CN106701953B

CN106701953B - 黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN106701953B
Application number: CN201710010993.4A
Authority: CN
Inventors: 沈洁
Original assignee: Hangzhou Dianzi University
Current assignee: Hangzhou Dianzi University
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2017-01-06
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2037-01-06
Also published as: CN106701953A

Abstract

本发明公开黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法。该引物组合物包括基于生理节律调控关键基因与RNA内参的扩增引物。试剂盒包括DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、Z溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品。本发明可同时针对黑腹果蝇生理节律调控关键基因进行检测，一天内可完成192个样品检测，既节约了生产和检测成本，又提高了检测效率；RNA内参提供样品RNA完整性的对照内参，确保检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性，使得检测具有更好的灵敏度和特异性，从而避免了其他检测方法特异性不高的问题。

Description

黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种多重基因检测试剂盒及其应用，尤其是涉及一种黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测试剂盒及其应用。

背景技术

生理节律(circadian rhythm)即生物钟规律，是以从白天到夜晚生命活动24小时为周期的内在周期性节律，与地球自转一次吻合。为了适应这种昼夜环境周期性的变化，地球上的生物体包括人类，形成内部一系列的基因和蛋白分子以及信号通路有规律的调控机制，以协调各种不同组织与器官的昼夜节律。无论是植物还是动物在发育、行为、生理、代谢等生命活动的各个层面都受到生理节律的调控。近年来科学家们已经发现了一系列重要的生理节律调控关键基因，然而目前对于这些关键基因与各种生理现象之间的关联，例如生理节律与免疫系统间的关联性、生理节律与肥胖症的关联，却还知之甚少。

由于黑腹果蝇表现出特征性的早晚运动活性，有稳定的生活节律：白天活动，夜晚休息，并且黑腹果蝇中调控生理节律的基因和人类一致，因此，黑腹果蝇被证明是研究生理节律体系的一个好模型。此外，发达的遗传学研究已经让科学家能自由“改造”果蝇的基因，用来探究生理节律机制。在黑腹果蝇中，有6个关键的生理节律调控基因：timeless(tim)，period(per)，PAR-domain protein 1(Pdp1)，vrille(vri)，clock(Clk)，cryptochrome(cry)。黑腹果蝇中的生理节律调控关键基因表达水平成为研究关注的热点。

目前已有的检测黑腹果蝇中生理节律调控基因表达水平的方法包括实时荧光定量PCR、RNA测序、基因芯片、荧光原位杂交等技术。

(1)目前最常用的方法是实时荧光定量PCR。荧光定量PCR技术的优点：灵敏性高，并可精确定量，但也存在如下缺点：1)通量低：如果只用一种荧光标记，一次只能检测一个基因。当一个样品同时需要检测多种基因时，必须一个一个检测，成本相对增高，效率低，周期长，对大批量的样品更是无从下手。2)成本相对较高：如需要同时检测多个基因，就需要采用多种荧光标记；目前最多共同使用4到5种荧光标记，用于标记每个待检测基因片段，因此采用多种荧光标记成本相对较高。

(2)RNA测序作为一种较新的技术，具有灵敏性高、通量高的优点，但是成本昂贵。

(3)基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于芯片，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。具有高通量的优点，但是技术成本昂贵、复杂，探针的合成与固定比较复杂，不能精确定量，重复性差，灵敏度较低。

(4)荧光原位杂交方法是将荧光标记的基因探针原位杂交到细胞内核酸上，通过荧光显微镜来检测亮度定量基因表达水平，存在通量低、灵敏度较低、成本高的缺点。

GenomeLab^TMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了96孔板的排列特性，降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法，通过Beckman Coulter染色标记，在同一个EP管中同时分析多个基因的表达，能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述几种检测方法存在的缺陷，具有以下优点：1、高通量：本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，可以实现单个反应同时检测多达30-40个基因，可同时做192个反应。2、准确性强：GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性。3、敏感性高，结果重复性好：GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度。4、方法简便，使用经济：GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广。5、精确定量、灵活性强：可精确定量基因拷贝数，可随时根据需求调整检测的靶基因。6、易于实现自动化：就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报告。

发明内容

本发明的一个目的是是提供一种用于黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的引物组合物，包括基于生理节律调控关键基因与RNA内参的RT扩增引物和PCR扩增引物，其中RT扩增引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13；PCR扩增引物为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14。

本发明的另一个目的是是提供一种用于黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的试剂盒，包括如下：

DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、Z溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品；

所述的反转录引物包括以下表1和表2中6种生理节律调控关键基因与RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括表1和表2中6种生理节律调控关键基因与RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表2所示。各个基因特征峰值见表3。

表1六种生理节律调控关键基因

表2扩增引物基因序列

表3生理节律调控关键基因特征峰位置

所述的Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，SEQ ID NO.15；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，SEQ ID NO.16；其中通用引物正向扩增引物带荧光标记。

所述的阳性对照品为连接有设计上述6种基因和RNA内参的目标检测序列的USC1.0的克隆载体。

本发明的又一个目的是提供上述黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测试剂盒的使用方法，该方法基于GeXP多重基因表达遗传分析系统，特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。该方法具体包括以下步骤：

步骤(1)、采集样本并提取核酸

采集黑腹果蝇的组织样本，分离提取核酸；

步骤(2)、以核酸为模板进行RT反应

取5～30ng/ul的核酸样品RNA 5μL，DEPC(焦碳酸二乙酯)水8μL，5×RT缓冲液4μL，RT引物溶液2μL，RT酶1μL混匀后加入到96孔样品板上进行反转录，反应条件：48℃1分钟，42℃60分钟，95℃5分钟，4℃直至收取RT产物，其中反转录引物溶液中各RT引物浓度均为300nM，所述的RT引物包括6种生理节律调控关键基因与RNA内参的RT扩增引物，基因序列如表1和表2所示；

(3)以反转录产物为模板进行PCR反应

取RT产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，Z溶液2μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃2分钟；94℃30秒钟，60℃30秒钟，70℃1分钟，循环35次；70℃1分钟；4℃直至收取PCR产物；PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为250nM，PCR引物包括6种生理节律调控关键基因与RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如表1和表2所示。

(4)GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品

取PCR产物0.2～1μL，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL，DNA标准品0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的实验组图谱与对照组图谱对比，判断生理节律调控关键基因表达的变化，并通过软件得到该基因表达增加或者减少的百分比。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明所设计的特异性扩增引物，可以同时针对黑腹果蝇6种生理节律调控关键基因进行检测，一天之内可完成192个样品的检测，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间；RNA内参，提供了样品RNA完整性的对照内参，确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性，并监控反应效率，使得检测具有更好的灵敏度和特异性，从而避免了其他检测方法特异性不高的问题。

综上所述，本发明基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测黑腹果蝇中6种生理节律调控关键基因表达水平的试剂盒及其检测方法，可以同时针对6种生理节律调控关键基因进行检测，检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率，还能够有效解决常规PCR的易污染问题；具有非竞争性内对照体系，可靠性强，无假阴性结果，利用GeXP遗传分析系统灵敏、准确定量、快速、高通量的技术优势，将为研究机构提供一种灵敏、准确、快速且低成本的多重基因检测方案。

附图说明

图1为GeXP遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果对照组图谱；

图2为GeXP遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果实验组组图谱。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：

本发明为一种黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的试剂盒，该试剂盒中包括以下试剂：

1)DEPC水

2)5×RT缓冲液

3)反转录引物(RT primer mix)

4)RT酶(全称反转录酶)

5)溶液Z

6)10×PCR缓冲液

7)PCR引物

8)25mM氯化镁溶液

9)DNA聚合酶

10)阳性对照

上述的反转录引物包括表1和表2中6种生理节律调控关键基因与RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括表1和表2中6种生理节律调控关键基因与RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表2所示。

上述Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向扩增引物带荧光标记。

上述阳性对照品为连接有设计上述6种生理节律调控关键基因和RNA内参的目标检测序列的USC1.0的克隆载体。

上述基因靶位点设计：选择对黑腹果蝇该基因特异、且针对该基因各个mRNA亚型(transcript variant)之间的保守区域基因片段设计引物，即能够特异性检测该基因的各个mRNA亚型，而不出现非特异性检测到其他基因。

(1)黑腹果蝇基因timeless(tim)位点：可特异性检测到黑腹果蝇tim基因8个mRNA亚型(transcript variant)，且8个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。

(2)黑腹果蝇基因period(per)位点：可特异性检测到黑腹果蝇per基因2个mRNA亚型(transcript variant)，且2个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。

(3)黑腹果蝇基因PAR-domain protein 1(Pdp1)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Pdp1基因13个mRNA亚型(transcript variant)，且13个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。

(4)黑腹果蝇基因vrille(vri)位点：可特异性检测到黑腹果蝇vri基因5个mRNA亚型(transcript variant)，且5个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。

(5)黑腹果蝇基因clock(Clk)位点：可特异性检测到黑腹果蝇Clk基因5个mRNA亚型(transcript variant)，且5个mRNA亚型扩增区域片段长度一致。

(6)黑腹果蝇基因cryptochrome(cry)位点：黑腹果蝇cry基因仅有一个mRNA亚型(transcript variant)，可特异性检测到该mRNA亚型。

(8)RNA内参：选用黑腹果蝇RpL32(ribosomal protein L32)基因，可检测样品中RNA的完整性。

实施例2：

本发明一种黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的试剂盒，检测的基因包括黑腹果蝇基因timeless(tim)，period(per)，PAR-domain protein 1(Pdp1)，vrille(vri)，clock(Clk)，cryptochrome(cry)(见表1)。采集黑腹果蝇样品，提取核酸，以样品核酸为模板进行反转录和PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：

1、生产基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的试剂盒，试剂盒中包括的组分同上述实施例1；

2、采集样本并提取核酸

采集黑腹果蝇的实验组及对照组样本，分离提取核酸；

3、以样品核酸为模板进行反转录(RT)反应

1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(RT板见表4)：

表4 RT反应试剂和样品混合比例

注：在RT反应中加入阳性对照品，阳性对照品为由各目标基因克隆所得，包含目标片段质粒，用量为1μL/反应。

2)混匀后按以下温度孵育(见表5)：

表5 RT反应条件

4、以反转录产物为模板进行PCR反应

1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(PCR板见表6)：

表6 PCR反应试剂和样品混合比例

注：Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向扩增引物带荧光标记。

2)混匀后按以下温度进行热循环反应(见表7)：

表7 PCR反应条件

5、GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品

1)制备GeXP样品(见表8)：

表8 GeXP样品混合比例

2)毛细电泳分离样品

将GeXP样品加入96孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中进行毛细管电泳分离；毛细管电泳分离是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具体程序为90℃变性120秒，进样电压2kv，30秒，分离电压6kv，35分钟。

6、结果分析(见GenomeLab GeXP遗传分析仪说明书)

根据GeXP遗传分析仪自有软件上默认的参数对结果进行片段大小分析，其横坐标表示片段大小，纵坐标为信号强弱。将GeXP遗传分析仪的软件获得的实验组图谱与对照组图谱对比，判断生理节律调控关键基因表达的变化，并通过软件得到表达增加或者减少的百分比(表9)。对照组图谱如图1所示，实验组对照组图谱如图2所示。对照组黑腹果蝇食用正常食物，实验组为对黑腹果蝇进行进食的热量限制(即所食用食物热量含量相对低)，实验组热量限制，引起生理节律调控关键基因表达水平的显著升高，并延长了黑腹果蝇寿命。其结果能准确检测出6种黑腹果蝇中生理节律调控关键基因靶标的表达水平，各目标片段大小间隔适中，且信号不至于过饱和，各靶标间信号相对持平，且没有宽峰、双峰等现象。

表9生理节律调控关键基因表达的变化

实施例3：检测试剂盒灵敏度、特异性分析

灵敏度分析：将阳性对照按一定拷贝数倍比稀释后，经PCR扩增和毛细管电泳检测直至检测不到信号，该拷贝数即为最低检测线，也就是试剂盒的灵敏度。灵敏度达45拷贝。

特异性分析：单重PCR扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州电子科技大学

<120> 黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其

使用方法

<130> 1

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtacgactca ctatagggag aactgaatgc ccgacagga 39

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aggtgacact atagaatagc ctcaaatggg ctttgtcg 38

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gtacgactca ctatagggat gatgtacccg catccttcg 39

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aggtgacact atagaataaa cggacgttcg ggaatctg 38

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtacgactca ctatagggag acagagacag acggtggac 39

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aggtgacact atagaatagg ggtttttcgc agatggtc 38

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gtacgactca ctatagggaa aagcaacgcg aattcaccc 39

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aggtgacact atagaatata gcgcctcttc tctcgact 38

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gtacgactca ctatagggag ggccaacagt ggatatggt 39

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

aggtgacact atagaatagt tcccgtggag gctatgac 38

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gtacgactca ctatagggag tgcgtctgca caggatttg 39

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

aggtgacact atagaatagg tggcgtcttc tagtcgag 38

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gtacgactca ctatagggag caagcccaag ggtatcgac 39

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

aggtgacact atagaatatg cgcttgttcg atccgtaa 38

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

aggtgacact atagaata 18

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gtacgactca ctataggga 19

Claims

1.一种用于黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的引物组合物，其特征在于包括基于生理节律调控关键基因与RNA内参的RT PCR扩增引物和PCR扩增引物，其中RTPCR扩增引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQID NO.11、SEQ ID NO.13；PCR扩增引物为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14。

2.如权利要求1所述的一种用于黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的引物组合物，其特征在于生理节律调控关键基因为timeless (tim)，period (per)，PAR-domain protein 1 (Pdp1)，vrille (vri)，clock (Clk)，cryptochrome (cry)。

3.一种用于黑腹果蝇中生理节律调控关键基因表达水平检测的试剂盒，其特征在于包括DEPC水、5×RT PCR缓冲液、反转录引物、反转录酶、Z溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品；

所述的反转录引物为如权利要求1所述的生理节律调控关键基因与RNA内参的RT PCR扩增引物；

所述的PCR引物为如权利要求1所述的生理节律调控关键基因与RNA内参的PCR扩增引物；

所述的Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸dNTPs和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为SEQ ID NO.15；反向扩增引物序列为SEQ ID NO.16；其中通用引物正向扩增引物带荧光标记。

4.如权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤（1）、采集黑腹果蝇的组织样本，分离提取核酸；

步骤（2）、以核酸为模板进行RT PCR反应

取5～30ng/ul的上述核酸样品RNA 5μL，DEPC水 8μL， 5×RT PCR 缓冲液 4μL，RT PCR引物溶液 2μL，RT PCR酶 1μL 混匀后进行反转录，反应条件：48℃ 1分钟，42℃ 60分钟，95℃ 5分钟，4℃直至收取RT PCR产物，其中反转录引物溶液中各RT PCR引物浓度均为300nM，所述的RT PCR引物为如权利要求1所述的生理节律调控关键基因与RNA内参的RT PCR扩增引物；

步骤（3）、以反转录产物为模板进行 PCR 反应

取上述RT PCR产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶 1.4μL，Z 溶液 2μL 混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃2分钟；94℃ 30秒钟，60℃ 30秒钟，70℃1分钟，循环35次；70℃1分钟；4℃直至收取PCR产物； PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为250nM，PCR引物为如权利要求1所述的生理节律调控关键基因与RNA内参的PCR扩增引物；

步骤（4）、GeXP 遗传分析仪毛细电泳分离样品

取上述PCR产物0.2～1μL，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL， DNA标准品0.5μL，矿物油一滴混合均匀后进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的实验组图谱与对照组图谱对比，判断生理节律调控关键基因表达的变化，并通过软件得到该基因表达增加或者减少的百分比。