CN103773855B - 一种汞离子的快速检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种汞离子的快速检测方法及检测试剂盒。本发明将DNA支点介导的链置换反应技术与试纸条检测技术相结合，建立一种用于快速可视化的汞离子检测方法和检测试剂盒。本发明的检测方法可在室温下完成整个反应过程，达到快速检测的目的，对汞离子的检测限为1nM，且具有很好的特异性，检测结果直观，肉眼可见，检测过程方便，可用于汞离子的实地现场检测。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，涉及一种DNA支点介导的链置换反应用于汞离子的快速检测。
背景技术
汞离子(Hg2+)是一种具有严重生理毒性的重金属离子，对人体危害严重，是环境监测的重要指标。由于其具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性，使其成为目前全球最引人关注的环境污染物之一。其主要毒性效应是导致贫血、神经机能失调和肾损伤、生殖系统损伤等。美国环境保护署规定饮用水中汞离子的最大允许量不得超过10nM。目前己报道的检测汞离子的方法主要有原子发射光谱、原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱法等。然而这些方法通常需要昂贵的仪器以及复杂的操作，严重制约了这些方法的广泛应用。因此，开发操作简便、选择性好、灵敏度高且成本低廉的汞离子检测方法具有非常重要的意义。汞离子能够与DNA中的胸腺嘧啶(thymine，T)特异性地结合，在DNA的T-T错配中可形成T-Hg2+-T复合物(Tanaka，Y.；Oda，S.；Yamaguchi，H.；Kondo，Y.；Kojima，CandOno，A.J.Am.Chem.Soc.，2007，129，244-245)。基于这一特点，有报道了荧光法、比色法、电化学方法以及电化学发光法用于汞离子的检测。但是这些方法都需要使用检测仪器来读取检测数据，难以用于实地现场快速检测。
发明内容
为了解决现有技术中所存在的不足，本发明旨在将DNA支点介导的链置换反应技术与试纸条检测技术相结合，建立一种用于快速可视化的汞离子检测方法和检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种汞离子的快速检测方法，包括如下步骤：
1)构建茎环结构DNA：所述茎环结构DNA的一端适当延伸，用作DNA支点，DNA支点中含有T碱基；
2)构建辅助DNA：所述辅助DNA的一端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构；
3)将待检样品和茎环结构DNA、辅助DNA混合后，静置反应，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构；
4)通过检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开来判断待检样品中是否含有汞离子。
作为优选的，所述茎环结构DNA中，DNA支点的碱基数为5～10个碱基。
作为优选的，所述DNA支点中含有1～5个T碱基。
作为优选的，所述茎环结构DNA中，环状区的碱基数为9～12，茎状区的碱基数为18～21个，茎状区的碱基数比环状区的碱基数多。
在汞离子存在的情况下，所述辅助DNA与茎环结构DNA的DNA支点以及DNA支点一侧的茎状区互补。
所述方法的步骤4)可采用荧光法、电化学方法、比色法、电化学发光法或试纸条法来检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开。
作为优选的，步骤4)采用试纸条法检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开，所述试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
所述金标垫上喷射有金标DNA探针1，所述金标DNA探针1与茎环结构DNA的环状区互补；
所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的茎状区互补；
所述质控区上固定有DNA探针3，所述DNA探针3与DNA探针1互补。
一种汞离子快速检测试剂盒，其包括：
1)茎环结构DNA：所述茎环结构DNA的一端适当延伸，用作DNA支点，DNA支点中含有T碱基；
2)辅助DNA：所述辅助DNA的一端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构，形成部分互补的双链DNA；
3)检测试纸条。
所述检测试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
所述金标垫上喷射有金标DNA探针1，所述金标DNA探针1与茎环结构DNA的环状区互补；
所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的茎状区互补；
所述质控区上固定有DNA探针3，所述DNA探针3与DNA探针1互补。
所述DNA探针2用链霉亲和素与生物素修饰；所述DNA探针3用链霉亲和素和生物素修饰。
下面举例介绍一下本发明方法的技术原理：
如图1所示，茎环结构DNA包含有4个功能区域，分别是1、2、3和2*区域，其中2和2*是互补的，构成茎环结构的茎状区；3为茎环结构的环状区；1区域可以作为DNA支点，用于启动DNA链置换反应。在1区域中含有1～5个T碱基。
辅助DNA包含有2个区域(1*和2*)，其中在区域1*中也含有1～5个T碱基。在有Hg2+存在时，茎环结构DNA的DNA支点的1区域通过形成T-Hg2+-T复合物与辅助DNA的1*区域结合，从而开始介导DNA链置换反应，打开茎环结构，使辅助DNA的2*区域和茎环结构DNA的2区域结合，形成更长的部分互补的双链DNA(1*和1互补，2*和2互补)。此时，茎环结构DNA被打开，形成部分双链DNA结构，而且茎环结构DNA的3区域和2*区域被暴露在外。可采用荧光法、电化学方法、比色法、电化学发光法或试纸条法来检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开，下面介绍其中的试纸条法。
如图2所示，检测试纸条包含4个部分：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，这四个部分从左到右依次固定于胶板上。DNA探针1(DNAprobe1)用巯基(-SH)修饰，固定在金纳米颗粒(AuNPs)上，形成的AuNPs-DNAprobe1复合物喷射在金标垫上。硝酸纤维素膜上划有两个检测区域：检测区和质控区，其中检测区固定的是链霉亲和素(SA)-生物素(biotin)-DNA探针2(SA-biotin-DNAprobe2)，质控区固定的是链霉亲和素(SA)-生物素(biotin)-DNA探针3(SA-biotin-DNAprobe3)。其中DNA探针1的3*区域与上述部分双链DNA的3区域是互补的：DNA探针2的2区域与上述部分双链DNA的2*区域是互补的；DNA探针3与DNA探针1互补。
将部分双链DNA滴于试纸条的样品垫上，通过毛细管迁移作用向前移动，经过金标垫时，部分双链DNA的3区域与DNAprobe1的3*区域杂交，形成复合物。该复合物继续往前移动，通过检测区时，部分双链DNA的2*区域会与固定在检测区的SA-biotin-DNAprobe2相互作用，从而抓住该复合物，使其在检测区聚集。聚集的金纳米颗粒形成肉眼可见的红色区域。过量的AuNPs-DNAprobe1复合物会与质控区上的DNA探针3杂交，在质控区聚集，从而质控区也呈红色。也就是说有汞离子存在时候，检测区和质控区都显示红色。当没有汞离子存在时，茎环结构DNA和辅助DNA不会相互作用，无法启动DNA支点介导的链置换反应，因而没有部分互补的双链DNA形成，茎环结构DNA的2*区域没有暴露出来，无法被检测区的DNA探针2捕获，从而检测区没有红色出现，而质控区始终显示红色，表明组装的试纸条可用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的检测方法具有较高的灵敏度，对汞离子的检测限为1nM，检测结果直观，肉眼可见，检测过程方便，可用于汞离子的实地现场检测；
(2)本发明所述的汞离子检测方法具有很好的特异性，常见的其他金属离子对检测不产生影响；
(3)本发明的检测方法，可在室温下完成整个反应过程，达到快速检测的目的；试纸条使用起来省时、省力，检测速度快且操作简单方便，不需要使用任何仪器，不需要专业的技术人员，无须培训即可推广使用。
附图说明
图1为DNA支点介导的链置换反应示意图；
图2为试纸条检测示意图；
图3为对不同浓度的汞离子检测的结果图；
图4为特异性实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
一种基于DNA支点介导的链置换反的汞离子快速检测试剂盒的构建
一、茎环结构DNA与辅助DNA的设计
茎环结构DNA的序列如SEQIDNO：1所示，其结构如下：
AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAAGACACACACGCCGAATCCTAGACT
2*32
ACTTTTCG
1
其中，其中2和2*是互补的，构成茎环结构的茎状区；3为茎环结构的环状区；1区域可以作为DNA支点，用于启动DNA链置换反应。
辅助DNA的序列如SEQIDNO：2所示，结构如下：
CGTTAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG
1*2*
辅助DNA的1*区域通过形成T-Hg2+-T复合物与茎环结构DNA的DNA支点1区域结合，从而开始介导DNA链置换反应，打开茎环结构，使辅助DNA的2*区域和茎环结构DNA的2区域结合，形成更长的部分互补的双链DNA。
二、试纸条的设计及组装
下面试纸条所用到的DNA探针的序列如表1所示。
表1
其中，DNA探针1的3*区域与茎环结构DNA的3区域互补，DNA探针2的2区域与茎环结构DNA的2*区域互补，DNA探针3与DNA探针1互补。
试纸条的组装步骤如下：
(1)金纳米颗粒(胶体金，AuNPs)的制备：在500mL的圆底烧瓶中加入250mL0.01％的HAuCl4溶液，磁力搅拌加热至沸腾，然后向上述溶液中快速加入10mL1％的柠檬酸三钠溶液，溶液20秒内变为蓝色，60秒后变为酒红色，继续煮沸10分钟，停止加热，继续搅拌直至冷却。胶体金溶液4℃避光保存备用。
(2)金标核酸的制备：用100L超纯水溶解1OD巯基修饰的DNAprobe1，加入到10倍浓缩的胶体金溶液中，4℃反应过夜。然后加入10％的BSA封闭1小时，再加入NaCl和SDS，使其终浓度分别为150mM和0.01％，4℃反应过夜。然后12000转/分钟离心20分钟，弃去上清，沉淀用1mL的重悬液(20mMNa3PO4，5％BSA，0.25％Tween和10％的蔗糖)重悬，重复洗三次后用1mL的重悬液制成悬浮液备用。
(3)样品垫的处理：将玻璃纤维浸泡在0.25％TritonX-100，0.05MTris-Ac，0.15MNaCl溶液中4个小时后，37℃烘干备用。
(4)金标垫的制备：将本发明制备的金标核酸探针1(AuNPs-DNAprobe1)喷射在玻璃纤维上，37℃干燥2小时，制成金标垫，备用。
(5)硝酸纤维素膜上检测区和质控区的制备：将15μL浓度为1.2mg/ml的链霉亲和素与15μL浓度为100μM的生物素(biotin)修饰的DNA探针2混合，室温反应1h后，用划膜喷金仪喷射于硝酸纤维素膜上检测区，37℃干燥1h即制得检测区。将15μL浓度为1.2mg/ml的链霉亲和素与15μL浓度为100μM的生物素(biotin)修饰的DNA探针3混合，室温反应1h后，用划膜喷金仪喷射于硝酸纤维素膜上质控区，37℃干燥1小时即制得质控区。
(6)试纸条的组装：将样品垫、含有胶体金标记的DNA探针1的金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸依次固定在胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后既得到本发明所述的检测试纸条。
实施例2
利用实施例1构建的试剂盒检测样品，步骤如下：
(1)先用Tris-C1缓冲液(20mM，含有150mM的NaCl，pH7.4)分别溶解茎环结构DNA和辅助DNA。
(2)把500nM的茎环结构DNA和500nM的辅助DNA混合，再加入待检样品，混匀，室温放置40分钟，即可用于下一步的试纸条分析。在这一步中，如果待检样品中含有汞离子，则辅助DNA的1*区域将通过形成T-Hg2+-T复合物与茎环结构DNA的DNA支点1区域结合，从而开始介导DNA链置换反应，打开茎环结构DNA的茎环结构，从而暴露茎环结构DNA茎环结构的3区域和2*区域。
(3)将步骤(2)的反应液滴加到试纸条的样品垫上，进行检测。反应液通过毛细管迁移作用向前移动，经过金标垫时，茎环结构DNA的3区域与DNA探针1的3*区域杂交，形成复合物。该复合物继续往前移动，通过检测区时，茎环结构DNA的2*区域会与固定在检测区的SA-biotin-DNAprobe2相互作用，从而抓住该复合物，使其在检测区聚集，聚集的金纳米颗粒形成肉眼可见的红色区域。过量的AuNPs-DNAprobe1复合物会与质控区上的DNA探针3杂交，在质控区聚集，从而质控区也呈红色。也就是说有汞离子存在时候，检测区和质控区都显示红色。当没有汞离子存在时，茎环结构DNA和辅助DNA不会相互作用，无法启动DNA支点介导的链置换反应，茎环结构DNA的2*区域没有暴露出来，无法被检测区的DNA探针2捕获，从而检测区没有红色出现，而质控区始终显示红色，表明组装的试纸条可用。
实施例3
对不同浓度的汞离子的检测：
配制汞离子标准溶液，浓度分别为1nM，10nM，100nM，1μM和5μM，室温保存。
将不同浓度的汞离子溶液分别加到实施例2所述的反应体系中，充分反应后，将反应液(80μL)滴加到试纸条的样品垫上，室温检测，10分钟后观察试纸条的检测区和质控区的颜色变化。
从图3的检测结果可以看出，1nM汞离子存在时，可在试纸条的检测区观察到明显的红色区域，其检测限为1nM，低于美国环境保护署规定饮用水中汞离子的最大允许量10nM。并且，随着汞离子浓度的增加(从1nM到1μM)，检测区的颜色也逐渐增加。当汞离子浓度超过5μM时，颜色变化趋于饱和。同时，质控区在各种情况下都呈红色，说明试纸条体系运行正常，结果可信。
实施例4
对不同离子的检测：
配制1μM不同离子的标准溶液，它们分别是pb2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Ag+、Ni2+和Cd2+。
将1μM不同的离子标准溶液和100nM汞离子标准溶液分别加到实施例2中所述的反应体系中，充分反应后，将反应液(80μL)滴加到试纸条的样品垫上，室温检测，10分钟后观察试纸条的检测区和质控区的颜色变化。
从图4的检测结果可以看出，1μM的pb2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Ag+、Ni2+和Cd2+对检测没有影响，试纸条的检测区没有出现红色区域；只有当加入汞离子后才会在试纸条的检测区出现红色区域。这证明该方法对汞离子的检测具有很好的特异性。
以上实施例表明，本发明的汞离子检测方法具有较高的灵敏度，对汞离子的检测限为1nM。此外，本发明的检测方法具有很好的特异性，常见的其他金属离子对检测不产生影响。构建得到的检测试纸条使用起来省时、省力，检测速度快且操作简单方便，检测结果直观，肉眼可见，不需要使用任何仪器。
以上实施例仪为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110>广东省生态环境与土壤研究所
<120>一种汞离子的快速检测方法及检测试剂盒
<130>
<160>5
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
agtctaggattcggcgtgggttaagacacacacgccgaatcctagactacttttcg56
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<212>DNA
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Claims (9)
1.一种汞离子的快速检测方法，包括如下步骤：
1）构建茎环结构DNA：所述茎环结构DNA的一端适当延伸，用作DNA支点，DNA支点中含有T碱基；
2）构建辅助DNA：所述辅助DNA的一端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构；
3）将待检样品和茎环结构DNA、辅助DNA混合后，静置反应，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构；
4）通过检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开来判断待检样品中是否含有汞离子；
在汞离子存在的情况下，所述辅助DNA与茎环结构DNA的DNA支点以及DNA支点一侧的茎状区互补。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述茎环结构DNA中，DNA支点的碱基数为5～10个碱基。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述DNA支点中含有1～5个T碱基。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述茎环结构DNA中，环状区的碱基数为9～12，茎状区的碱基数为18～21个，茎状区的碱基数比环状区的碱基数多。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤4）采用荧光法、电化学方法、比色法、电化学发光法或试纸条法来检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开。
6.根据权利要求1或5所述的检测方法，其特征在于，步骤4）采用试纸条法检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开，所述试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
所述金标垫上喷射有金标DNA探针1，所述金标DNA探针1与茎环结构DNA的环状区互补；
所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的茎状区互补；
所述质控区上固定有DNA探针3，所述DNA探针3与DNA探针1互补。
7.一种汞离子快速检测试剂盒，其包括：
1）茎环结构DNA：所述茎环结构DNA的一端适当延伸，用作DNA支点，DNA支点中含有T碱基；
2）辅助DNA：所述辅助DNA的一端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构，形成部分互补的双链DNA；
3）检测试纸条；
在汞离子存在的情况下，所述辅助DNA与茎环结构DNA的DNA支点以及DNA支点一侧的茎状区互补。
8.根据权利要求7所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述检测试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
所述金标垫上喷射有金标DNA探针1，所述金标DNA探针1与茎环结构DNA的环状区互补；
所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的茎状区互补；
所述质控区上固定有DNA探针3，所述DNA探针3与DNA探针1互补。
9.根据权利要求8所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述DNA探针2用链霉亲和素与生物素修饰；所述DNA探针3用链霉亲和素和生物素修饰。
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| Yuqing He et al.visual detection of Hg2+ in aqueous solution using gold nanoparticles and thymine-rich hairpin DNA probes.《Biosens Bioelectron.》.2012,摘要、第2-3页跨页段、第3-4页2.2-2.5、第5页3.1、图1. * |
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