CN105039521A - 基于DNA三叉结构的荧光探针检测Hg2+浓度的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于一基于DNA三叉结构的荧光探针特异性检测Hg2+、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)等含巯基物质浓度的方法及应用。3WJ由三条单链DNA退火组成,包含一条标记荧光基团HEX(称为SS)、一条标记猝灭基团BHQ1(称为QS)和一条不作任何标记(称为AS)的DNA。其中SS和AS富含胸腺嘧啶(T)。在无汞离子的情况下三条链在水溶液中形成稳定结构。加入Hg2+,其介导3WJ形成T-Hg2+-T,造成3WJ空间结构变化;再加入GSH或Cys后,3WJ结构发生恢复。这种结构变化可通过HEX荧光反映出来。通过荧光值的变化还可定量Hg2+、GSH和Cys。<pb pnum="1" />
Description
技术领域
本发明属于汞离子检测领域,涉及一种采用DNA检测汞离子浓度的方法,尤其是一基于DNA三叉结构的荧光探针检测Hg2+浓度的方法及应用。
技术背景
汞被认为是分布最广泛的重金属污染物之一,以不同的形式存在(有机、无机形式存在或者作为复合物)于环境当中,可以通过食物链在人体内富集,汞摄入过量会引起许多健康问题,例如:DNA损伤、脑损伤、器官功能损坏、免疫系统内稳态的破坏。在水生生态系统中,二价汞离子(Hg2+)的生物甲基化会产生神经和基因毒性的甲基汞,所以开发对环境和食品中Hg2+的检测十分必要。
Katz在1963年提出,当在天然DNA中加入汞离子后,汞离子会导致DNA中胸腺嘧啶的滑动并形成由汞离子连接的金属离子碱基对,并提出了汞离子与胸腺嘧啶以1:2的比例形成了T-Hg2+-T结构的假设,这个假设也在后面的研究中被证实了。近年来,日本科学家AkiraOno和HumikaTogashi小组用熔解曲线、电喷雾电离-质谱和核磁共振等手段证实了汞离子在DNA中形成T-Hg2+-T结构,将两个胸腺嘧啶桥连在一起的(如图7),并且,T-Hg2+-T的形成不会对DNA的双螺旋结构及电子传递特性产生明显影响。
目前检测汞离子的方法有电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、原子吸收光谱测定法(AAS)、氢化物发生-原子荧光光谱法、冷蒸汽原子荧光光谱等几种。尽管这些方法具有高度灵敏性,能进行多组分分析,但是成本高,耗时长并且操作复杂,随后又发展了一些基于有机发色团、有机荧光小分子以及共轭聚合物的传感技术。这些方法相对于传统方法具有简单、经济、快速的优势,但是却有水溶性差、灵敏度低、选择性局限的缺点,因此,人们迫切需要简便、快速、经济、准确的Hg2+检测分析方法。
荧光分析法是一种由试样溶液中荧光物质所发生的荧光强度的变化来测定试样溶液中荧光物质含量的方法,它具有简单快速、灵敏度高、选择性好等多种突出优点。DNA荧光探针对生物分子影响较小,荧光信号具有分析检测手段简单,灵敏度高等优势。在以往的研究中,已经开发出来一种基于分子信标(molecularbeacon,MB)的方法,基本的思路是在汞离子的作用下‘打开’(turn-on)或者‘关闭’(turn-off)分子新标,以造成可检测的荧光值的变化,根据此来检测溶液中二价汞离子的浓度(具体原理见图7),这种方法相对简单,易操作,灵敏度高,但是分子信标的两端被荧光发色团(fluorophore)和荧光猝灭团(quencher)占据,这就可能影响了其他标记的用,更重要的是这种分子信标的方法容易出现假阳性的问题,这些都影响了其在实践中的应用。
现有专利文献中公开了与本申请相关的几篇专利文献,具体内容如下:
CN102912011A公开了一种基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg2+检测芯片及方法,利用了Hg2+能特异性地与两条相邻全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链上的T碱基共价结合,形成稳定的分子间T–Hg2+-T结构,进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。制备包括三个步骤:首先将检测探针固定在经化学修饰的玻片上,然后将荧光标记以及淬灭基团标记的互补链分别与其杂交。使用芯片时只需将待测样品添加到芯片上并保持一段时间,冲洗后利用荧光芯片信号分析系统扫描芯片,通过分析荧光信号的变化即可实现对Hg2+的检测。样品中Hg2+浓度越高,荧光信号增强得越多。检测的Hg2+的浓度范围是10nM-100μM,具有很好的离子选择性。
CN104263837A公开基于三重信标修饰的金纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应检测水溶液中Hg2+和/或Ag+的方法,属于重金属离子的检测技术领域。包括通过制备BPS包裹的金纳米粒子、设计核酸探针、信标分子的修饰和重金属离子Hg2+和/或Ag+的检测等步骤。本发明提供了一种基于三重信标修饰的金纳米粒子三聚体的拉曼信号来检测水溶液中二价汞离子和/或银离子的方法,并且可以做到同时检测这两种离子,此种方法工作量少,节约成本,灵敏度高,方便快捷。
最近发展起来的简单快速地检测Hg2+的方法中,许多都采用了分子信标的技术方法,本发明不同于传统的分子信标的方法,设计应用了DNA三叉结构,用于检测Hg2+的浓度。
发明内容
本发明的目的在于提供一基于DNA三叉结构的荧光探针检测Hg2+浓度的方法及应用,本发明设计了一个基于DNA三叉结构(3WJ)的生物检测器,可以用于直接特异性的定量检测Hg2+的浓度,同时本发明还基于该方法,得出一种利用该结构检测生物巯基(如谷胱甘肽和半胱氨酸)的浓度的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种基于DNA三叉结构(DNAthree-wayjunction,3WJ)的荧光探针检测Hg2+浓度的方法,其特征在于:采用三条单链DNA,其中第一条链标记了荧光基团HEX,第二条标记了猝灭基团BHQ1,第三条链不作任何标记,其中标记了荧光基团HEX和标记了猝灭基团BHQ1单链DNA富含胸腺嘧啶T,三条链在水溶液中共同形成稳定的DNA三叉结构。在该含有3WJ的溶液加入含有Hg2+,Hg2+能够介导SS和AS单链DNA中的胸腺嘧啶形成T-Hg2+-T结构,将标记了猝灭基团BHQ1单链DNA从DNA三叉结构中‘推离’出去,DNA三叉结构变为双链DNA,使标记了荧光基团HEX和猝灭基团BHQ1的两条DNA分开,BHQ1对HEX荧光的猝灭被解除,HEX荧光值增加,HEX荧光值的变化与Hg2+浓度存在线性关系,通过荧光值的变化,检测出Hg2+的浓度。
而且,所述三条单链DNA的序列如下:
标记了荧光基团HEX单链DNA:5′-HEXCTCTGTCTGTTGCCTCCAGCGCCG-3′
标记了猝灭基团BHQ1单链DNA:5′-ACAGACAGCCCACAAGACAGAGBHQ1-3′
无标记单链DNA:5′-CGGCGCTGAACCAGGCTTCTGTCTGT-3′。
一种利用DNA中形成T-Hg2+-T结构检测谷胱甘肽和半胱氨酸浓度的应用。
本发明的优点和积极效果:
1、本发明的发明人经过一系列实验建立起来的荧光探针定量检测Hg2+的方法,检测的标准曲线的相关系数R2值为0.997,线性良好,由此标准曲线检测出的Hg2+浓度较准确。
2、本发明建立的检测方法检测限度低,最低检测限度为3nM,并且能够检测上至500nM浓度的Hg2+,检测范围较宽。美国环境保护署(USEPA,EnvironmentalProtectionAgency)规定饮用水中Hg2+的超标浓度为10nM;世界卫生组织(WorldHealthOrganization)规定引用水中汞离子浓度不得超过30nM,本发明的检测限低于规定标准,具备对应用水、食品等进行检测的能力。
3、本发明基于汞离子可以被生物巯基(biothiols)螯合的作用,进而解除其在T-Hg2+-T中的作用,所以本3WJ检测器还可以用来检测谷胱甘肽和半胱氨酸等含有巯基的化合物。发明人经过实验证明,该荧光探针用于检测谷胱甘肽相关系数R2值为0.999,检测范围为40nM-400nM,而用于检测半胱氨酸相关系数R2值为0.996,检测范围为20nM-400nM。
4、本发明设计的荧光探针,不仅可以准确地检测Hg2+的浓度,还可以在用于谷胱甘肽和半胱氨酸的定量,该检测方法准确,检测范围较宽,方法简单快捷,易操作。
5、本发明建立起来的检测方法对Hg2+检测的特异性强,对于Al3+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、K+、Li2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+等其他金属离子均没有作用。
附图说明
图1为本发明基于3WJDNA探针检测Hg2+的原理图;
图2为3WJ探针加入Hg2+、谷胱甘肽、半胱氨酸后荧光值的变化;A是未经过退火的3WJ;B是经过退火的3WJ;C是3WJ+Hg2+;D是含HEX修饰的单链DNA(SS);E是经过退火的3WJ+Hg2++谷胱甘肽;F是经过退火的3WJ+Hg2++半胱氨酸。加入3WJ终浓度为5nM;Hg2+浓度为500μM;谷胱甘肽和半胱氨酸浓度为500μM。
图3为本发明检测体系的选择性,加入3WJ终浓度为5nM,所有金属离子的浓度为500μM;
图4为本发明不同浓度汞离子下3WJ荧光探针的荧光发射光谱。内插图:汞离子浓度与荧光强度之间的线性关系;
图5为本发明不同浓度谷胱甘肽下3WJ荧光探针的荧光发射光谱。内插图:谷胱甘肽浓度与荧光强度之间的线性关系;
图6为不同浓度半胱氨酸下3WJ荧光探针的荧光发射光谱。内插图:半胱氨酸浓度与荧光强度之间的线性关系;
图7为前人应用分子信标检测Hg2+浓度的示意图。
具体的实施方式
为了理解本发明,下面结合实施例对本发明作进一步说明:下述实施例是说明性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明设计一种DNA三叉结构作为生物检测器,其由三条单链DNA退火后组成,其中第一条链标记了荧光基团HEX(命名为SS),第二条标记了猝灭基团BHQ1(命名为QS),第三条链不作任何标记(命名为AS),其中QS和AS单链DNA富含胸腺嘧啶T,三条链在水溶液中共同形成稳定的DNA三叉结构。在该含有3WJ的溶液加入含有Hg2+,Hg2+能够介导QS和AS单链DNA中的胸腺嘧啶形成T-Hg2+-T结构,将第QS单链DNA从DNA三叉结构中‘推离’出去,DNA三叉结构变为双链DNA,使标记了荧光基团HEX和猝灭基团BHQ1的两条DNA分开,BHQ1对HEX荧光的猝灭被解除,HEX荧光值增加,HEX荧光值的变化与Hg2+浓度在一定范围存在线性关系,所以通过荧光值的变化,检测出Hg2+的浓度。具体原理见附图1。
在含10nM荧光探针中加入汞离子、半胱氨酸和谷胱甘肽,并监测加入前后荧光信号的变化。结果如附图2所示,初始时荧光探针3WJ在554处荧光发射信号很弱,当加入了500μM的汞离子,可以观测到荧光强度得到了很大程度的增强,当继续加入500μM半胱氨酸或者谷胱甘肽,可以观测到大约90%的荧光信号被抑制,以上结果表明该方法可以实现对汞离子和谷胱甘肽以及半胱氨酸的检测。
具体操作步骤如下:
(1)荧光探针DNA三叉结构的形成
三条单链DNA的序列:
SS单链DNA:5′-HEXCTCTGTCTGTTGCCTCCAGCGCCG-3′
QS单链DNA:5′-ACAGACAGCCCACAAGACAGAGBHQ1-3′
AS单链DNA:5′-CGGCGCTGCTGGAGGCTTCTGTCTGT-3′
①将三条单链DNA按1:1:1的比例加入,终浓度均为15nM,缓冲液终浓度如下。
将以上组分混匀,95℃加热5min,自然冷却过夜,配对成1.5×3WJ。
(2)荧光探针3WJ对Hg2+的定量检测
①Hg2+贮存液的配制
0.5%HNO3溶解HgCl2,配成0.1M的Hg2+贮存液;
Hg2+贮存液的稀释缓冲液:0.05MTris-HCl,pH7.4;0.1MNaCl;
②10nM荧光探针3WJ与不同浓度Hg2+孵育条件如下:
将以上各组分混匀,37℃水浴40min,自然冷却至室温。使得荧光探针的三叉结构能够被Hg2+破坏,形成双链DNA,使另一条修饰BHQ1的DNA与之分开,从而使荧光值增大。
③用荧光分光光度计测定各管的荧光值,测定参数如下。
激发波长:535.0nm
发射波长开始:545.0nm
发射波长结束:620.0nm
扫描速度:30nm/min
激发波长狭缝宽度:5.0nm
发射波长狭缝宽度:10.0nm
将测定结果绘制标准曲线,如附图4,R2=0.997,y=58.08x+62.18,根据公式LOD=3σ/slope算得最低检测限度(limitationofdetection,LOD)为3nM,线性良好,检测范围宽。
(3)荧光探针3WJ对Hg2+检测的选择性
将AlCl3、CaCl2、FeCl3、GuSO4、KCl、LiSO4、MnCl2、NiCl2、ZnSO4分别溶于ddH2O配制成相应的金属离子溶液,终浓度均为0.1M,加入荧光探针3WJ,反应体系如下:
将以上组分混匀,37℃水浴40min,用荧光分光光度计测定各管的荧光值,将实验结果整理绘制图表,如附图3。在所有被加入的金属离子里只有汞离子能够导致明显的荧光强度降低,其他金属离子对传感体系的荧光影响并不大,这个结果证明该测汞离子体系对于其他干扰离子具有良好的选择性。
(4)荧光探针3WJ对谷胱甘肽的定量检测
按以上体系将各组分依次加入EP管中,共13份,混匀,37℃水浴40min,自然冷却至室温,使得荧光探针的三叉结构能够被Hg2+破坏,形成双链DNA,记录加入Hg2+之后荧光值的变化,而后向其中分别加入不同浓度的谷胱甘肽,终浓度为20nM-1000nM,37℃水浴40min,自然冷却至室温,用荧光分光光度计分别测定荧光值,将测得的数据整理绘图,得出荧光探针在加入Hg2+充分破坏3WJ结构之后,加入不同浓度的谷胱甘肽可使荧光探针的荧光值降低,随着谷胱甘肽浓度的增加,荧光值逐渐减弱,在谷胱甘肽浓度达到400nM时,荧光值的变化趋于平稳,由此可根据谷胱甘肽终浓度为20nM-400nM这一范围做出能定量检测谷胱甘肽的标准曲线图,如附图5,y=-46.93x+267.76,R2为0.999,线性良好,能够准确定量谷胱甘肽的浓度。
(5)荧光探针3WJDNA对半胱氨酸的定量检测
按以上体系将各组分依次加入EP管中,共13份,混匀,37℃水浴40min,自然冷却至室温,使得荧光探针的三叉结构能够被Hg2+破坏,形成双链DNA,记录加入Hg2+之后荧光值的变化,而后向其中分别加入不同浓度的半胱氨酸,终浓度为20nM-1000nM,37℃水浴40min,自然冷却至室温,用荧光分光光度计分别测定荧光值,将测得的数据整理绘图,得出荧光探针在加入Hg2+充分破坏3WJ结构之后,加入不同浓度的半胱氨酸可使荧光探针的荧光值降低,随着半胱氨酸的增加,荧光值逐渐减弱,在半胱氨酸浓度达到400nM时,荧光值的变化趋于平稳,由此可根据半胱氨酸终浓度为20nM-400nM这一范围做出能定量检测谷胱甘肽的标准曲线图,如附图6,y=-45.18x+310.33,R2为0.996,线性良好,能够准确定量半胱氨酸的浓度。
(6)加标回收率实验
10nM荧光探针3WJ在有自来水样品的背景下,与不同浓度标准品Hg2+孵育条件如下:
将以上各组分混匀,37℃水浴40min,自然冷却至室温,用荧光分光光度计分别测定荧光值,将测得的加标样品荧光值减去未加标的样品,差值代入标准曲线方程得到实际测得的Hg2+浓度,比上理论的Hg2+浓度,即得到加标回收率。实验结果表明,在自来水作为背景的条件下,加入标准样品的Hg2+浓度分别为5nM,10nM,30nM,300nM,400nM时,加标回收率分别为103.0%,102.3%,102.8%,104.9%,97.4%,如表1,相对标准偏差较小,该荧光探针能较准确地测定Hg2+的浓度。
表1实际水样中汞离子的回收率。
a:每个样品设置4次平行实验求得平均值。
Claims (3)
1.一种基于DNA三叉结构的荧光探针检测Hg2+浓度的方法,其特征在于:采用三条单链DNA,其中第一条链标记了荧光基团HEX,第二条标记了猝灭基团BHQ1,第三条链不作任何标记,其中标记了荧光基团HEX和标记了猝灭基团BHQ1单链DNA富含胸腺嘧啶T,三条链在水溶液中共同形成稳定的DNA三叉结构。在该含有3WJ的溶液加入含有Hg2+,Hg2+能够介导SS和AS单链DNA中的胸腺嘧啶形成T-Hg2+-T结构,将标记了猝灭基团BHQ1单链DNA从DNA三叉结构中‘推离’出去,DNA三叉结构变为双链DNA,使标记了荧光基团HEX和猝灭基团BHQ1的两条DNA分开,BHQ1对HEX荧光的猝灭被解除,HEX荧光值增加,HEX荧光值的变化与Hg2+浓度存在线性关系,通过荧光值的变化,检测出Hg2+的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于DNA三叉结构的荧光探针检测Hg2+浓度的方法,其特征在于:所述三条单链DNA的序列如下:
标记了荧光基团HEX单链DNA:5′-HEX
CTCTGTCTGTTGCCTCCAGCGCCG-3′
标记了猝灭基团BHQ1单链DNA:5′-ACAGACAGCCCACAAGACAGAGBHQ1-3′
无标记单链DNA:5′-CGGCGCTGAACCAGGCTTCTGTCTGT-3′。
3.一种利用DNA中形成T-Hg2+-T结构检测谷胱甘肽和半胱氨酸浓度的应用。
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Song et al. | A nuclease-assisted label-free aptasensor for fluorescence turn-on detection of ATP based on the in situ formation of copper nanoparticles | |
Wang et al. | A single fluorophore ratiometric nanosensor based on dual-emission DNA-templated silver nanoclusters for ultrasensitive and selective Pb2+ detection | |
Lu et al. | A highly sensitive and selective optical sensor for Pb2+ by using conjugated polymers and label-free oligonucleotides | |
Memon et al. | Utilization of unmodified gold nanoparticles for label-free detection of mercury (II): Insight into rational design of mercury-specific oligonucleotides | |
Zhao et al. | A methylation-blocked cascade amplification strategy for label-free colorimetric detection of DNA methyltransferase activity | |
Wu et al. | Optical detection of DNA hybridization based on fluorescence quenching of tagged oligonucleotide probes by gold nanoparticles | |
Ma et al. | A label-free aptasensor for turn-on fluorescent detection of ATP based on AIE-active probe and water-soluble carbon nanotubes | |
Fu et al. | A label-free DNAzyme fluorescence biosensor for amplified detection of Pb2+-based on cleavage-induced G-quadruplex formation | |
Yun et al. | Graphene oxide-based fluorescent “turn-on” strategy for Hg2+ detection by using catalytic hairpin assembly for amplification | |
Yu et al. | DNAzyme-integrated plasmonic nanosensor for bacterial sample-to-answer detection | |
Zhang et al. | A ratiometric fluorescent probe for sensitive, selective and reversible detection of copper (II) based on riboflavin-stabilized gold nanoclusters | |
Liu et al. | A novel quantum dots-based OFF–ON fluorescent biosensor for highly selective and sensitive detection of double-strand DNA | |
Saneyoshi et al. | Long-lived luminogenic probe for detection of RNA in a crude solution of living bacterial cells | |
Yang et al. | Highly sensitive and selective detection of silver (I) in aqueous solution with silver (I)-specific DNA and Sybr green I | |
Liu et al. | Evaluation of DNA methyltransferase activity and inhibition via chiroplasmonic assemblies of gold nanoparticles | |
Qing et al. | Colorimetric multiplexed analysis of mercury and silver ions by using a unimolecular DNA probe and unmodified gold nanoparticles | |
Zhu et al. | Label‐Free Detection of MicroRNA: Two‐Step Signal Enhancement with a Hairpin‐Probe‐Based Graphene Fluorescence Switch and Isothermal Amplification | |
Mao et al. | Nanomaterial-based aptamer sensors for analysis of illicit drugs and evaluation of drugs consumption for wastewater-based epidemiology | |
Wu et al. | Oligonucleotide-functionalized silver nanoparticle extraction and laser-induced fluorescence for ultrasensitive detection of mercury (II) ion | |
Gao et al. | Nanoparticle-aided amplification of fluorescence polarization for ultrasensitively monitoring activity of telomerase | |
Wang et al. | Poly (adenine)-templated fluorescent Au nanoclusters for the rapid and sensitive detection of melamine | |
Yang et al. | A novel fluorescent detection for PDGF-BB based on dsDNA-templated copper nanoparticles | |
Yang et al. | A label-free fluorescent probe based on DNA-templated silver nanoclusters and exonuclease III-assisted recycling amplification detection of nucleic acid | |
Yu et al. | A PCR-free colorimetric strategy for visualized assay of telomerase activity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151111 |