CN107727623B - 一种汞离子荧光检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种汞离子荧光检测试剂盒，以含有T‑T错配碱基的核酸为识别元件，构建了一种无需抗体及酶的汞离子检测新技术，检测过程无需洗涤分离，直接混合即可检测，具有操作简单、成本低廉等优点。茎环结构核酸与汞离子结合后进一步启动后续的DNA支点介导的链置换反应，从而置换修饰了淬灭基团的核酸，使荧光基团标记的核酸发荧光，从而达到检测目的。该体系对汞离子的检测限为0.1nM，能满足实际样品检测需求，常见的其他离子对检测不产生影响，具有较好的特异性。

Description

一种汞离子荧光检测试剂盒
技术领域
本发明环境污染物检测领域，具体涉及一种重金属离子的检测试剂盒，特别涉及一种汞离子荧光检测试剂盒。
背景技术
汞离子(Hg2+)是一种分布广泛的剧毒污染物，具有很强的致癌性，即使在极低浓度下也会对环境与公众健康造成极大危害。其中来源于污染废水、电子工业、塑料产业、混汞炼金等行业排放的汞污染危害最为严重。汞对人体的危害主要累及中枢神经系统、消化系统及肾脏，对呼吸系统、皮肤、血液及眼睛也有一定影响。因此，对土壤、空气、水体等环境以及食物中的汞进行日常监测具有重要意义。美国环境保护署EPA规定，饮用水中的Hg2+最高浓度不得超过10nM。因此，迫切需要建立Hg2+高灵敏快速检测手段，实现对Hg2+的常规检测。
传统的Hg2+检测技术依赖大型仪器，包括原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法等。然而这些技术通常需要复杂的操作与样品前处理过程以及昂贵的仪器，严重制约了这些检测方法的应用。已报道的Hg2+检测技术及试剂盒大多涉及抗体以及酶的使用，需要多次洗涤分离过程，程序繁琐，费时耗力，因此迫切需要建立一种无需抗体和酶的检测技术及检测试剂盒，并避免洗涤分离过程具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便，检测灵敏度高的汞离子荧光检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种汞离子荧光检测试剂盒，包括反应缓冲液，其特征在于：还包括茎环结构核酸H1，DNA1和DNA2，其中：
H1由a、c、d、e、d*、f和b区构成，其中，d和d*互补形成H1的茎区；e为环区；c和f具有T-T碱基错配，在存在Hg2+的情况下可通过形成T-Hg2+-T配对而互补配对；a和b区不互补配对；
DNA1和DNA2中的一条具有荧光基团，另一条具有对应的淬灭基团，两者部分互补配对并且配对时无荧光产生；
DNA2由a*和b*区构成，a*和b*分别和H1的a和b区互补配对。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，DAN1的长度短于DNA2。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，a区核酸序列的长度为4～8个核酸。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，b区核酸序列的长度为9～18个核酸。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，c区核酸序列的长度为6～12个核酸。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，d区核酸序列的长度为6～9个核酸。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，e区核酸序列的长度为10～18个核酸。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，c和f错配的T-T碱基对为2～4对。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，核酸H1、DNA1、DNA2的序列如下：
H1：5'-ATGCAC-GCTATCGTC-CGACTCG-ACCTCCGATCGCGTA-CGAGTCG-GTCGTTTGC-ACGGTACCTCAG-3'(SEQ ID NO：1)
DNA1：5'-ACGGTACCTCAG-荧光基团-3'(SEQ ID NO：2)
DNA2：5'-淬灭基团-CTGAGGTACCGT-GTGCAT-3'(SEQ ID NO：3)。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，反应缓冲液包含20mMTris-AC，pH为7.4，含有50mMNaAC，15mM MgAC2。
本发明的有益效果是：
本发明的试剂盒，无需任何酶及抗体的参与，无需精确温度控制，可在室温完成反应，适合现场快速检测。本发明的试剂盒，具有很好的灵敏度和特异性，检测限达0.1nM，可以很好地排除其他金属离子对检测结果的影响，有效降低了样品的处理难度。
本发明试剂盒操作简单，只需简单混合即可检测，无需分离与纯化过程，大大降低了成本，便于广泛推广。
附图说明
图1是本发明方法的检测原理图；
图2是不同浓度汞离子检测结果图；
图3是特异性实验结果。
具体实施方式
一种汞离子荧光检测试剂盒，包括反应缓冲液，其特征在于：还包括茎环结构核酸H1，DNA1和DNA2，其中：
H1由a、c、d、e、d*、f和b区构成，其中，d和d*互补形成H1的茎区；e为环区；c和f具有T-T碱基错配，在存在Hg2+的情况下可通过形成T-Hg2+-T配对而互补配对；a和b区不互补配对；
DNA1和DNA2中的一条具有荧光基团，另一条具有对应的淬灭基团，两者部分互补配对并且配对时无荧光产生；
DNA2由a*和b*区构成，a*和b*分别和H1的a和b区互补配对。
荧光基团包括但不限于FAM、Cy3、Cy5、JOE等；淬灭基团包括但不限于BHQ、TAMRA、Eclipse等。形成的DNA1-DNA2复合物中，由于荧光基团跟淬灭基团相互靠近，使得荧光基团在激发光的激发下荧光被淬灭基团淬灭，因而只有很低的背景值。同时因为DNA1和DNA2部分互补配对，具有部分未配对的核酸序列，可以作为后续DNA链置换反应的支点。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，DAN1的长度短于DNA2。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，a区核酸序列的长度为4～8个核酸，优选6个核酸。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，b区核酸序列的长度为9～18个核酸，优选12个核酸。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，c区核酸序列的长度为6～12个核酸，优选15个核酸。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，d区核酸序列的长度为6～9个核酸，优选15个核酸。
e区是H1折环部，只要可以形成稳定的环区即可，作为上述检测试剂盒的进一步改进，e区核酸序列的长度为10～18个核酸，优选15个核酸。
为避免c和f在外来因素的影响下错误配对，保证只有汞离子存在的情况下才配对，作为上述检测试剂盒的进一步改进，c和f错配的T-T碱基对为2～4对，优选3对。
作为上述检测试剂盒的进一步改进，核酸H1、DNA1、DNA2的序列如下：
H1：5'-ATGCAC-GCTATCGTC-CGACTCG-ACCTCCGATCGCGTA-CGAGTCG-GTCGTTTGC-ACGGTACCTCAG-3'
DNA1：5'-ACGGTACCTCAG-荧光基团-3'
DNA2：5'-淬灭基团-CTGAGGTACCGT-GTGCAT-3'。
检测试剂盒对反应缓冲液没有特殊要求，一般而言，只要能保持反应pH的稳定，且不与待测离子发生反应即可。作为上述检测试剂盒的进一步改进，反应缓冲液包含20mMTris-AC，pH为7.4，含有50mMNaAC，15mM MgAC2。
参见图1，本试剂盒的检测原理如下：
1)茎环结构核酸H1中的c部分与f部分有T-T碱基错配，在没有汞离子的时候，c部分和f部分不能互补；当有汞离子的时候，通过形成T-Hg2+-T配对，从而使c部分与f部分互补配对；
2)c与f配对后，拉近a和b部分的距离，使二者靠近；
3)DNA1的b部分与DNA2的b*部分互补，DNA1的一端修饰荧光基团FAM，DNA2的一端修饰淬灭基团BHQ；形成的DNA1-DNA2复合物中，由于荧光基团跟淬灭基团相互靠近，使得荧光基团在激发光的激发下荧光被淬灭基团淬灭，因而只有很低的背景值。同时DNA2的a*部分是凸起的，可以作为后续DNA链置换反应的支点；
4)在H1与汞离子充分反应后，加入DNA1-DNA2复合物。由于H1中的a与b相互靠近，以DNA2的a*为支点，H1的a与DNA2的a*互补，启动DNA支点介导的链置换反应，进一步使H1的b与DNA2的b*互补，从而把DNA1从DNA2中置换下来；
5)被置换下来的DNA1远离DNA2，荧光基团与淬灭基团分开；在激发光的激发下，体系呈现出较高的荧光，荧光强度与汞离子浓度呈正相关，从而达到检测汞离子的目的。
实施例1
一种汞离子检测试剂盒，包括以下成分：
(1)核酸H1、DNA1、DNA2的序列如下：
H1：5'-ATGCAC(a区)-GCTATCGTC(c区)-CGACTCG(d区)-ACCTCCGATCGCGTA(e区)-CGAGTCG(d*区)-GTCGTTTGC(f区)-ACGGTACCTCAG(b区)-3'
DNA1:5'-ACGGTACCTCAG(b区)-FAM-3'
DNA2:5'-BHQ-CTGAGGTACCGT(b*区)-GTGCAT(a*区)-3'
(2)汞离子标准溶液；
(3)反应缓冲液，包含20mMTris-AC，pH为7.4，含有50mMNaAC，15mM MgAC2。
不同浓度汞离子的检测实验：
配制汞离子标准溶液，浓度分别为0.1nM、1nM、10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、200nM，4℃保存。将不同浓度的汞离子溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度。
如图2所示，随着汞离子浓度的增加，对应的荧光强度逐渐增加，当汞离子浓度超过100nM时，体系逐渐达到饱和，荧光强度趋于平稳。
以汞离子浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，二者具有很好的线性关系，线性范围是从1nM到100nM，线性方程：F＝66.17+3.82C(R＝0.97)(F为荧光强度，C为汞离子浓度)，最低检测限为0.1nM。
特异性实验：
配制浓度为20nM的不同干扰离子标准溶液，分别是Cu2+、Pb2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Cd2+和Zn2+。
将20nM的不同干扰物标准溶液和20nM Hg2+标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图3所示，20nM的Cu2+、Pb2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Cd2+和Zn2+的荧光强度与空白样品相比，变化不大，对检测不产生影响。只有当加入Hg2+才会使荧光强度明显增加，这证明该方法对Hg2+的检测具有很好的特异性，其他干扰离子对检测不产生影响。
序列表
<110> 广东省生态环境技术研究所
<120> 一种汞离子荧光检测试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgcacgcta tcgtccgact cgacctccga tcgcgtacga gtcggtcgtt tgcacggtac 60
ctcag 65
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acggtacctc ag 12
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgaggtacc gtgtgcat 18

Claims (10)

1.一种汞离子荧光检测试剂盒，包括反应缓冲液，其特征在于：还包括茎环结构核酸H1，DNA1和DNA2，其中：
H1由a、c、d、e、d*、f和b区构成，其中，d和d*互补形成H1的茎区；e为环区；c和f具有T-T碱基错配，在存在Hg2+的情况下可通过形成T-Hg2+-T配对而互补配对；a和b区不互补配对；
DNA1和DNA2中的一条具有荧光基团，另一条具有对应的淬灭基团，两者部分互补配对并且配对时无荧光产生；
DNA2由a*和b*区构成，a*和b*分别和H1的a和b区互补配对。
2.根据权利要求1所述的汞离子荧光检测试剂盒，其特征在于：DAN1的长度短于DNA2。
3.根据权利要求1所述的汞离子荧光检测试剂盒，其特征在于：d区核酸序列的长度为6～9个核酸。
4.根据权利要求1所述的汞离子荧光检测试剂盒，其特征在于：c区核酸序列的长度为6～12个核酸。
5.根据权利要求1所述的汞离子荧光检测试剂盒，其特征在于：c和f错配的T-T碱基对为2～4对。
6.根据权利要求1所述的汞离子荧光检测试剂盒，其特征在于：a区核酸序列的长度为4～8个核酸。
7.根据权利要求1所述的汞离子荧光检测试剂盒，其特征在于：b区核酸序列的长度为9～18个核酸。
8.根据权利要求1所述的汞离子荧光检测试剂盒，其特征在于：e区核酸序列的长度为10～18个核酸。
9.根据权利要求1所述的汞离子荧光检测试剂盒，其特征在于：核酸H1、DNA1、DNA2的序列如下：
H1：
5'-ATGCAC-GCTATCGTC-CGACTCG-ACCTCCGATCGCGTA-CGAGTCG-GTCGTTTGC-ACGGTACCTCAG-3'
DNA1：5'-ACGGTACCTCAG-荧光基团-3'
DNA2：5'-淬灭基团-CTGAGGTACCGT-GTGCAT-3'。
10.根据权利要求1～9任一项所述的汞离子荧光检测试剂盒，其特征在于：反应缓冲液包含20 mMTris-AC，pH为7.4，含有50 mMNaAC，15mM MgAC2。
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