CN106676174B - 黑腹果蝇中胰岛素样肽ilp系列基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法。该引物组合物包括胰岛素样肽与RNA内参的RT扩增引物和PCR扩增引物。该试剂盒包括DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、Z溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品。本发明可同时针对黑腹果蝇7种胰岛素样肽进行检测，一天内可完成192个样品的检测，既节约生产和检测成本，又提高检测效率；RNA内参提供样品RNA完整性的对照内参，确保检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性，使得检测具有更好的灵敏度和特异性，从而避免了其他检测方法特异性不高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种多重基因检测试剂盒及其应用，尤其是涉及一种黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法。
背景技术
在人类和哺乳动物中，胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞分泌的一种重要激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。胰岛素还可以促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入细胞内；并促进脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。由于胰岛素在代谢调节中的重要作用，胰岛素信号通路在各种生理和病理过程(例如癌症、衰老)中的作用日益得到人们的重视。
黑腹果蝇是科学家们最为青睐的模式生物之一。之前发达的遗传学研究已经让科学家能自由“改造”果蝇的基因和神经元，用来探究生命机制。在果蝇中，存在类似人类胰岛素的胰岛素样肽(insulin-like peptide)，包括Insulin-like peptide 1(Dilp1)，Insulin-like peptide 2(Dilp2),Insulin-like peptide 3(Dilp3),Insulin-likepeptide 4(Dilp4),Insulin-like peptide 5(Dilp5),Insulin-like peptide 6(Dilp6),Insulin-like peptide 7(Dilp7)。黑腹果蝇中的胰岛素样肽表达水平成为研究关注的热点。
目前已有的检测黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平的方法包括实时荧光定量PCR,荧光原位杂交、基因芯片,RNA测序等技术。
(1)目前采用最多的方法是实时荧光定量PCR。荧光定量PCR技术的优点：灵敏性高，并可精确定量，但也存在如下缺点：1)通量低：如果只用一种荧光标记，一次只能检测一个基因。当一个样品同时需要检测多种基因时，必须一个一个检测，成本相对增高，效率低，周期长，对大批量的样品更是无从下手。2)成本相对较高：如需要同时检测多个基因，就需要采用多种荧光标记；目前最多共同使用4到5种荧光标记，用于标记每个待检测基因片段，因此采用多种荧光标记成本相对较高。
(2)荧光原位杂交方法是将荧光标记的基因探针原位杂交到细胞内核酸上，通过荧光显微镜来检测亮度定量基因表达水平，存在通量低、灵敏度较低、成本高的缺点。
(3)基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于芯片，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。具有高通量的优点，但是技术成本昂贵、复杂，探针的合成与固定比较复杂，不能精确定量，重复性差，灵敏度较低。
(4)RNA测序作为一种较新的技术，具有灵敏性高、通量高的优点，但是成本昂贵。
GenomeLabTMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了96孔板的排列特性，降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法，通过Beckman Coulter染色标记，在同一个EP管中同时分析多个基因的表达，能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述几种检测方法存在的缺陷，具有以下优点：1、高通量：本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，可以实现单个反应同时检测多达30-40个基因，可同时做192个反应。2、准确性强：GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；3、敏感性高，结果重复性好：GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度；4、方法简便，使用经济：GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广；5、精确定量、灵活性强：可精确定量基因拷贝数，可随时根据需求调整检测的靶基因。6、易于实现自动化：就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报告。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平检测的引物组合物，包括胰岛素样肽与RNA内参的RT扩增引物和PCR扩增引物；其中RT扩增引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15；PCR扩增引物为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16。
本发明的另一个目的是提供黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平检测的试剂盒，包括如下：
DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、Z溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品；
所述的反转录引物包括以下表1和表2中7种胰岛素样肽与RNA内参的RT扩增引物；
所述的PCR引物包括表1和表2中7种胰岛素样肽与RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表2所示。各胰岛素样肽基因特征峰值见表3。
表1胰岛素样肽与RNA内参的扩增引物
表2扩增引物基因序列
表3胰岛素样肽基因特征峰位置
所述的Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO.17；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，如SEQ ID NO.18；其中通用引物正向扩增引物带荧光标记。
所述的阳性对照品为连接有设计上述7种基因和RNA内参的目标检测序列的USC1.0的克隆载体。
本发明的又一个目的是提供上述试剂盒的使用方法，该方法基于GeXP多重基因表达遗传分析系统，具有特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的优点，具体包括以下步骤：
步骤(1)、采集样本并提取核酸
采集黑腹果蝇的组织样本，分离提取核酸；
步骤(2)、以核酸为模板进行RT反应
取5-30ng/ul的核酸样品RNA5μL，DEPC水8μL，5×RT缓冲液4μL，RT引物溶液2μL，RT酶1μL混匀后加入到96孔样品板上进行反转录，反应条件：48℃1分钟，42℃60分钟，95℃5分钟，4℃直至收取RT产物，其中反转录引物溶液中各RT引物浓度均为300nM，所述的RT引物包括7种胰岛素样肽与RNA内参的RT扩增引物，基因序列如表1和表2所示；
步骤(3)、以反转录产物为模板进行PCR反应
取RT产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，Z溶液2μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃2分钟；94℃30秒钟，60℃30秒钟，70℃1分钟，循环35次；70℃1分钟；4℃直至收取PCR产物；其中PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为250nM，PCR引物包括7种胰岛素样肽与RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如表1和表2所示。
步骤(4)、GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
取PCR产物0.2-1μL，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL，DNA标准品0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的实验组图谱与对照组图谱对比，判断基因表达的变化，并通过软件得到表达增加或者减少的百分比。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明所设计的特异性扩增引物，可以同时针对黑腹果蝇7种胰岛素样肽进行检测，一天之内可完成192个样品的检测，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间；RNA内参，提供了样品RNA完整性的对照内参，确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性，并监控反应效率，使得检测具有更好的灵敏度和特异性，从而避免了其他检测方法特异性不高的问题。
综上所述，本发明基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测黑腹果蝇中7种胰岛素样肽(ILP)系列基因表达水平的试剂盒及其检测方法，可以同时针对7种胰岛素样肽基因进行检测，检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率，还能够有效解决常规PCR的易污染问题；具有非竞争性内对照体系，可靠性强，无假阴性结果，利用GeXP遗传分析系统灵敏、准确定量、快速、高通量的技术优势，将为研究机构提供一种灵敏、准确、快速且低成本的多重基因检测方案。
附图说明
图1为GeXP遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果对照组图谱；
图2为GeXP遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果实验组组图谱。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施1：
本发明为一种黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平检测的试剂盒，该试剂盒中包括以下试剂：
1)DEPC水
2)5×RT缓冲液
3)反转录引物(RT primer mix)
4)RT酶(全称反转录酶)
5)溶液Z
6)10×PCR缓冲液
7)PCR引物
8)25mM氯化镁溶液
9)DNA聚合酶
10)阳性对照
上述的反转录引物包括表1和表2中7种胰岛素样肽与RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括表1和表2中7种胰岛素样肽与RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表2所示。
上述Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向扩增引物带荧光标记。
上述阳性对照品为连接有设计上述7种胰岛素样肽基因和RNA内参的目标检测序列的USC1.0的克隆载体。
上述基因靶位点设计：选择对黑腹果蝇该基因特异、且针对该基因各个mRNA亚型(transcript variant)之间的保守区域基因片段设计引物，即能够特异性检测该基因的各个mRNA亚型，而不出现非特异性检测到其他基因。
(1)黑腹果蝇胰岛素样肽基因1Insulin-like peptide 1(Ilp1)位点：黑腹果蝇Ilp1基因仅有一个mRNA亚型(transcript variant)，可特异性检测到该mRNA亚型
(2)黑腹果蝇胰岛素样肽基因2Insulin-like peptide 2(Ilp2)位点：黑腹果蝇Ilp2基因仅有一个mRNA亚型(transcript variant)，可特异性检测到该mRNA亚型
(3)黑腹果蝇胰岛素样肽基因3Insulin-like peptide 3(Ilp3)位点：黑腹果蝇Ilp3基因仅有一个mRNA亚型(transcript variant)，可特异性检测到该mRNA亚型
(4)黑腹果蝇胰岛素样肽基因4Insulin-like peptide 4(Ilp4)位点：黑腹果蝇Ilp4基因仅有一个mRNA亚型(transcript variant)，可特异性检测到该mRNA亚型
(5)黑腹果蝇胰岛素样肽基因5Insulin-like peptide 5(Ilp5)位点：黑腹果蝇Ilp5基因仅有一个mRNA亚型(transcript variant)，可特异性检测到该mRNA亚型
(6)黑腹果蝇胰岛素样肽基因6Insulin-like peptide 6(Ilp6)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Ilp6基因4个mRNA亚型(transcript variant)，且4个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。
(7)黑腹果蝇胰岛素样肽基因7Insulin-like peptide 7(Ilp7)位点：黑腹果蝇Ilp7基因仅有一个mRNA亚型(transcript variant)，可特异性检测到该mRNA亚型
(8)RNA内参：选用黑腹果蝇RpL32(ribosomal protein L32)基因，可检测样品中RNA的完整性。
实施例2：
本发明一种黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平检测的试剂盒，检测的基因包括黑腹果蝇中胰岛素样肽1，胰岛素样肽2，胰岛素样肽3，胰岛素样肽4，胰岛素样肽5，胰岛素样肽6，胰岛素样肽7(见表1)。采集黑腹果蝇样品，提取核酸，以样品核酸为模板进行反转录和PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：
1、生产基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平检测的试剂盒，试剂盒中包括的组分同上述实施例1；
2、采集样本并提取核酸
采集黑腹果蝇的实验组及对照组样本，分离提取核酸；
3、以样品核酸为模板进行反转录(RT)反应
1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(RT板见表4)：
表4RT反应试剂和样品混合比例
注：在RT反应中加入阳性对照品，阳性对照品为由各目标基因克隆所得，包含目标片段质粒，用量为1μL/反应。
2)混匀后按以下温度孵育(见表5)：
表5RT反应条件
4、以反转录产物为模板进行PCR反应
1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(PCR板见表6)：
表6PCR反应试剂和样品混合比例
注：Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向扩增引物带荧光标记。
2)混匀后按以下温度进行热循环反应(见表7)：
表7PCR反应条件
5、GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
1)制备GeXP样品(见表8)：
表8GeXP样品混合比例
2)毛细电泳分离样品
将GeXP样品加入96孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中进行毛细管电泳分离；毛细管电泳分离是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具体程序为90℃变性120秒，进样电压2kv，30秒，分离电压6kv，35分钟。
6、结果分析(见GenomeLab GeXP遗传分析仪说明书)
根据GeXP遗传分析仪自有软件上默认的参数对结果进行片段大小分析，其横坐标表示片段大小，纵坐标为信号强弱。将GeXP遗传分析仪的软件获得的实验组图谱与对照组图谱对比，判断胰岛素样肽基因表达的变化，并通过软件得到表达增加或者减少的百分比(表9)。对照组图谱如图1所示，实验组对照组图谱如图2所示。对照组为野生型黑腹果蝇w1118，实验组为嗅觉基因Or83b突变的黑腹果蝇，嗅觉基因Or83b突变降低了黑腹果蝇的胰岛素样肽基因表达水平，并延长了黑腹果蝇寿命。其结果能准确检测出7种黑腹果蝇中胰岛素样肽的基因靶标的表达水平，各目标片段大小间隔适中，且信号不至于过饱和，各靶标间信号相对持平，且没有宽峰、双峰等现象。
表9胰岛素样肽基因表达的变化
实施例3：检测试剂盒灵敏度、特异性分析
灵敏度分析：将阳性对照按一定拷贝数倍比稀释后，经PCR扩增和毛细管电泳检测直至检测不到信号，该拷贝数即为最低检测线，也就是试剂盒的灵敏度。灵敏度达45拷贝。
特异性分析：单重PCR扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州电子科技大学
<120> 黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及
其使用方法
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<170> PatentIn version 3.3
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Claims (4)
1.黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平检测的引物组合物，其特征在于包括胰岛素样肽与RNA内参的RT PCR扩增引物和PCR扩增引物；其中RT PCR扩增引物为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15；PCR扩增引物为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16。
2.如权利要求1所述的黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平检测的引物组合物，其特征在于胰岛素样肽包括Insulin-like peptide 1 (Dilp1)，Insulin-likepeptide 2 (Dilp2), Insulin-like peptide 3 (Dilp3), Insulin-like peptide 4(Dilp4), Insulin-like peptide 5 (Dilp5), Insulin-like peptide 6 (Dilp6),Insulin-like peptide 7 (Dilp7)。
3.黑腹果蝇中胰岛素样肽ILP系列基因表达水平检测的试剂盒，其特征在于包括DEPC水、5×RT PCR缓冲液、反转录引物、反转录酶、Z溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品；
所述的反转录引物包括如权利要求1所述的RT PCR扩增引物；
所述的PCR引物包括如权利要求1所述的的PCR扩增引物；
所述的Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸dNTPs和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为 AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO.17；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，如SEQ ID NO.18；其中通用引物正向扩增引物带荧光标记。
4.如权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤（1）、采集黑腹果蝇的组织样本，分离提取核酸；
步骤（2）、以核酸为模板进行RT PCR反应
取5-30ng/ul的核酸样品RNA5μL，DEPC水 8μL， 5×RT PCR 缓冲液 4μL，RT PCR引物溶液 2μL，RT PCR酶 1μL 混匀后加入到 96 孔样品板上进行反转录，反应条件： 48℃ 1分钟，42℃ 60分钟，95℃ 5分钟，4℃直至收取 RT PCR 产物，其中反转录引物溶液中各RTPCR引物浓度均为300nM， RT PCR引物为如权利要求1所述的RT PCR扩增引物；
步骤（3）、以反转录产物为模板进行 PCR 反应
取RT PCR产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL， DNA聚合酶 1.4μL，Z 溶液 2μL 混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃ 2分钟；94℃ 30秒钟，60℃ 30秒钟，70℃ 1分钟，循环35次；70℃ 1分钟；4℃直至收取PCR产物；其中PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为250nM，PCR引物为如权利要求1所述的PCR扩增引物；
步骤（4）、GeXP 遗传分析仪毛细电泳分离样品
取PCR产物0.2-1μL，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL， DNA标准品 0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的实验组图谱与对照组图谱对比，判断基因表达的变化，并通过软件得到表达增加或者减少的百分比。
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| An evolutionarily conserved function of the Drosophila insulin receptor and insulin-like peptides in growth control;WalterBrogiolo等;《Research Paper》;20010220;第11卷(第4期);第213-221页，表1，图1-5 * |
| WalterBrogiolo等.An evolutionarily conserved function of the Drosophila insulin receptor and insulin-like peptides in growth control.《Research Paper》.2001,第11卷(第4期),第213-221页. * |
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