CN103773856A - 一种汞离子的超灵敏检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种汞离子的超灵敏检测方法及检测试剂盒。本发明将基于核酸外切酶III介导的信号放大技术与试纸条检测技术相结合，构建一种痕量汞离子的快速检测方法。本方法具有很高的灵敏度，对汞离子的检测限为10pM，检测结果直观，肉眼可见，检测过程方便、迅速，可用于汞离子的实地现场检测；此外，本发明的检测方法具有很好的特异性，常见的其他金属离子对检测不产生影响；构建得到的检测试纸条使用起来省时、省力，检测速度快且操作简单方便，检测结果直观，肉眼可见，不需要使用任何仪器。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种核酸外切酶III介导的信号放大用于痕量汞离子的快速检测方法。
背景技术
汞离子(Hg2+)是一种普遍存在的重金属污染源，对人体危害严重，是环境监测的重要指标。汞离子接触可不同程度地对健康造成一系列有害影响，包括肾脏衰竭、大脑受损、神经系统以及免疫系统损伤。美国环境保护署规定饮用水中汞离子的最大允许量不得超过10nM。目前，汞离子的常规检测方法主要有原子吸收法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法等。但是这些方法操作繁琐，需要麻烦的前处理、专门的分析技术人员以及昂贵的仪器，不利于现场快速分析检测。近年来，利用汞离子能与DNA中的胸腺嘧啶(thymine，T)特异性地结合，形成T-Hg2+-T复合物，设计了一系列传感器用于汞离子的检测(Ono，A and Togashi，H.Angew.Chem.Int.Ed.，2004，43，4300-4302)。但是潜在的缺点是检测灵敏度低，难以满足环境样品检测的需要，因此需要通过信号放大来提高检测灵敏度。
核酸外切酶III(exonuclease III，Exo III)能从双链DNA中的3′末端开始逐步切去单核苷酸。该酶的最适底物是双链DNA中的平齐末端或3′凹馅末端DNA，对单链DNA没有活性，也不能切割双链DNA中的3′突出末端(Zuo，X.；Xia，F.；Xiao，Y and Plaxco，K.W.J.Am.Chem.Soc.，2010，132，1816-1818)。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于将基于核酸外切酶III介导的信号放大技术与试纸条检测技术相结合，构建一种痕量汞离子的快速检测方法。该方法具有很高的灵敏度和特异性，操作简单，检测迅速，检测过程无需使用任何仪器。
本发明所采取的技术方案是：
一种汞离子的超灵敏检测方法，包括如下步骤
(1)构建茎环结构DNA：所述茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，凸出部分含有T碱基；
(2)构建辅助DNA：所述辅助DNA的5’端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的3’端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA，并形成含有3’平末端的部分互补的双链DNA；
(3)将待检样品与茎环结构DNA、辅助DNA混合后，静置反应；
(4)往步骤(3)的反应液中加入核酸外切酶III，在有汞离子存在的情况下，茎环结构DNA和辅助DNA通过T-Hg2+-T复合物互补，形成含有3’平末端的部分互补双链DNA，核酸外切酶III能与部分互补的双链DNA中的3’平末端结合，从而开始切割反应，释放单核苷酸以及汞离子，最后释放出单链DNA，所述单链DNA含有茎环结构DNA的环状区和5’端茎状区；
(5)通过检测步骤(4)释放出的单链DNA来判断待检样品中是否含有汞离子。
在汞离子存在的情况下，辅助DNA的5’段与茎环结构DNA的3’端的突出部分及部分茎状区互补，且辅助DNA的3’末端有至少4个碱基不能与茎环结构DNA互补形成平末端。
作为优选的，所述茎环结构DNA中，环状区部分的碱基数为9～12，茎状区部分的碱基数为18～21个，茎状区的碱基数比环状区的碱基数多。
作为优选的，所述茎环结构DNA的突出部分以及辅助DNA的5’端均含有1～5个T碱基。
步骤(5)可采用电化学法、荧光法、比色法、电化学发光法或试纸条法检测释放出的单链DNA。
作为优选的，步骤(5)采用试纸条法检测释放出的单链DNA，所用试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
所述金标垫上喷射有金标DNA探针1，所述金标DNA探针1与茎环结构DNA的环状区互补；
所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的5’端茎状区互补；
所述质检区上固定有DNA探针3，所述DNA探针3与DNA探针1互补。
一种汞离子的超灵敏检测试剂盒，其包括：
(1)茎环结构DNA：所述茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，凸出部分含有T碱基；
(2)辅助DNA：所述辅助DNA的5’端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的3’端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA，形成含有3’平末端的部分互补的双链DNA；
(3)核酸外切酶III；
(4)检测试纸条。
所述检测试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
所述金标垫上喷射有金标DNA探针1，所述金标DNA探针1与茎环结构DNA的环状区互补；
所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的5’端茎状区互补；
所述质检区上固定有DNA探针3，所述DNA探针3与DNA探针1互补。
所述DNA探针2用链霉亲和素与生物素修饰。
所述DNA探针3用链霉亲和素与生物素修饰。
下面举例介绍一下本发明方法的技术原理：
如图1所示，茎环结构的DNA包含有4个功能区域，分别是1、2、4、和2*区域，其中2和2*是互补的，形成茎环结构的茎状区；4为茎环结构的环状区。在DNA中，5’端用小正方形表示，3’端用箭头表示。茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，即为1区域。在1区域中含有1～5个T碱基。辅助DNA包含有3个区域(1*、2*和3*)，其中在区域1*中也含有1～5个T碱基。在有Hg2+存在时，茎环结构DNA的1区域通过形成T-Hg2+-T复合物与辅助DNA的1*区域结合，在茎环结构DNA的3’末端形成平末端，并开始介导DNA链置换反应，打开茎环结构，使辅助DNA的2*区域和茎环结构DNA的2区域结合，形成更长的部分互补的双链DNA(1*和1互补，2*和2互补)。然后加入核酸外切酶III(Exo III)进行信号放大(图1，反应b)。ExoIII能与部分互补的双链DNA中的3’平末端结合，从而开始切割反应，释放单核苷酸以及汞离子，最后释放出单链DNA(包含2*区域、4区域以及部分2区域)。同时由于部分互补双链DNA中的辅助DNA3’端的3*区域不与茎环结构DNA互补形成平末端，因此Exo III不会切割辅助DNA。最终，切割反应后辅助DNA被释放出来，汞离子也被释放出来，从而可以开始下一轮的反应(图1，反应c)。最后形成大量的单链DNA，可采用电化学法、荧光法、比色法、电化学发光法或试纸条法检测释放出的单链DNA。下面将介绍其中的试纸条法。
如图2所示，检测试纸条包含4个部分：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，这四个部分从左到右依次固定于胶板上(如图2所示)。DNA探针1(DNAprobe1)的5’端用巯基(-SH)修饰，固定在金纳米颗粒(AuNPs)上，形成的AuNPs-DNA probe1复合物喷射在金标垫上。硝酸纤维素膜上划有两个检测区域：检测区和质控区，其中检测区固定的是链霉亲和素(SA)-生物素(biotin)-DNA探针2(SA-biotin-DNA probe2)，质控区固定的是链霉亲和素(SA)-生物素(biotin)-DNA探针3(SA-biotin-DNA probe3)。其中DNA probe1的4*区域与茎环结构DNA的4区域是互补的；DNA probe2的2区域与茎环结构DNA的2*区域是互补的；DNAprobe3与DNAprobe1互补。
将上面得到的单链DNA滴于试纸条的样品垫，通过毛细管迁移作用向前移动，经过金标垫时，单链DNA的4区域与DNAprobe1的4*区域杂交，形成复合物。该复合物继续往前移动，通过检测区时，单链DNA的2*区域会与固定在检测区的SA-biotin-DNA probe2相互作用，从而抓住该复合物，使其在检测区聚集。聚集的金纳米颗粒形成肉眼可见的红色区域。过量的AuNPs-DNA probe1复合物会与质控区上的DNAprobe3杂交，在质控区聚集，从而质控区也呈红色。也就是说有汞离子存在时候，检测区和质控区都显示红色。当没有汞离子存在时，茎环结构的DNA和辅助DNA不会相互作用，Exo III无法作用于茎环结构DNA，因而没有单链DNA形成。从而检测区没有红色出现，而质控区始终显示红色，表明组装的试纸条可用。
本发明的有益效果是：
(1)Exo III能介导信号放大过程，使汞离子可不断循环，达到高灵敏检测的目的；
(2)本发明所述的汞离子的检测方法具有很高的灵敏度，对汞离子的检测限为10pM，检测结果直观，肉眼可见，检测过程方便、迅速，可用于汞离子的实地现场检测；
(3)本发明所述的汞离子检测方法具有很好的特异性，常见的其他金属离子对检测不产生影响；
(4)本发明的试纸条检测方法使用起来省时、省力，检测速度快且操作简单方便，不需要使用任何仪器，不需要专业的技术人员，无须培训即可推广使用。
附图说明
图1为Exo III介导的信号扩增示意图；
图2为试纸条检测示意图；
图3为对不同浓度的汞离子检测的结果图；
图4为特异性实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1一种汞离子的超灵敏检测试剂盒的构建
一、茎环结构DNA与辅助DNA的设计
茎环结构DNA的序列如SEQ ID NO：1所示，其结构如下：
其中，其中2和2*是互补的，构成茎环结构的茎状区；4为茎环结构的环状区；1区域用于启动DNA链置换反应。
辅助DNA的序列如SEQ ID NO：2所示，结构如下：
辅助DNA的1*区域通过形成T-Hg2+-T复合物与茎环结构DNA的1区域结合，从而开始介导DNA链置换反应，打开茎环结构，使辅助DNA的2*区域和茎环结构DNA的2区域结合，形成更长的部分互补的双链DNA。另外辅助DNA的1*可以和茎环结构DNA的1区域形成3’平末端。
二、试纸条的设计及组装
下面试纸条所用到的DNA探针的序列如表1所示。
表1
其中，DNA探针1的4*区域与茎环结构DNA的4区域互补，DNA探针2的2区域与茎环结构DNA的2*区域互补，DNA探针3与DNA探针1互补。
试纸条的组装步骤如下：
(1)金纳米颗粒(胶体金，AuNPs)的制备：在500mL的圆底烧瓶中加入250mL0.01％的HAuCl4溶液，磁力搅拌加热至沸腾，然后向上述溶液中快速加入10mL1％的柠檬酸三钠溶液，溶液20秒内变为蓝色，60秒后变为酒红色，继续煮沸10分钟，停止加热，继续搅拌直至冷却。胶体金溶液4℃避光保存备用。
(2)金标核酸的制备：用100μL超纯水溶解1OD巯基修饰的DNAprobe1，加入到10倍浓缩的胶体金溶液中，4℃反应过夜。然后加入10％的BSA封闭1小时，再加入NaCl和SDS，使其终浓度分别为150mM和0.01％，4℃反应过夜。然后12000转/分钟离心20分钟，弃去上清，沉淀用1mL的重悬液(20mMNa3PO4，5％BSA，0.25％Tween和10％的蔗糖)重悬，重复洗三次后用1mL的重悬液制成悬浮液备用。
(3)样品垫的处理：将玻璃纤维浸泡在0.25％TritonX-100，0.05M Tris-Ac，0.15M NaCl溶液中4个小时后，37℃烘干备用。
(4)金标垫的制备：将本发明制备的金标核酸探针1(AuNPs-DNA probe1)喷射在玻璃纤维上，37℃干燥2小时，制成金标垫，备用。
(5)硝酸纤维素膜上检测区和质控区的制备：将15μL浓度为1.2mg/ml的链霉亲和素与15μL浓度为100μM生物素(biotin)修饰的DNA探针2混合，室温反应1小时候，用划膜喷金仪喷射于硝酸纤维素膜上检测区，37℃干燥1小时即制得检测区。将15μL浓度为1.2mg/ml的链霉亲和素与15μL浓度为100μM生物素(biotin)修饰的DNA探针3混合，室温反应1小时候，用划膜喷金仪喷射于硝酸纤维素膜上质控区，37℃干燥1小时即制得质控区。
(6)试纸条的组装：将样品垫、含有胶体金标记的DNA探针1的金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸依次固定在胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后既得到本发明所述的检测试纸条。
实施例2
利用实施例1构建的试剂盒检测样品，步骤如下：
(1)先用Tris-Ac缓冲液(20mM，含有50mM的NaCl，10mM Mg(Ac)2，pH7.4)分别溶解茎环结构DNA和辅助DNA。
(2)把500nM的茎环结构DNA和300nM的辅助DNA混合，再加入待检样品，混匀，室温放置30分钟。在这一步，如果待检样品中存在Hg2+，辅助DNA的1*区域通过形成T-Hg2+-T复合物与茎环结构DNA的1区域结合，开始介导DNA链置换反应，打开茎环结构，使辅助DNA的2*区域和茎环结构DNA的2区域结合，形成更长的部分互补的双链DNA(1*和1互补，2*和2互补)。并且，茎环结构DNA的3’末端形成平末端。
(3)向(2)中加入30U的Exo III，室温反应30分钟。在Hg2+存在的情况下，辅助DNA与茎环结构DNA的1区域结合形成3’平末端，Exo III能与部分互补的双链DNA中的3’平末端结合，从而开始切割反应，释放单核苷酸以及汞离子，最后释放出单链DNA(包含茎环结构DNA的2*区域、4区域以及部分2区域)。
(4)将步骤(3)的反应液滴加到试纸条的样品垫上，进行检测。反应液通过毛细管迁移作用向前移动，经过金标垫时，单链DNA的4区域与DNA探针1的4*区域杂交，形成复合物。该复合物继续往前移动，通过检测区时，单链DNA的2*区域会与固定在检测区的SA-biotin-DNA探针2相互作用，从而抓住该复合物，使其在检测区聚集。聚集的金纳米颗粒形成肉眼可见的红色区域。过量的AuNPs-DNA探针1复合物会与质控区上的DNA探针3杂交，在质控区聚集，从而质控区也呈红色。也就是说有汞离子存在时候，检测区和质控区都显示红色。当没有汞离子存在时，茎环结构的DNA和辅助DNA不会相互作用，Exo III无法作用于茎环结构DNA，因而没有单链DNA形成。从而检测区没有红色出现，而质控区始终显示红色，表明组装的试纸条可用。
实施例3
对不同浓度的汞离子的检测：
配制汞离子标准溶液，浓度分别为10pM，100pM，1nM，10nM，100nM和500nM，室温保存。
采用实施例2的方法对不同浓度的汞离子溶液进行检测，将反应液(50μL)滴加到试纸条的样品垫上，室温检测，10分钟后观察试纸条的检测区和质控区的颜色变化。
从图3的检测结果可以看出，10pM汞离子存在时，可在试纸条的检测区观察到明显的红色区域，其检测限为10pM，远远低于美国环境保护署规定饮用水中汞离子的最大允许量10nM。并且，随着汞离子浓度的增加(从10pM到100nM)，检测区的颜色也逐渐增加。当汞离子浓度超过500nM时，颜色变化趋于饱和。同时，质控区在各种情况下都呈红色，说明试纸条体系运行正常，结果可信。
实施例4
对不同离子的检测：
配制500nM不同离子的标准溶液，它们分别是pb2+、Cu2+、Cd2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Sn2+、Zn2+、Al3+、Ca2+和Ag+。
将500nM不同的离子标准溶液和10nM汞离子标准溶液分别采用实施例2的方法进行检测，将反应液(50μL)滴加到试纸条的样品垫上，室温检测，10分钟后观察试纸条的检测区和质控区的颜色变化。
从图4的检测结果可以看出，500nM的pb2+、Cu2+、Cd2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Sn2+、Zn2+、Al3+、Ca2+和Ag+对检测没有影响，试纸条的检测区没有出现红色区域；只有当加入汞离子后才会在试纸条的检测区出现红色区域。这证明该方法对汞离子的检测具有很好的特异性。
以上实施例表明，本发明的汞离子检测方法具有很高的灵敏度，对汞离子的检测限为10pM，检测结果直观，肉眼可见，检测过程方便、迅速，可用于汞离子的实地现场检测；此外，本发明的检测方法具有很好的特异性，常见的其他金属离子对检测不产生影响；构建得到的检测试纸条使用起来省时、省力，检测速度快且操作简单方便，检测结果直观，肉眼可见，不需要使用任何仪器。
以上实施例仪为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110> 广东省生态环境与土壤研究所
<120> 一种汞离子的超灵敏检测方法及检测试剂盒
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
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agtctaggat tcggcgtggg ttaagacaca cacgccgaat cctagactac ttttcg 56
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cgttaagtag tctaggattc ggcgtgaaaa aa 32
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<212> DNA
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<400> 5
ggttaagaca caaaaaaa 18
Claims (10)
1.一种汞离子的超灵敏检测方法，包括如下步骤
（1）构建茎环结构DNA：所述茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，凸出部分含有T碱基；
（2）构建辅助DNA：所述辅助DNA的5’端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的3’端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA，并形成含有3’平末端的部分互补的双链DNA；
（3）将待检样品与茎环结构DNA、辅助DNA混合后，静置反应；
（4）往步骤（3）的反应液中加入核酸外切酶III，在有汞离子存在的情况下，茎环结构DNA和辅助DNA通过T-Hg2+-T复合物互补，形成含有3’平末端的部分互补双链DNA，核酸外切酶III能与部分互补的双链DNA中的3’平末端结合，从而开始切割反应，释放单核苷酸以及汞离子，最后释放出单链DNA，所述单链DNA含有茎环结构DNA的环状区和5’端茎状区；
（5）通过检测步骤（4）释放出的单链DNA来判断待检样品中是否含有汞离子。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在汞离子存在的情况下，辅助DNA的5’段与茎环结构DNA的3’端的突出部分及部分茎状区互补，且辅助DNA的3’末端有至少4个碱基不能与茎环结构DNA互补形成平末端。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述茎环结构DNA中，环状区部分的碱基数为9～12，茎状区部分的碱基数为18～21个，茎状区的碱基数比环状区的碱基数多。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述茎环结构DNA的突出部分以及辅助DNA的5’端均含有1～5个T碱基。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（5）可采用电化学法、荧光法、比色法、电化学发光法或试纸条法检测释放出的单链DNA。
6.根据权利要求1或5所述的检测方法，其特征在于，步骤（5）采用试纸条法检测释放出的单链DNA，所述试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
所述金标垫上喷射有金标DNA探针1，所述金标DNA探针1与茎环结构DNA的环状区互补；
所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的5’端茎状区互补；
所述质检区上固定有DNA探针3，所述DNA探针3与DNA探针1互补。
7.一种汞离子的超灵敏检测试剂盒，其包括：
（1）茎环结构DNA：所述茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，凸出部分含有T碱基；
（2）辅助DNA：所述辅助DNA的5’端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的3’端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA，形成含有3’平末端的部分互补的双链DNA；
（3）核酸外切酶III；
（4）检测试纸条。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于所述检测试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
所述金标垫上喷射有金标DNA探针1，所述金标DNA探针1与茎环结构DNA的环状区互补；
所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的5’端茎状区互补；
所述质检区上固定有DNA探针3，所述DNA探针3与DNA探针1互补。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA探针2用链霉亲和素与生物素修饰。
10.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA探针3用链霉亲和素与生物素修饰。
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