CN112285078B - 一种基于智能dna水凝胶的汞离子现场检测新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及汞离子检测技术领域。本发明提供了一种基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法，包括以下步骤：(1)制备半干式智能生物传感平台：包括具有微孔结构的DNA水凝胶、DNA探针和负载图像分析软件的电子设备；(2)汞离子检测：汞离子样品溶液注入DNA水凝胶的微孔中，并置于紫外光下以获得荧光信号，利用电子设备拍摄图像，并通过电子设备上的图像分析软件获得样品相应的荧光强度，建立荧光强度与样品浓度的定量关系，从而实现对汞离子的定量分析。本发明设计的DNA水凝胶，以一种便携式且易于操作的方式定量检测汞离子，并可以进行现场测试，本方法操作简单、检测时间短、检测灵敏度高、成本低廉、无需大型仪器。

Description

一种基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法
技术领域
本发明涉及汞离子检测技术领域，尤其涉及一种基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法。
背景技术
汞是一种高度有害的环境污染物，即使浓度很低也构成严重的生态和健康风险，使其成为全球关注的问题。其中有机汞物质被认为是最具毒性的化合物。有机汞物质很容易被水中的水生微生物从无机汞物质转化而来。尤其是，最常见的有机汞物种甲基汞比无机汞离子具有更大的毒性，因为甲基汞可以很容易地穿透包括血脑屏障的生物膜并在脑和神经系统中蓄积。因此开发一种快捷方便且灵敏的汞离子检测方法，对医学、生物学、和环境科学意义重大。
目前汞的检测方法很多，包括紫外可见分光光度法，冷蒸气原子荧光光谱法，原子吸收/发射光谱法，高效液相色谱法，电感耦合等离子体质谱法，离子色谱法，原子荧光光谱法和传感技术。但这些方法需要昂贵仪器，且有专业人员进行操作，不适用于实验条件匮乏的地区或者现场检测。所以开发一种便携式，无需大型仪器，操作简单的新方法用于汞离子的现场检测十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法，能够快捷方便且灵敏的汞离子检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法，包括以下步骤：
(1)制备半干式智能生物传感平台：包括具有微孔结构的DNA水凝胶、具有发卡结构的DNA探针和负载图像分析软件的电子设备；
(2)汞离子检测：汞离子样品溶液注入DNA水凝胶的微孔中，并置于紫外光下以获得荧光信号，利用电子设备拍摄图像，并通过电子设备上的图像分析软件获得样品相应的荧光强度，建立荧光强度与样品浓度的定量关系，从而实现对汞离子的定量分析。
作为优选，所述具有微孔结构的DNA水凝胶包括琼脂糖溶液和具有发卡结构的DNA探针。
作为优选，所述具有发卡结构的DNA探针用于响应汞离子。
作为优选，还包括步骤(3)检测汞离子线性实验，具体步骤如下：
(3.1)配置0.25nM，0.5nM，1nM，2.5nM，5nM，0.1μM，0.25μM，0.5μM，1μM，2.5μM浓度的汞离子标准溶液，将上述浓度的汞离子标准溶液注入DNA水凝胶的微孔中，反应60～120分钟；
(3.2)将包含汞离子的水凝胶置于紫外光下以获得荧光信号，通过电子设备记录DNA水凝胶的荧光图像。
作为优选，所述DNA水凝胶的荧光图像通过图像分析软件ImageJ进行分析。
本发明还提供了一种具有微孔结构的DNA水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将琼脂糖粉末溶于pH为7.4～7.6，45～55mMTris-HCl缓冲溶液中，缓冲溶液中包含0.4～0.6MNaCl，得到1～2％w/v琼脂糖溶液，加热至成琼脂糖溶液后，将其冷却至45～55℃；
(2)将琼脂糖溶液和终浓度为1～2μM的具有发卡结构的DNA探针混合，加热以形成水溶胶，冷却后即为具有微孔结构的DNA水凝胶。
本发明还提供了一种具有微孔结构的DNA水凝胶。
本发明还提供了一种具有发卡结构的DNA探针，所述DNA探针序列为：TTG GTT TGTTTT CTT TCG TAT GCT TTG T-BHQ1-TT TCT TTC CTT AGT GTA ATC AAG GAA AGA AA-FAM。
本发明提供了一种基于DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法，包括以下步骤：(1)制备半干式智能生物传感平台：包括具有微孔结构的水凝胶、DNA探针和负载图像分析软件的电子设备；(2)汞离子检测：汞离子样品溶液注入DNA水凝胶的微孔中，并置于紫外光下以获得荧光信号，利用电子设备拍摄图像，并通过电子设备上的图像分析软件获得样品相应的荧光强度，建立荧光强度与样品浓度的定量关系，从而实现对汞离子的定量分析。本发明设计的DNA水凝胶，以一种便携式且易于操作的方式定量检测汞离子，并可以进行现场测试，本方法操作简单、检测时间短、检测灵敏度高、成本低廉、无需大型仪器。
附图说明
图1为基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测的原理图；
图2为电子设备对含有待测汞离子样品的智能DNA水凝胶进行图像分析的原理图；
图3为智能DNA水凝胶对汞离子进行现场检测的结果图；
图4为DNA水凝胶的检测稳定性检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法，包括以下步骤：
(1)制备半干式智能生物传感平台：包括具有微孔结构的DNA水凝胶、具有发卡结构的DNA探针和负载图像分析软件的电子设备；
(2)汞离子检测：汞离子样品溶液注入DNA水凝胶的微孔中，并置于紫外光下以获得荧光信号，利用电子设备拍摄图像，并通过电子设备上的图像分析软件获得样品相应的荧光强度，建立荧光强度与样品浓度的定量关系，从而实现对汞离子的定量分析。
在本发明中，所述具有微孔结构的DNA水凝胶优选包括琼脂糖溶液和具有发卡结构的DNA探针。
在本发明中，所述具有发卡结构的DNA探针优选用于响应汞离子。
在本发明中，还包括步骤(3)检测汞离子线性实验，具体步骤如下：
(3.1)配置0.25nM，0.5nM，1nM，2.5nM，5nM，0.1μM，0.25μM，0.5μM，1μM，2.5μM浓度的汞离子标准溶液，将上述浓度的汞离子标准溶液注入DNA水凝胶的微孔中，反应60～120分钟；
(3.2)将包含汞离子的水凝胶置于紫外光下以获得荧光信号，通过电子设备记录DNA水凝胶的荧光图像。
在本发明中，所述反应时间优选为90分钟。
在本发明中，所述DNA水凝胶的荧光图像优选通过图像分析软件ImageJ进行分析。
本发明还提供了一种具有微孔结构的DNA水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将琼脂糖粉末溶于pH为7.4～7.6，45～55mMTris-HCl缓冲溶液中，缓冲溶液中包含0.4～0.6MNaCl，得到1～2％w/v琼脂糖溶液，加热至成琼脂糖溶液后，将其冷却至45～55℃；
(2)将琼脂糖溶液和终浓度为1～2μM的具有发卡结构的DNA探针混合，加热以形成水溶胶，冷却后即为具有微孔结构的DNA水凝胶。
在本发明中，所述琼脂糖溶液和探针混合后加热的温度优选为60～70℃，进一步优选为65℃。
在本发明中，所述琼脂糖溶液和探针混合后加热的时间优选为1～8分钟，进一步优选为4分钟。
在本发明中，所述汞离子样品溶液优选为HgCl2溶液。
在本发明中，所述DNA水凝胶冷却前优选将模具插入到水溶胶中，在冷却并除去模具后，制备具有微孔结构的DNA水凝胶。
在本发明中，所述Tris-HCl缓冲液的pH优选为7.5。
在本发明中，所述NaCl的浓度优选为0.5M。
在本发明中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为50mM。
在本发明中，加入具有发卡结构的DNA探针时琼脂糖溶液温度优选为50℃。
在本发明中，所述琼脂糖溶液中琼脂糖的浓度优选为1.6％w/v。
在本发明中，所述器皿优选为直径为5.6cm的圆形玻璃皿。
在本发明中，所述模具优选为96孔PCR板。
在本发明中，所述电子设备优选为平板电脑。
本发明还提供了一种具有微孔结构的DNA水凝胶。
在本发明中，所述具有微孔结构的DNA水凝胶优选用于制备半干式智能生物传感平台。
本发明还提供了一种具有发卡结构的DNA探针，所述DNA探针序列为：TTG GTT TGTTTT CTT TCG TAT GCT TTG T-BHQ1-TT TCT TTC CTT AGT GTA ATC AAG GAA AGA AA-FAM。
在本发明中，加入待测样品汞离子的DNA水凝胶，可以用平板电脑(microsoftsurface3)采集荧光图像，并用平板电脑中负载的ImageJ软件进行荧光强度计算。所述ImageJ程序分析优选为在打开ImageJ软件后，选择8位作为图像类型，然后单击过程-减去-背景；然后，单击“椭圆选择”；接下来，使用椭圆工具选择包含整个荧光信号的直径为0.06英寸的固定圆形区域(外环，Y)；然后，选择直径为0.02英寸的固定圆形区域作为内环(X)；然后，单击“分析测量”以计算积分密度；最后，将Y的积分密度(FY)减去X的积分密度(FX)作为检测的荧光强度信号。
在本发明中，通过手动分析，在平板电脑采集的图像中，都获得了10nM～2.5μM范围内的汞离子浓度与荧光强度之间的良好线性关系据此可以实现10nM～2.5μM范围内的定量测量。
在本发明中，具有发夹结构的DNA探针用于响应汞离子。该探针的发卡链末端标记了荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，因为荧光基团和猝灭基团靠近而导致荧光猝灭。在DNA探针的5’末端有一个富含T的区域，该区域在Hg2+的介导下可以结合探针另一段富含T的寡核苷酸，形成T-Hg2+-T结构。一旦形成了T-Hg2+-T，就会启动DNA探针的重新配置，从而导致荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1分离并随后恢复荧光。此处的DNA探针掺入了DNA水凝胶中，在紫外线下可以观察到绿色荧光信号。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)将琼脂糖粉末溶于pH为7.4，40mMTris-HCl缓冲溶液中，缓冲溶液中包含0.4MNaCl，加热后得到1.0％w/v琼脂糖溶液。将琼脂糖溶液缓慢冷却至45℃。
(2)将琼脂糖溶液和终浓度为1μM的具有发卡结构的DNA探针混合。70℃加热1分钟以形成水溶胶，倒入直径为5.6cm的圆形玻璃皿中。
(3)将96孔PCR板插入到水溶胶中，在室温下冷却并除去模具后，制备具有均匀微孔的汞离子检测水凝胶。
(4)将待测样品注入汞离子检测水凝胶中，反应60分钟；
(5)将反应后的汞离子检测水凝胶置于紫外光下，通过凝胶成像系统记录汞离子检测水凝胶的荧光图像，荧光强度越强汞离子含量越高。
实施例2
(1)将琼脂糖粉末溶于pH为7.5，50mMTris-HCl缓冲溶液中，缓冲溶液中包含0.5MNaCl，加热后得到1.6％w/v琼脂糖溶液。将琼脂糖溶液缓慢冷却至50℃。
(2)将琼脂糖溶液和终浓度为1μM的具有发卡结构的DNA探针混合。65℃加热4分钟以形成水溶胶，倒入直径为5.6cm的圆形玻璃皿中。
(3)将96孔PCR板插入到水溶胶中，在室温下冷却并除去模具后，制备具有均匀微孔的汞离子检测水凝胶。
(4)将待测样品注入汞离子检测水凝胶中，反应90分钟。
(5)将反应后的汞离子检测水凝胶置于紫外光下，通过凝胶成像系统记录汞离子检测水凝胶的荧光图像，荧光强度越强汞离子含量越高。
实施例3
(1)将琼脂糖粉末溶于pH为7.6，60mMTris-HCl缓冲溶液中，缓冲溶液中包含0.6MNaCl，加热后得到2.0％w/v琼脂糖溶液。将琼脂糖溶液缓慢冷却至55℃。
(2)将琼脂糖溶液和终浓度为2μM的具有发卡结构的DNA探针混合。60℃加热8分钟以形成水溶胶，倒入直径为5.6cm的圆形玻璃皿中。
(3)将96孔PCR板插入到水溶胶中，在室温下冷却并除去模具后，制备具有均匀微孔的汞离子检测水凝胶。
(4)将待测样品注入汞离子检测水凝胶中，反应120分钟。
(5)将反应后的汞离子检测水凝胶置于紫外光下，通过凝胶成像系统记录汞离子检测水凝胶的荧光图像，荧光强度越强汞离子含量越高。
实施例4
一种基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法对汞离子的检测应用，具体步骤如下：
(1)检测汞离子线性实验：配置0.25nM，0.5nM，1nM，2.5nM，5nM，0.1μM，0.25μM，0.5μM，1μM，2.5μM浓度的HgCl2，将上述浓度的HgCl2溶液注入DNA水凝胶的微孔中，室温反应90分钟，每个微孔的Hg2+(μM)浓度如图3A所示。
(2)将包含样品的水凝胶置于紫外光下以获得荧光信号。通过平板电脑记录DNA水凝胶的荧光图像，如图3B所示。
DNA水凝胶的图像可以通过常见的图像分析软件ImageJ进行分析。详细地说，在打开ImageJ软件后，选择8位作为图像类型，然后单击过程-减去-背景。然后，单击“椭圆选择”。接下来，使用椭圆工具选择包含整个荧光信号的直径为0.06英寸的固定圆形区域(外环，Y)。然后，选择直径为0.02英寸的固定圆形区域作为内环(X)。然后，单击“分析测量”以计算积分密度。最后，将Y的积分密度(FY)减去X的积分密度(FX)作为检测的荧光强度信号。
用于水中Hg2+检测的DNA水凝胶板，通过平板电脑记录图像，每个微孔检测到的Hg2 +浓度(μM)如图3C所示。
实施例5
通过手动分析，在平板电脑采集的图像中，都获得了10nM～2.5μM范围内的汞离子浓度与荧光强度之间的良好线性关系据此可以实现10nM～2.5μM范围内的定量测量，荧光强度与Hg2+浓度之间的线性关系如图3D所示。在加标准样品的检测中，Hg2+检测中标准方法与本方法的一致性分析，如图3E所示。
实施例6
采集健康人自愿提供的人血浆样本并从中提取DNA。为了检测人血浆样品中的汞离子，首先按1：10的比例稀释人血浆样品单独分析，然后再分别加入0.015μM、0.1μM和2μM汞离子进行检测，加标血清中Hg2+的检测如图3F所示。
实施例7
DNA水凝胶的稳定性鉴定：
(1)通过将核酸外切酶I分别加入在溶液系统和水凝胶系统中进行Hg2+检测，结果显示，溶液系统的信号强度明显降低，而加入核酸外切酶I溶液的水凝胶系统，1天后进行Hg2+检测也几乎不会影响检测。50U/mL核酸外切酶I在溶液中反应15分钟，在水凝胶中反应1天。其中溶液系统在核酸外切酶I水解下的抗降解能力如图4A所示，DNA水凝胶系统在核酸外切酶I水解下的抗降解能力如图4B所示。
(2)通过将DNA水凝胶保存30天后进行检测，进一步研究了DNA水凝胶的检测稳定性。与新鲜制备的DNA水凝胶相比，长期保存后从DNA水凝胶获得的信号强度保持92％，通过凝胶成像系统获得DNA水凝胶的摄影图像，并通过ImageJ获得微孔的荧光强度，如图4C，4D所示。表明随时间推移具有良好的稳定性，在储存期间DNA水凝胶的催化稳定性。
由以上实施例可知，本发明提供了一种基于DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法，包括以下步骤：(1)制备半干式智能生物传感平台：包括具有微孔结构的水凝胶、DNA探针和负载图像分析软件的电子设备；(2)汞离子检测：汞离子样品溶液注入DNA水凝胶的微孔中，并置于紫外光下以获得荧光信号，利用电子设备拍摄图像，并通过电子设备上的图像分析软件获得样品相应的荧光强度，建立荧光强度与样品浓度的定量关系，从而实现对汞离子的定量分析。本发明设计的DNA水凝胶，以一种便携式且易于操作的方式定量检测汞离子，并可以进行现场测试，本方法操作简单、检测时间短、检测灵敏度高、成本低廉、无需大型仪器。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备半干式智能生物传感平台：包括具有微孔结构的DNA水凝胶、具有发卡结构的DNA探针和负载图像分析软件的电子设备；
(2)汞离子检测：汞离子样品溶液注入DNA水凝胶的微孔中，并置于紫外光下以获得荧光信号，利用电子设备拍摄图像，并通过电子设备上的图像分析软件获得样品相应的荧光强度，建立荧光强度与样品浓度的定量关系，从而实现对汞离子的定量分析；
所述DNA水凝胶的荧光图像通过图像分析软件ImageJ进行分析；
所述具有发卡结构的DNA探针的序列为：TTG GTT TGT TTTCTT TCG TAT GCT TTG T-BHQ1-TT TCT TTC CTT AGT GTA ATC AAG GAA AGA AA-FAM；
所述具有微孔结构的DNA水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将琼脂糖粉末溶于pH为7.4～7.6，45～55mM Tris-HCl缓冲溶液中，缓冲溶液中包含0.4～0.6M NaCl，得到1～2％w/v琼脂糖溶液，加热至成琼脂糖溶液后，将其冷却至45～55℃；
(2)将琼脂糖溶液和终浓度为1～2μM的具有发卡结构的DNA探针混合，加热以形成水溶胶，冷却后即为具有微孔结构的DNA水凝胶；
DNA水凝胶冷却前将模具插入到水溶胶中，在冷却并除去模具后，制备具有微孔结构的DNA水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法，其特征在于，所述具有微孔结构的DNA水凝胶包括琼脂糖溶液和具有发卡结构的DNA探针。
3.根据权利要求2所述的一种基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法，其特征在于，所述具有发卡结构的DNA探针用于响应汞离子。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的一种基于智能DNA水凝胶的汞离子现场检测新方法，其特征在于，还包括步骤(3)检测汞离子线性实验，具体步骤如下：
(3.1)配置0.25nM，0.5nM，1nM，2.5nM，5nM，0.1μM，0.25μM，0.5μM，1μM，2.5μM浓度的汞离子标准溶液，将上述浓度的汞离子标准溶液注入DNA水凝胶的微孔中，反应60～120分钟；
(3.2)将包含汞离子的水凝胶置于紫外光下以获得荧光信号，通过电子设备记录DNA水凝胶的荧光图像。
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