu 중합효소, 또는 DNA 중합효소의 클레나우(Klenow) 단편인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 증폭 반응의 초기 온도가 상기 제1 닉킹 효소의 최적 온도이거나 그의 초과이며, 상기 온도가 상기 증폭 반응의 과정 동안 상기 제1 닉킹 효소의 최적 온도 미만의 온도까지 감소되는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 증폭 반응의 온도가 상기 제2 중합효소, 제2 닉킹 효소, 또는 제2 중합효소 및 제2 닉킹 효소의 최적 온도까지 또는 그 미만까지 감소되는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 방법의 수행에 의해 수득되는 혼합물을 핵산을 분해하는 열불안정성 효소와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 혼합물은 상기 열불안정성 효소가 활성인 온도에서 상기 열불안정성 효소와 접촉되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 효소가 대구(cod) 우라실-DNA 글리코실라제(UDG), 또는 남극(Antarctic) 열불안정성 UDG인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 관심 RNA 분석물을 역전사효소와 접촉시켜, 관심 RNA 분석물의 DNA 전사물을 형성하는 것을 포함하는 역전사 단계를 수행하는 것이 단계 (a)에 선행되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 DNA 전사물로부터 이중 가닥 DNA를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 사전증폭 또는 농축 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 중 하나 이상이 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드가 상기 프라이머의 표적-상보적 부분 내에 존재하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 프라이머가 2'-변형된 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 프라이머가 2' O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 프라이머가 복수의 2' O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 하나 이상의 프라이머가 최대 7개까지의 2' O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 단계 (b) 내지 (d) 동안 상기 반응의 온도가 상기 단계 (a)가 수행되는 온도로 복귀되지 않는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 중 하나 이상이 자가-상보적 부분을 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 자가-상보적 부분이 헤어핀 구조를 형성하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 헤어핀이 5 내지 10개의 염기쌍을 포함하는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b) 내지 (d) 동안의 온도 감소의 크기가 8℃ 내지 20℃의 범위인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 장치로서, 상기 장치가 온도 조절 수단, 및 상기 방법을 수행하기 위해 사용되는 반응 혼합물의 증폭 과정 동안 적어도 2℃의 온도 감소를 수행하기 위하여 상기 온도 조절 수단을 작동시키도록 프로그래밍되는 프로그래밍 가능한 제어 수단을 포함하고, 상기 온도 조절 수단이 증폭 과정 동안 감소 전 온도로 복귀되지 않도록 프로그래밍되는, 장치.
  31. 삭제
  32. 삭제
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201611469D0 (en) 2016-06-30 2016-08-17 Lumiradx Tech Ltd Improvements in or relating to nucleic acid amplification processes
GB2569965A (en) 2018-01-04 2019-07-10 Lumiradx Uk Ltd Improvements in or relating to amplification of nucleic acids
GB201812149D0 (en) 2018-07-25 2018-09-05 Sense Biodetection Ltd Nucleic acid detection method
GB201915346D0 (en) 2019-06-21 2019-12-04 Lumiradx Tech Ltd Improvements in or relating to nicking enzymes
CN115003828A (zh) 2020-01-25 2022-09-02 圣斯生物检测有限公司 病毒检测
WO2021180733A1 (en) * 2020-03-09 2021-09-16 Illumina, Inc. Methods for sequencing polynucleotides
EP4347868A1 (en) 2021-05-27 2024-04-10 Lumiradx Uk Ltd Improvements in or relating to digestion of reaction products
TW202330759A (zh) * 2021-09-16 2023-08-01 美商賽克股份有限公司 老化再生二酸結晶之方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008520232A (ja) 2004-11-22 2008-06-19 ビオ−ラド・パストゥール 核酸を増幅するための組成物
US20090081670A1 (en) 2007-07-14 2009-03-26 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
WO2011030145A1 (en) 2009-09-08 2011-03-17 Enigma Diagnostics Limited Nucleic acid amplification employing temperature oscillation

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2017821C1 (ru) * 1990-10-10 1994-08-15 Анатолий Михайлович Онищенко Способ амплификации днк и устройство для его осуществления
US5432065A (en) 1993-03-30 1995-07-11 United States Biochemical Corporation Cycle sequencing with non-thermostable DNA polymerases
US20020025555A1 (en) * 1997-03-06 2002-02-28 Janice Au-Young GPCR diagnostic for brain cancer
EP1049806B1 (en) 1998-01-27 2002-07-10 Cytocell Limited Method for detection of nucleic acid target sequences involving in vitro transcription from an rna promoter
ATE286981T1 (de) * 1999-09-28 2005-01-15 Roche Diagnostics Gmbh Thermostabiles enzym welches die genauigkeit thermostabiler dna polymerasen erhöht - zur verbesserung der nucleinsäuresynthese und in vitro amplifikation
US20010047200A1 (en) 1999-10-13 2001-11-29 Raymond Sun Non-foreshortening intraluminal prosthesis
NO314091B1 (no) * 2000-01-12 2003-01-27 Biotec Pharmacon Asa Varmelabil uracil-DNA-glykosylase, DNA-sekvens som koder for enzymet, mikroorganisme som inneholder DNA-sekvensen, samt anvendelse av enzymet
US6191267B1 (en) 2000-06-02 2001-02-20 New England Biolabs, Inc. Cloning and producing the N.BstNBI nicking endonuclease
DE60115811T2 (de) 2000-10-25 2006-08-03 Roche Diagnostics Gmbh Amplifizierung unter Verwendung von modifizierten Primern
GB0101397D0 (en) 2001-01-19 2001-03-07 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Suppression of non-specific nucleic acid amplication
US20030211506A1 (en) 2001-06-01 2003-11-13 Huimin Kong N. bstnbi nicking endonuclease and methods for using endonucleases in single-stranded displacement amplification
US20030165911A1 (en) 2001-07-15 2003-09-04 Keck Graduate Institute Gene expression analysis using nicking agents
AU2002217428A1 (en) 2001-12-04 2003-06-17 Bio3 Research Srl Mixture of two partially denaturating agents for the preparation of pcr buffer solutions
US7399590B2 (en) 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
WO2004055193A1 (fr) 2002-12-18 2004-07-01 Dingbang Xu Procede pcr et application par temperature de thermo-denaturation basse transnormale
EP1615942B1 (en) 2003-04-01 2016-03-16 Luminex Corporation Polymerase inhibitor and method of using same
EP3540073B1 (en) 2004-06-01 2021-08-25 Abbott Diagnostics Scarborough, Inc. Recombinase polymerase amplification
US7754473B2 (en) 2004-06-04 2010-07-13 Abacus Diagnostica Oy Temperature control of reaction vessel, system with reaction vessel, software product for system and use of system
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
US7537917B2 (en) 2006-03-31 2009-05-26 Collins Michael J Microwave assisted PCR amplification of DNA
WO2008002920A2 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Epoch Biosciences, Inc. Methods for generating target nucleic acid sequences
ES2725003T3 (es) 2007-03-28 2019-09-18 Signal Diagnostics Sistema y método de análisis de alta resolución de ácidos nucleicos para detectar variaciones de secuencia
WO2009042291A2 (en) * 2007-08-03 2009-04-02 Igor Kutyavin Accelerated cascade amplification (aca) of nucleic acids comprising strand and sequence specific dna nicking
FI20085450A0 (fi) 2008-05-14 2008-05-14 Arto Orpana Menetelmä DNA-juosteen syntetisoimiseksi
US20130059290A1 (en) 2009-09-25 2013-03-07 Alere San Diego, Inc. Detection of nucleic acids in crude matrices
BR112012026945B1 (pt) * 2010-04-20 2021-05-25 Qiagen Gmbh método e aparelho para controlar a temperatura de um líquido
US9845495B2 (en) 2010-12-10 2017-12-19 Abbott Laboratories Method and kit for detecting target nucleic acid
CN103370425B (zh) 2010-12-17 2019-03-19 生命技术公司 用于核酸扩增的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒
CA2853615C (en) 2011-04-20 2016-07-05 Mesa Tech International, Inc. Integrated device for nucleic acid detection and identification
US8343752B2 (en) * 2011-05-03 2013-01-01 Verdezyne, Inc. Biological methods for preparing adipic acid
DK2836609T4 (da) 2012-04-09 2022-09-05 Envirologix Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til kvantificering af en nucleinsyresekvens i en prøve
EP3778915A1 (en) 2012-06-08 2021-02-17 Ionian Technologies, LLC Nucleic acid amplifications
ES2754251T3 (es) 2014-01-15 2020-04-16 Abbott Lab Secuencia cubierta de conversión de ADN y métodos de detección
JP6773651B2 (ja) 2014-10-14 2020-10-21 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ポリｄｎａスペーサー配列を有する配列変換およびシグナル増幅ｄｎａならびにそれらを用いた検出方法
CN108064312B (zh) 2014-12-24 2022-04-08 雅培实验室 基于具有靶扩增的信号放大dna级联反应的检测方法
GB201513128D0 (en) 2015-07-24 2015-09-09 Sense Biodetection Ltd Nucleic acid detection method
CN108138209B (zh) 2015-08-12 2022-06-10 环基因治疗诊断有限责任公司 通过原位扩增制备细胞游离核酸分子的方法
US10329601B2 (en) 2015-12-28 2019-06-25 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction (NEAR) of Streptococcus species
GB201611469D0 (en) 2016-06-30 2016-08-17 Lumiradx Tech Ltd Improvements in or relating to nucleic acid amplification processes
GB201701262D0 (en) 2017-01-25 2017-03-08 Sense Biodetection Ltd Nucleic acid detection method
RU2020100221A (ru) 2017-08-31 2021-09-30 Иониан Текнолоджис, Ллс Реакция амплификации с разрывом и удлинением (near) разновидностей респираторно-синцитиального вируса
GB2569965A (en) 2018-01-04 2019-07-10 Lumiradx Uk Ltd Improvements in or relating to amplification of nucleic acids
GB201812149D0 (en) 2018-07-25 2018-09-05 Sense Biodetection Ltd Nucleic acid detection method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008520232A (ja) 2004-11-22 2008-06-19 ビオ−ラド・パストゥール 核酸を増幅するための組成物
US20090081670A1 (en) 2007-07-14 2009-03-26 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
WO2011030145A1 (en) 2009-09-08 2011-03-17 Enigma Diagnostics Limited Nucleic acid amplification employing temperature oscillation

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Publication number Publication date
JP2019519231A (ja) 2019-07-11
US20230340579A1 (en) 2023-10-26
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EP3478853A1 (en) 2019-05-08
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