CN111323463A - 细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析 - Google Patents
细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111323463A CN111323463A CN202010335229.6A CN202010335229A CN111323463A CN 111323463 A CN111323463 A CN 111323463A CN 202010335229 A CN202010335229 A CN 202010335229A CN 111323463 A CN111323463 A CN 111323463A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- bipolar electrode
- situ
- cells
- cell surface
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 176
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 56
- HKAVADYDPYUPRD-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrazine-2-thione Chemical compound SC1=CN=CC=N1 HKAVADYDPYUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 108010015133 Galactose oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 17
- -1 hydrazone compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims abstract description 14
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 17
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 17
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 15
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 15
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 8
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N indium;oxotin Chemical compound [In].[Sn]=O AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 238000001723 curing Methods 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 4
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 claims description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- QFLARMBBFKMMGK-UHFFFAOYSA-N [K].[K].O.O.S(=O)(=O)=C1CC=C(C=C1)P(C1=CC=CC=C1)C1=CCC(C=C1)=S(=O)=O Chemical compound [K].[K].O.O.S(=O)(=O)=C1CC=C(C=C1)P(C1=CC=CC=C1)C1=CCC(C=C1)=S(=O)=O QFLARMBBFKMMGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 238000002174 soft lithography Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000010329 laser etching Methods 0.000 claims description 2
- 239000002090 nanochannel Substances 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229920002120 photoresistant polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims 2
- 238000005266 casting Methods 0.000 claims 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims 1
- KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L dipotassium;[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] phosphate Chemical class [K+].[K+].OC[C@H]1O[C@H](OP([O-])([O-])=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L 0.000 claims 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims 1
- NXYDVUXHGDMRGL-UHFFFAOYSA-N phenyl-bis(4-sulfonylcyclohexa-1,5-dien-1-yl)phosphane dihydrate Chemical compound C1C=C(C=CC1=S(=O)=O)P(C2=CCC(=S(=O)=O)C=C2)C3=CC=CC=C3.O.O NXYDVUXHGDMRGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 claims 1
- 238000004528 spin coating Methods 0.000 claims 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 abstract description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 abstract description 9
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 abstract description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 41
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 34
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 13
- 125000002519 galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 6
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 5
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 4
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 4
- 238000005401 electroluminescence Methods 0.000 description 4
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 3
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 3
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 2
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- QZPSXPBJTPJTSZ-UHFFFAOYSA-N aqua regia Chemical compound Cl.O[N+]([O-])=O QZPSXPBJTPJTSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 108010081400 fluorescein isothiocyante avidin Proteins 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 125000000972 4,5-dimethylthiazol-2-yl group Chemical group [H]C([H])([H])C1=C(N=C(*)S1)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910004042 HAuCl4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012511 carbohydrate analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L dimercury dichloride Chemical class Cl[Hg][Hg]Cl ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000003487 electrochemical reaction Methods 0.000 description 1
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- LLHKCFNBLRBOGN-UHFFFAOYSA-N propylene glycol methyl ether acetate Chemical compound COCC(C)OC(C)=O LLHKCFNBLRBOGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6402—Atomic fluorescence; Laser induced fluorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法;本方法步骤如下:1)制备双极电极微流控芯片;2)制备Bio‑DNA‑AuNPs‑Fc‑DNA纳米探针;3)在双极电极的阳极通道中原位孵育HepG2细胞,加入半乳糖氧化酶将细胞表面半乳糖上的羟基氧化为醛基,苯胺催化生物素酰肼反应形成腙复合物,以亲和素为桥梁,和Bio‑DNA‑AuNPs‑Fc‑DNA纳米探针结合;4)双极电极的阴极池加入刃天青分子,在2.4 V电位下,阳极引入的Fc被氧化,阴极刃天青被还原为高荧光的试卤灵,通过阴极的荧光强度定量检测阳极细胞表面半乳糖表达水平;本发明利用了温和的酶氧化法避免了荧光标记或质谱法对细胞的损伤,结合双极电极将灵敏的电化学信号转化为可视化的光学信号,实现了高分辨的荧光成像。
Description
技术领域
本发明属于生物传感技术领域,涉及一种电致荧光法定量检测活细胞表面聚糖的技术,具体涉及基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法。
背景技术
目前对于细胞表面聚糖的检测主要有质谱法、凝集素法及生物正交标记的的策略。质谱分析是进行糖类分析的强大工具,但由于它具有破坏性,因此很难分析活细胞表面的聚糖。尽管凝集素可以和细胞表面的碳水化合物高度特异性地识别,但是检测过程通常涉及荧光标记细胞,由于自体荧光存在导致灵敏度不足。生物正交代谢标记具有很高的反应动力学,但需要对细胞有毒性的铜作为催化剂,而且其原料难以得到。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的技术问题是提供了基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法。本发明是基于双极电极的原理,施加电压,在双极电极和溶液界面之间产生电势差,当该电势差达到一个临界值,就会在双极电极的两端发生氧化反应和还原反应。通过逐级修饰过程,在阳极细胞表面引入电活性分子二茂铁,阴极加入电致荧光变色分子刃天青,在外加电压下,阳极Fc被氧化,阴极无荧光的刃天青被还原为高荧光的试卤灵,通过荧光强度的改变可以对细胞表面聚糖进行定量检测。借助于具有大的比表面积和良好导电性的AuNPs,及高灵敏度的电化学信号和高分辨率的荧光成像的转化,实现了活细胞表面聚糖的原位高灵敏检测。
基于双极电极原理我们发明了电致荧光技术,在双极电极(BPE)的阳极中通过温和的酶促标记将电活性分子引入,在阴极中添加电致荧光变色分子刃天青,并利用高度灵敏的电化学信号控制阴极荧光信号,由阴极的荧光信号强度判断阳极活细胞表面聚糖的表达水平。荧光和电化学结合,不仅具有电化学的高灵敏度,而且具有荧光的高分辨成像,再者,不需要复杂的仪器设备,测量简便、快速,基于微流控芯片的小型化,减少了生物样品的消耗,节约了实验成本,闭合的双极电极芯片,使得检测端和信号端物理隔离,避免了信号之间的相互干扰。
技术方案:本发明提供了一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法,包括以下步骤:
1)利用激光刻蚀得到设计的氧化铟锡(ITO)电极阵列;
2)用软光刻的方法制得具有微流控纳米通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)上层芯片,在显微镜下用等离子体清洗机将制备好的ITO电极与上层PDMS芯片键合,使微流控通道与电极吻合;
3)制备13 nm的金纳米粒子(AuNPs);
4)将制备好的金纳米粒子表面修饰Fc-DNA与Bio-DNA,得到Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针;
5)在经过步骤2)得到的ITO电极阵列上的双极电极阳极微流控通道中,原位孵育一定浓度的肝癌细胞HepG2细胞,加入半乳糖氧化酶将细胞表面半乳糖上的羟基氧化为醛基,苯胺催化生物素酰肼反应形成腙复合物,因而在细胞表面引入生物素靶标,以亲和素作为桥梁,和经过步骤4)制备得到的Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针结合;
6)在经过步骤2)得到的ITO电极阵列上的双极电极的阴极池中,加入刃天青分子,在一定的外加电位下,阳极引入的Fc被氧化,阴极无荧光的刃天青被还原为高荧光的试卤灵,通过阴极的荧光强度定量检测阳极细胞表面半乳糖表达水平。
其中,所述步骤1)的电极的宽度为500微米,水平有三行电极,竖直三列电极,两端的两列电极为驱动电极,尺寸相同,长13mm,中间一列为双极电极,长12mm,双极电极和两列驱动电极之间的间距为1mm;相邻两行驱动电极间的间距为6 mm。
其中,所述步骤2)具体步骤如下:将100 μm厚的负性光刻胶(SU-8,2150)旋涂到裸硅片上。将其置于热板上加热固化,冷却至室温,然后该硅片在具有设计图案的掩模下暴露于紫外光,最后使用SU-8显影剂显影获得硅片上的通道模具。将脱气的混合充分的聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物(PDMS单体:固化剂= 10:1)浇铸到置于培养皿中的模具上,并在80°C的烘箱中固化2小时。将固化的PDMS从掩模上取下,切成带有通道适当尺寸的单个芯片,用打孔器打孔作为流通液体的进出口。通过氧等离子体清洗机处理,将制备的PDMS和蚀刻的ITO玻璃键合在一起,然后在80℃的烘箱中加热2小时。
其中,所述步骤3)具体步骤为:实验中所用的磁子、两口烧瓶及冷凝管浸泡于碱缸过夜,然后在王水中浸泡24小时,用大量的一次水、二次水冲洗后使用。向沸腾的四氯金酸(HAuCl4)溶液(1 mM,50 mL)的搅拌溶液中,快速添加柠檬酸三钠溶液(38.8 mM,5 mL),连续搅拌并保持沸腾15分钟,同时溶液颜色由清澈变为黑色,紫色,最后变成深红色,将溶液冷却至室温。最后,将制备好的金纳米粒子(AuNPs)溶液保存在4℃下以备后期使用。
其中,所述步骤4)Fc-DNA的序列如SEQ ID NO:1所示:
5′-Fc-GAGTTGTCGGTGTAGGTCG-(CH2)3-SH-3′;
Bio-DNA的序列如SEQ ID NO:2所示:
5′-biotin-GAGTTGTCGGTGTAGGTCG-(CH2)3-SH-3′。
其中,所述步骤4)具体步骤为:将1mg 双(对-磺酰基苯基)苯基膦二水合二钾盐(BSPP)添加到上述制备的AuNPs水溶液(10nM,1.5mL)中,以取代柠檬酸盐配体来保护AuNPs,同时在高盐离子浓度下增加了AuNPs-DNA复合物的稳定性,室温下在摇床上轻轻摇动,孵育24小时。然后,以1:8的摩尔比将75 μL的Bio-DNA(1 μM)和60 μL的Fc-DNA(10 μM)添加到上述溶液中,并用62 μL 1 M 氯化钠(NaCl)的盐稳定化处理。在室温下摇动反应24小时后,加入2 μL 20 mM 巯基聚乙二醇(HS-PEG),室温震荡2小时以封闭非特异性吸附位点。最后,将DNA官能化的AuNPs离心,然后用超纯水洗涤3次,存储在4°C备用。
其中,所述步骤5)中在双极电极的阳极微流控通道中原位孵育一定浓度的肝癌细胞HepG2细胞,细胞培养的具体步骤如下:HepG2肝癌细胞培养在含10%FBS和双抗的DMEM培养基中,在含5% CO2,37℃细胞培养箱培养到指数生长期用胰蛋白酶消化,离心,重新分散于培养基中,将1 × 106个/mL浓度的细胞注入用PLL处理过的微流控芯片中继续孵育6小时。
其中,所述步骤5)具体步骤如下:用PBS洗涤三次后,在37°C下加入3 U mL-1的半乳糖氧化酶(GAO)孵育1 h,以将Gal/GalNAc的C6处的羟基选择性氧化为醛基。洗涤后,加入包含10 mM苯胺,100 μM 生物素酰肼(BH)和5%胎牛血清(FBS)的混合物,并在4°C下孵育1.5h,从而产生连接在细胞表面的生物素靶标。将细胞用PBS小心洗涤3次,然后加入0.1 mg /mL-1亲和素,在室温下孵育30min,再用PBS洗涤3次。最后,将细胞与4 μL制备好的Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针在室温下孵育30分钟。
其中,所述步骤6)中的刃天青浓度为50 μM。
其中,所述步骤6)施加在驱动电极上的电压为2.4 V。
有益效果:本发明是在双极电极的原理的基础上,利用电致荧光技术,在双极电极(BPE)的阳极中通过温和的酶促标记将电活性分子Fc引入,在阴极中添加电致荧光变色分子刃天青,并利用高度灵敏的电化学信号控制阴极荧光信号,由阴极的荧光信号强度判断阳极活细胞表面聚糖的表达水平。荧光和电化学结合,不仅具有电化学的高灵敏度,而且具有荧光的高分辨成像,再者,不需要复杂的仪器设备,测量简便、快速,基于微流控芯片的小型化,减少了生物样品的消耗,节约了实验成本,闭合的双极电极芯片,使得检测端和信号端物理隔离,避免了信号之间的相互干扰。由于聚糖在癌细胞表面的高表达,该方法可以很好的区分癌细胞和正常细胞,有望用于癌症的诊断和指导治疗。
附图说明
图1:图1A为双极电极芯片结构图;图1B为双极电极的阳极修饰过程及阴极刃天青的荧光还原。
图2:图2A为合成的13nm AuNPs的TEM图;图2B为制备的AuNPs的DLS表征;图2C为AuNPs和Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA的紫外吸收光谱图。
图3为在传统的三电极体系,ITO作为工作电极,饱和甘汞为参比电极,铂电极为对电极,扫描速率100 mV s-1下的循环伏安曲线。图3A为PBS和逐步加入3 U mL−1半乳糖氧化酶37℃孵育1h,10 mM 苯胺, 100 μM 生物酰肼和5%胎牛血清于4℃孵育1.5h,0.1 mg mL−1亲和素室温孵育0.5 h及4 nM Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA室温孵育0.5 h的循环伏安曲线;图3B为PBS和50 μM刃天青于0.1 M PBS中的循环伏安曲线。
图4:图4A为在1 × 106细胞mL-1 HepG2细胞存在下的原理验证图,在双极电极的阳极端不存在a:GAO;b:苯胺,BH和FBS的混合物;c:生物素;d:金纳米探针及e:存在PBS,阴极加入50 μM刃天青于0.1 M PBS中的共聚焦荧光图像。在阳极逐步加入3 U mL-1 GAO,10mM苯胺,100 μM BH和5%FBS的混合物,0.1 mg mL−1亲和素及4 nM Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA后,阴极存在 f:PBS;g:50 μM刃天青,在施加2.4 V电压后的共聚焦荧光成像图;图4B为在2.4 V电压下,荧光强度随着细胞浓度增加的变化趋势图,其中插图为对应的荧光成像图,从左到右的细胞浓度为1.0 × 103, 1.0 × 104, 5.0 × 104, 1.0 × 105, 2.5 × 105,5.0 × 105, 7.5 × 105, 1.0 × 106, 2.5 × 106, 5.0 × 106个细胞 mL-1;图4C为从1.0 × 103到1.0 × 106个mL-1的不同细胞浓度的校准曲线。
图5为检测聚糖表达的条件优化图:图5A:外加电压优化;图5B:Fc-DNA的浓度优化;图5C:Bio-DNA浓度优化;图5D:Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA孵育时间优化。
图6:图6A为细胞活性检测MTT实验,a:控制实验;b:向一定浓度的HepG2细胞中加入3 U mL-1 GAO;c:加入3 U mL-1 GAO及100 μM BH,10 mM苯胺与5%胎牛血清的混合物;d:加入3 U mL-1 GAO,100 μM BH及10 mM苯胺与5%胎牛血清的混合物,0.1 mg mL-1亲和素;e:加入3 U mL-1 GAO,100 μM BH及10 mM苯胺与5%胎牛血清的混合物,0.1 mg mL-1亲和素及Au纳米探针。图6B为对于逐级修饰完的细胞在2.4 V的外加电压下的死活测定。
图7:图7A为在1.0 × 106细胞mL-1 HepG2细胞下,a:存在10 mM Gal,b:不存在10mM Gal,c:存在10 mM Man和d:存在10 mM Glu的情况下的荧光共聚焦成像图。图7B为在2.4V下生物芯片检测细胞表面半乳糖的重复性(批内和批间)。
图8:图8A为基于该方法,荧光强度对应于正常肝细胞(LO2细胞)和肝癌细胞(HepG2细胞,Huh7细胞和Bel-7402细胞)上的半乳糖基表达水平;图8B在苯胺存在下用GAO和BH预处理的细胞,通过生物素与亲和素之间的相互作用,用生物素蛋白-FITC的标记细胞表面半乳糖基的荧光共聚焦图像。比例尺:50 μm。
图9:图9A为阳极两个单细胞捕获和阴极微流控通道的明场图;图9B为在BPE阳极的微孔阵列中捕获的两个单HepG2细胞的图片和在施加2.4 V电压的情况下,BPE阴极的共聚焦荧光成像图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干变型和改进,这些也应视为属于本发明的保护范围。
本实验中用到的试剂和仪器
实验用到的多聚L-赖氨酸溶液(PLL,0.1%),DNA序列均购自上海生物工程技术有限公司,激光蚀刻的ITO玻璃(厚度~185 nm,电阻~6Ω/m2)购买于华南湘城科技有限公司(中国深圳),聚二甲基硅氧烷(PDMS)和固化剂购自于道康宁公司(美国密歇根州密德兰),半乳糖,甘露糖,葡萄糖,半乳糖氧化酶,生物素酰肼(BH),抗生物素蛋白,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的生物素蛋白,牛血清白蛋白(BSA)和双(对-磺酰基苯基)苯基膦二水合二钾盐(BSPP)均购自于Sigma-Aldrich Co. Ltd.(密苏里州圣路易斯)。氯金酸(HAuCl4)和柠檬酸三钠二水合物(C6H5Na3O7·2H2O)购自国药控股化学试剂有限公司(中国上海)。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2-二苯基四唑溴化物(MTT),DMEM培养基,胎牛血清(FBS),二乙酸荧光素(FDA)和碘化丙啶(PI)购自凯基生物技术股份有限公司(中国南京)。刃天青钠盐和苯胺购自阿拉丁试剂有限公司(中国上海)。所有化学品均为分析纯,使用前无需进一步纯化。在整个实验过程中使用超纯水(25 °C, 18.2 MΩ cm)。
Fc-DNA序列如SEQ ID NO:1所示:5'-Fc-GAGTTGTCGGTGTAGTAGCGCG-(CH2)3-SH-3';
Bio-DNA序列如SEQ ID NO:2所示:5'-biotin-GAGTTGTCGGTGTAGGTCG-(CH2)3-SH-3';
仪器 TEM图像在JEM-2010 TEM(日本,JEOL)上收集。平均水合粒径用DLS仪器(Zetasizer Nano S/ZS Malvern,英国)测量。紫外可见光谱在Cary 100紫外可见分光光度计(新加坡安捷伦)上测得。共聚焦荧光成像是在奥林巴斯(FV3000,Olympus Corporation,日本)的共聚焦激光扫描显微镜上进行的。MTT数据在酶标仪(Multiskan GO,ThermoFisher Scientific,中国)上测定。使用Petroff-Hausser细胞计数器确定细胞个数。
实施例1:纳米探针的合成
13nm AuNPs的合成具体步骤为:实验中所用的磁子、两口烧瓶及冷凝管浸泡于碱缸过夜,在王水中浸泡24小时,然后用大量的一次水、二次水冲洗后使用。向沸腾的HAuCl4溶液(1 mM,50 mL)的搅拌溶液中,快速添加柠檬酸三钠溶液(38.8 mM,5 mL),连续搅拌并保持沸腾15分钟,同时溶液颜色由清澈变为黑色,紫色,最后变成深红色,将溶液冷却至室温。最后,将制备好的AuNPs溶液保存在4℃下以备后期使用。
Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA合成的具体步骤为:将1mg BSPP添加到上述制备的AuNPs水溶液(10nM,1.5mL)中,以取代柠檬酸盐配体保护AuNPs,同时在高盐离子浓度下增加了AuNPs-DNA复合物的稳定性,室温下在摇床上轻轻摇动,孵育24小时。然后,以1:8的摩尔比将75 μL的Bio-DNA(1 μM)和60 μL的Fc-DNA(10 μM)添加到上述溶液中,并用62 μL 1 MNaCl的盐稳定化处理。在室温下摇动反应24小时后,加入2 μL 20 mM HS-PEG,室温震荡2小时以封闭非特异性吸附位点。最后,将DNA官能化的AuNPs离心,然后用超纯水洗涤3次,存储在4°C备用。
其中,所用的Fc-DNA的序列为:5′-Fc-GAGTTGTCGGTGTAGGTCG-(CH2)3-SH-3′;
Bio-DNA的序列为:5′-biotin-GAGTTGTCGGTGTAGGTCG-(CH2)3-SH-3′。
如图2A和图2B所示,用TEM和DLS表征了制备的AuNPs的形态和平均水合直径。TEM图像显示AuNPs均匀分散在溶液中,直径约为13 nm。来自DLS测量的平均水合粒径为12.5nm,这与TEM图像一致。紫外-可见光谱证实了Fc-DNA和Bio-DNA与AuNPs的成功结合(图2C)。当Fc-DNA和Bio-DNA链均结合到AuNPs的表面时,在254 nm处出现了DNA的特征吸收峰和520 nm处的AuNPs的特征吸收峰,说明了该纳米探针的成功制备。
实施例2:原理验证1
1)我们首先测定了培养细胞的ITO电极在0.1 M PBS溶液中的循环伏安曲线,未出现明显的氧化还原峰;然后测得在ITO玻璃上原位培养细胞,并逐步加入3 U mL-1 GAO,10 mM苯胺,100 μM BH和5%FBS的混合物,0.1 mg mL−1亲和素及4 nM Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA后的CV曲线,逐步修饰后的电极的CV曲线在0.106 V和0.045 V出现了明显的氧化还原峰,检测结果表明利用该方法,电活性分子Fc可以被成功修饰,见图3A。
2)其次测定了ITO电极在饱和N2氛围中0.1 M PBS溶液与50 μΜ刃天青的PBS溶液的循环伏安曲线,在只含PBS的CV曲线中没有出现明显的氧化还原峰,而在刃天青的CV曲线中可以看到在-0.579 V出现了刃天青的还原峰。实验结果表明刃天青可以被还原。
实施例3:原理验证2
接种到双极电极的阳极微流控通道中一定浓度的肝癌细胞HepG2细胞孵育6小时,细胞贴壁后,加入半乳糖氧化酶将细胞表面半乳糖上的羟基氧化为醛基,苯胺催化生物素酰肼反应形成腙复合物,因而在细胞表面引入生物素靶标,以亲和素作为桥梁,和Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针结合。在双极电极的阴极池加入刃天青分子,在一定的外加电位下,阳极引入的Fc被氧化,阴极无荧光的刃天青被还原为高荧光的试卤灵,通过阴极的荧光强度定量检测阳极细胞表面半乳糖表达水平。
在1.0 × 106个细胞 mL-1,在双极电极的阳极端不存在a:GAO;b:苯胺,BH和FBS的混合物;c:生物素;d:金纳米探针及e:存在PBS,阴极加入50μM刃天青于0.1 M PBS中,施加2.4 V的电压于驱动电极均未看到阴极的荧光现象。同样地,在阳极逐步加入3 U mL-1 GAO,10 mM苯胺,100 μM BH和5%FBS的混合物,0.1 mg mL−1亲和素及4 nM Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA后,阴极存在f:PBS时也未观察到荧光信号。只有在阳极逐步加入3 U mL-1 GAO,37℃孵育1h,10 mM苯胺,100 μM BH和5%FBS的混合物于4℃孵育1.5h,0.1 mg mL−1亲和素孵育0.5h及4 nM Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA孵育0.5 h后,阴极存在g:50 μM刃天青,在施加2.4 V电压后观察到很强的红色荧光。见图4A,进一步说明了该方案可以准确用于活细胞表面聚糖检测。
实施例4:基于双极电极原位电致荧光成像分析活细胞表面聚糖表达的方法之外加电压优化
1)电压优化为了更好地检测细胞表面的半乳糖,在存在1 × 106细胞mL-1 HepG2细胞下,优化了各种实验条件,包括驱动电位,Fc-DNA,Bio-DNA浓度和Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针孵育时间。对于基于BPE的传感平台,驱动电压是荧光性能的主要参数,因为只有适当的电压才能刺激附着在阳极电极上的Fc的氧化和阴极中刃天青的还原。如图5A所示,在1.2 V至3.0 V的不同驱动电压(Etot)下得到了阴极的荧光共聚焦成像,并用ImageJ软件直接转化为可分析的荧光强度值。当施加的电压小于1.6V时,没有荧光信号出现,表明该电压范围不足以刺激BPE上的氧化反应和还原反应。荧光强度随着驱动电压的增加而逐渐增加,并在电势达到2.4 V时达到平稳。结果表明2.4 V是触发生物传感器法拉第电化学反应的合适电势。因此,选择2.4 V作为适当的Etot,以获得更强的目标信号以用于进一步的实验。
2)优化Fc-DNA和Bio-DNA的浓度:如图5B所示,随着Fc-DNA浓度在100 nM至400 nM范围内增加,荧光强度逐渐增加。进一步增加Fc-DNA的浓度后,荧光强度不再显著增加,表明AuNPs的表面被大量的Fc-DNA占据。因此,选择400 nM Fc-DNA进行纳米探针的制备。如图5C所示,荧光强度随Bio-DNA浓度从10到50 nM线性增加,并在50 nM达到最大值。当Bio-DNA的浓度超过50 nM时,荧光强度反而降低了,这可能是由于Fc-DNA的减少所致,随着Bio-DNA浓度的增加,用于信号放大的Fc-DNA与AuNPs偶联相对减少。
3)优化Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针孵育时间:在存在1 × 106细胞mL-1HepG2细胞下,加入3 U mL-1的半乳糖氧化酶(GAO)于37℃孵育1 h,以将Gal/GalNAc的C6处的羟基选择性氧化为醛基。洗涤后,加入包含10 mM苯胺,100 μM 生物素酰肼(BH)和5%胎牛血清(FBS)的混合物,并在4°C下孵育1.5 h,从而产生连接在细胞表面的生物素靶标。将细胞用PBS小心洗涤3次,然后加入0.1 mg mL-1亲和素,在室温下孵育30min,再用PBS洗涤3次,然后加入4 μL Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针,孵育不同时间。如图5C所示,荧光强度随孵育时间的延长而增加,并在30min时达到稳定值。因此,在随后的实验中,将30min用于Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针的进一步孵育。
实施例5:基于双极电极原位电致荧光成像分析活细胞表面聚糖表达的方法之线性曲线
1)细胞培养HepG2肝癌细胞培养在含10%FBS和双抗的DMEM培养基中,在含5% CO2,37℃细胞培养箱培养到指数生长期用胰蛋白酶消化,离心,重新分散于培养基中,将不同浓度的细胞1.0 × 103, 1.0 × 104, 5.0 × 104, 1.0 × 105, 2.5 × 105, 5.0 × 105, 7.5× 105, 1.0 × 106, 2.5 × 106, 5.0 × 106个mL-1 HepG2细胞加入用PLL处理过的微流控芯片中,继续孵育6小时使细胞贴壁。
2)细胞表面引入电活性Fc分子,具体步骤如下:加入细胞的阳极通道用PBS洗涤三次后,在37°C下加入3 U mL-1的半乳糖氧化酶(GAO)孵育1 h,以将Gal/GalNAc的C6处的羟基选择性氧化为醛基。洗涤后,加入包含10 mM苯胺,100 μM 生物素酰肼(BH)和5%胎牛血清(FBS)的混合物,并在4°C下孵育1.5 h,从而产生连接在细胞表面的生物素靶标。将细胞用PBS小心洗涤3次,然后加入0.1 mg mL-1亲和素,在室温下孵育30min,再用PBS洗涤3次。最后,将细胞与4 μL制备好的Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针在室温下孵育30 min。双极电极的阴极池加入50 μM的刃天青的PBS溶液,在2.4 V的电压下,阳极电极上的Fc被氧化和阴极无荧光的刃天青被还原,产生具有高荧光的试卤灵,用共聚焦显微镜测定阴极的荧光强度成像,并用ImageJ软件直接转化为可分析的荧光强度值。
3)如图4B所示,在最佳条件下,荧光强度随着HepG2细胞数量的增加而逐渐增加。如图4C所示,在1 × 103 – 1 × 106个细胞mL-1的细胞浓度范围内获得了良好的线性关系,线性回归方程为I = 6.693 × 10-5 N + 4.543(细胞mL-1),相关系数为(R2)为0.999。该方法的检测限(LOD)为2个细胞(4 μL样品体积),与使用MCF-7细胞的电化学适体传感器的500个细胞mL-1相当,低于使用基于凝集素的电化学生物传感器的580个细胞 mL-1及使用电生化学发光生物传感器处理600个细胞mL-1的K562细胞。
实施例6:基于双极电极原位电致荧光成像分析活细胞表面聚糖表达的方法之顺序标记期间的细胞毒性和施加电压下的细胞活性
1)MTT实验步骤:在细胞表面的一系列半乳糖基标记过程中,HepG2细胞的活力对于准确监测活细胞上半乳糖的表达非常重要。因此,进行MTT测定以获得在顺序标记期间细胞的毒性。在半乳糖基基团标记的每个步骤中,通过MTT测定法测量HepG2细胞的活力。简而言之,将HepG2细胞接种于96孔板并在96孔板中培养4小时。然后将细胞进行一系列的糖基化标记过程,同时将未标记的细胞作为对照,加入相同量的培养基一起孵育。弃去培养基,向每个孔中加入500 μg mL-1 MTT(200 μL),并在37ºC下孵育4小时以形成甲瓒。然后,加入200μL DMSO,以溶解加入MTT后通过活细胞产生的甲瓒。将细胞板在室温下振动15min,并测定490 nm波长处的吸光度,用(Atest/Acontrol)×100计算出细胞活力值。
图6A MTT实验条件a:控制实验;b:向一定浓度的HepG2细胞中加入3 U mL-1 GAO;c:加入3 U mL-1 GAO,混合物100 μM BH,10 mM苯胺与5%胎牛血清;d:加入3 U mL-1 GAO,混合物100 μM BH及10 mM苯胺与5%胎牛血清,0.1 mg mL-1亲和素;e:加入3 U mL-1 GAO,混合物100 μM BH及10 mM苯胺与5%胎牛血清,0.1 mg mL-1亲和素及Au纳米探针。
结果表明,如图6A所示,在37°C下与加入3 U mL-1 GAO孵育1小时后,细胞活力保持96.5%,然后加入混合物含有10 mM苯胺,100 mΜ BH和5% FBS在4°C下1.5小时,随后的共价结合生物素,甚至结合Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针也显示出低细胞毒性。
2)外加电压下的细胞活性实验的具体步骤为:通过使用FDA/PI双重染色方法,在驱动电极上施加2.4 V电压对HepG2细胞活力的影响。具体为:向双极电极阳极微流控通道中的HepG2细胞中加入3 U mL-1的半乳糖氧化酶(GAO),在37°C下孵育1 h,以将Gal/GalNAc的C6处的羟基选择性氧化为醛基。洗涤后,加入包含10 mM苯胺,100 μM 生物素酰肼(BH)和5%胎牛血清(FBS)的混合物,并在4°C下孵育1.5 h,从而产生连接在细胞表面的生物素靶标。将细胞用PBS小心洗涤3次,然后加入0.1 mg mL-1亲和素,在室温下孵育30min,再用PBS洗涤3次。最后,将细胞与4 μL制备好的Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针在室温下孵育30min。用磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.01 M,pH 7.4)洗涤阳极微流体通道中的HepG2细胞。阴极池加入50 μM的刃天青的PBS溶液,施加2.4 V的电压后,将FDA/PI溶液(10 μg mL-1于PBS中)加入阳极槽中并孵育10分钟,然后用PBS彻底洗涤。在共聚焦荧光显微镜下观察阳极端细胞的染色情况。
FDA本身无荧光,只有在活细胞内非特异性酯酶的作用下生成具有绿色荧光的荧光素,PI它不能透过完整的细胞膜,但能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此绿色代表活细胞,红色代表死细胞,可见外加电位对细胞的活性没有太大影响。
实施例7:基于双极电极原位电致荧光成像分析活细胞表面聚糖表达的方法之选择性,重现性和准确性
1)选择性测试的步骤:为了验证通过酶促氧化来标记细胞上的聚糖位点对特定单糖的选择性识别,在培养细胞之前,首先将半乳糖氧化酶与5 mM不同的单糖包括半乳糖(Gal),甘露糖(Man)和葡萄糖(Glu))混合后加入具有一定浓度的HepG2细胞的双极电极阳极通道中,随后加入包含10 mM苯胺,100 μM 生物素酰肼(BH)和5%胎牛血清(FBS)的混合物,并在4°C下孵育1.5 h,从而产生连接在细胞表面的生物素靶标。将细胞用PBS小心洗涤3次,然后加入0.1 mg mL-1亲和素,在室温下孵育30min,再用PBS洗涤3次。最后,将细胞与4 μL制备好的Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针在室温下孵育30min。用磷酸盐缓冲盐水(PBS,0.01 M,pH 7.4)洗涤阳极微流体通道中的HepG2细胞。阴极池加入50 μM的刃天青的PBS溶液,施加2.4 V的电压后,用共聚焦显微镜成像双极电极阴极的荧光图像。
如图7A 在GAO与Gal首次混合后,由于竞争,它抑制了细胞表面的半乳糖基标记过程,因此观察不到荧光信号。但是,在没有Gal的情况下,或GAO与Man或Glu混合,可以观察到强烈的荧光信号,这表明细胞表面上的聚糖的化学标记是选择性的。
2)信号重现性测试的步骤(批内和批间):测定了基于BPE的电致荧光变色生物芯片的精确度,评估了批内和批间制备的芯片的重现性(图7B)。在一系列修饰过程之后,通过对阳极贴壁的1 × 106个细胞mL-1 HepG2细胞进行一系列修饰过程后,阴极池中加入50 μΜ 刃天青,施加2.4 V电位,通过测定双极电极阴极荧光强度,得出批内同一芯片测定5次最大相对标准偏差(RSD)小于4.7%。批间测试五个芯片,RSD精密度值不超过5.3%,表明可接受的精密度和制造可重复性。
3)准确性实验步骤:在阳极存在1 × 106个贴壁细胞mL-1 HepG2细胞下,用PBS洗涤三次,加入3 U mL-1的半乳糖氧化酶(GAO)孵育在37°C下1 h,以将Gal/GalNAc的C6处的羟基选择性氧化为醛基。洗涤后,加入包含10 mM苯胺,100 μM 生物素酰肼(BH)和5%胎牛血清(FBS)的混合物,并在4°C下孵育1.5 h,从而产生连接在细胞表面的生物素靶标。将细胞用PBS小心洗涤3次,然后加入0.1 mg mL-1亲和素,在室温下孵育30min,再用PBS洗涤3次。最后,将细胞与4 μL制备好的Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针在室温下孵育30分钟。双极电极的阴极池加入50 μM的刃天青的PBS溶液,在2.4 V的电压下,阳极电极上的Fc被氧化和阴极无荧光的刃天青被还原,产生具有高荧光的试卤灵,用共聚焦显微镜测定阴极的荧光强度成像,并用ImageJ软件直接转化为可分析的荧光强度值。
4)亲和素-FITC标记的实验步骤:在共聚焦培养皿中各接种一定浓度的肝正常细胞(LO2细胞)和肝癌细胞(HepG2细胞, Huh7细胞和Bel-7402细胞)。用PBS洗涤三次,加入3U mL-1的半乳糖氧化酶(GAO)孵育在37°C下1 h,以将Gal/GalNAc的C6处的羟基选择性氧化为醛基。洗涤后,加入包含10 mM苯胺,100 μM 生物素酰肼(BH)和5%胎牛血清(FBS)的混合物,并在4°C下孵育1.5 h,从而产生连接在细胞表面的生物素靶标。将细胞用PBS小心洗涤3次,然后加入0.1 mg mL-1 FITC-亲和素,在室温下孵育30min,再用PBS洗涤3次。用共聚焦显微镜成像FITC对细胞表面聚糖的标记情况。
由于半乳糖基在癌细胞表面高度表达,因此该策略可用于区分癌细胞和正常细胞。如图8A所示,与正常肝细胞相比,所有三种肝癌细胞均显示高水平的半乳糖基表达。该结果与传统的细胞表面半乳糖基基团的荧光FITC标记共聚焦成像结果相符。此外,通过比较化学标记细胞表面半乳糖基基团与FITC-亲和素的方法,该策略的准确性也得以实现。半乳糖基在正常肝细胞表面有一定表达量,但表达量明显低于肝癌细胞。
实施例8:基于双极电极原位电致荧光成像分析活细胞表面聚糖表达的方法之半乳糖在两个单HepG2细胞上的荧光成像分析
为了研究本荧光成像平台在两个单细胞水平进行半乳糖分析的性能,使用软光刻技术构建了用于捕获两个单细胞的微流体通道。如图9A所示,微流控芯片内部的捕获结构将注入的流分成两股流:流向中心的路径a和由通过通道的两个边界的两个对称流组成的路径b。携带细胞的流体流线流经90 μm宽的主通道,然后进入2 μm的间隙阱作为捕获细胞的位点。捕获细胞后,路径a被阻塞,阻力增加,因此,流过捕获区的流体流线(细胞)的比例减少。其余细胞通过路径b进入下一个捕获位点。从微通道入口以5μL min-1的恒定流速注入浓度为1 × 104细胞/mL的HepG2细胞。在陷阱中捕获了两个单细胞后,通过逐步修饰过程将电活性分子Fc引入BPE的阳极中。在2.4 V驱动下,在阴极处检测到较弱的电致荧光信号。所有这些结果证明了该实验方法的高灵敏度,该方法可以检测两个单细胞上聚糖的表达水平。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案,而不应视为对于本发明的限制,本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案,包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围,即在此范围内的等同替换改进,也在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 东南大学
<120> 细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagttgtcgg tgtaggtcg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagttgtcgg tgtaggtcg 19
Claims (10)
1.一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)利用激光刻蚀得到设计的氧化铟锡电极阵列;
2)用软光刻的方法制得具有微流控纳米通道的聚二甲基硅氧烷上层芯片,用等离子清洗机将制备好的氧化铟锡电极与上层聚二甲基硅氧烷芯片键合,使微流控通道与电极相吻合;
3)制备金纳米粒子;
4)将制备好的金纳米粒子表面修饰Fc-DNA与Bio-DNA,得到Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针;
5)在经过步骤2)得到的氧化铟锡电极阵列上的双极电极阳极微流控通道中,原位孵育肝癌细胞HepG2细胞,加入半乳糖氧化酶、苯胺、生物素酰肼,在细胞表面引入生物素靶标后,以亲和素作为连接,并与Bio-DNA-AuNPs-Fc-DNA纳米探针结合;
6)在经过步骤2)得到的氧化铟锡电极阵列上的双极电极阴极池中,加入刃天青,在外加电位下,通过阴极的荧光强度定量检测阳极细胞表面半乳糖表达水平。
2.根据权利要求1所述的一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法,其特征在于,所述步骤1)中氧化铟锡电极阵列上设有两列驱动电极,两列驱动电极之间设有一列双极电极,双极电极与两列驱动电极之间的间距均为1mm;双极电极的长度为12mm,两列驱动电极的长度均为13mm;每一列驱动电极以及双极电极均分为三行电极,相邻两行电极之间的间距为6 mm。
3.根据权利要求1所述的一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法,其特征在于,所述步骤2)具体步骤如下:
A、将负性光刻胶旋涂到裸硅片上,并置于热板上加热固化后冷却,将硅片在具有设计图案的掩模下暴露于紫外光,得到硅片上的通道模具;
B、将聚二甲基硅氧烷预聚物浇铸到通道模具上,进行烘干固化后,将固化的带有通道的聚二甲基硅氧烷切成芯片,并将每片芯片打孔获得流体的进出口;
C、通过氧等离子清洗机将制备的聚二甲基硅氧烷芯片和蚀刻的氧化铟锡电极键合后,烘干,即可得到。
4.根据权利要求1所述的一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法,其特征在于,所述步骤3)具体步骤为:向四氯金酸溶液中,加入柠檬酸三钠溶液,进行搅拌后冷却,即可得到金纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法,其特征在于,所述四氯金酸溶液的浓度为0.5~2 mmol/L,柠檬酸三钠的浓度为38~40mmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法,其特征在于:
所述步骤4)中Fc-DNA的序列如SEQ ID NO:1所示:
5′-Fc-GAGTTGTCGGTGTAGGTCG-(CH2)3-SH-3′;
Bio-DNA的序列如SEQ ID NO:2所示:
5′-biotin-GAGTTGTCGGTGTAGGTCG-(CH2)3-SH-3′。
7.根据权利要求1所述的一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法,其特征在于,所述步骤4)具体步骤为:将双(对-磺酰基苯基)苯基膦二水合二钾盐加入至金纳米粒子水溶液中进行孵育;加入Bio-DNA和Fc-DNA后,加入氯化钠和巯基聚乙二醇,进行震荡、离心,将离心后的物质分散于超纯水中,即可得到。
8.根据权利要求7所述的一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法,其特征在于,所述双(对-磺酰基苯基)苯基膦二水合二钾盐的初始加入量为0.8~1.0mg,金纳米粒子水溶液的初始浓度为10nmol/L,氯化钠溶液的初始浓度为0.9~1.2mol/L,Bio-DNA与Fc-DNA的摩尔比为1:8;巯基聚乙二醇的初始浓度为15~20mmol/L。
9.根据权利要求1所述的一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法,其特征在于,所述步骤5)加入双极电极阳极池中的细胞数目为1 × 103 - 5 × 106个/mL;半乳糖氧化酶的浓度为2.8~3.2U/mL,生物素酰肼的浓度为98~102 μmol/L,苯胺的浓度为9~12 mmol/L,亲和素的浓度为0.1~0.15 mg/mL。
10.根据权利要求1所述的一种基于双极电极细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析方法,其特征在于,所述步骤6)中的刃天青浓度为45~50μmol/L;所述步骤6)中施加在驱动电极上的电压为2.4 V。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010335229.6A CN111323463A (zh) | 2020-04-24 | 2020-04-24 | 细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010335229.6A CN111323463A (zh) | 2020-04-24 | 2020-04-24 | 细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111323463A true CN111323463A (zh) | 2020-06-23 |
Family
ID=71169917
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010335229.6A Pending CN111323463A (zh) | 2020-04-24 | 2020-04-24 | 细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111323463A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112285078A (zh) * | 2020-10-14 | 2021-01-29 | 安庆师范大学 | 一种基于智能dna水凝胶的汞离子现场检测新方法 |
CN115960160A (zh) * | 2021-10-12 | 2023-04-14 | 南京大学 | 活细胞膜整合素αvβ3聚糖的原位糖链延长方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5501959A (en) * | 1989-01-17 | 1996-03-26 | Alamar Biosciences Laboratory, Inc. | Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assays using resazurin and poising agents |
US20060199241A1 (en) * | 2005-03-02 | 2006-09-07 | Hyoungsik Yim | Electrochemically and optically monitoring cleaving enzyme activity |
GB0901085D0 (en) * | 2009-01-23 | 2009-03-11 | Secr Defence | Electrode and electrochemical sensor |
CN106033060A (zh) * | 2015-03-13 | 2016-10-19 | 南京理工大学 | 基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏度dna荧光分析方法 |
-
2020
- 2020-04-24 CN CN202010335229.6A patent/CN111323463A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5501959A (en) * | 1989-01-17 | 1996-03-26 | Alamar Biosciences Laboratory, Inc. | Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assays using resazurin and poising agents |
US20060199241A1 (en) * | 2005-03-02 | 2006-09-07 | Hyoungsik Yim | Electrochemically and optically monitoring cleaving enzyme activity |
GB0901085D0 (en) * | 2009-01-23 | 2009-03-11 | Secr Defence | Electrode and electrochemical sensor |
CN106033060A (zh) * | 2015-03-13 | 2016-10-19 | 南京理工大学 | 基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏度dna荧光分析方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
EN HAN 等: "Sensitive Chemiluminescent Imaging for Chemoselective Analysis of Glycan Expression on Living Cells Using a Multifunctional Nanoprobe", 《ANAL. CHEM.》 * |
JOSHUA P. GUERRETTE 等: "Fluorescence Coupling for Direct Imaging of Electrocatalytic Heterogeneity", 《J. AM. CHEM. SOC.》 * |
ZHAOYAN TIAN 等: "Electrofluorochromic Imaging Analysis of Glycan Expression on Living Single Cell with Bipolar Electrode Arrays", 《ANAL. CHEM.》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112285078A (zh) * | 2020-10-14 | 2021-01-29 | 安庆师范大学 | 一种基于智能dna水凝胶的汞离子现场检测新方法 |
CN115960160A (zh) * | 2021-10-12 | 2023-04-14 | 南京大学 | 活细胞膜整合素αvβ3聚糖的原位糖链延长方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fuchs et al. | In-line analysis of organ-on-chip systems with sensors: Integration, fabrication, challenges, and potential | |
Wu et al. | Reliable digital single molecule electrochemistry for ultrasensitive alkaline phosphatase detection | |
Ding et al. | Trends in cell-based electrochemical biosensors | |
KR102657461B1 (ko) | 단일-세포 세포내 나노-ph 프로브 | |
Hu et al. | Dual-mode sensing platform for electrochemiluminescence and colorimetry detection based on a closed bipolar electrode | |
Gu et al. | Enhanced electrochemical and SERS signals by self-assembled gold microelectrode arrays: A dual readout platform for multiplex immumoassay of tumor biomarkers | |
Gao et al. | Electrochemiluminescence imaging for the morphological and quantitative analysis of living cells under external stimulation | |
Li et al. | Triggerable H2O2–cleavable switch of paper-based biochips endows precision of chemometer/ratiometric electrochemical quantification of analyte in high-efficiency point-of-care testing | |
Li et al. | Monitoring the electrochemical responses of neurotransmitters through localized surface plasmon resonance using nanohole array | |
CN111323463A (zh) | 细胞表面聚糖原位电致荧光成像分析 | |
KR102074316B1 (ko) | 자성 나노입자 및 골드 나노클러스터가 결합된 나노복합체 및 그 제조방법 | |
CN108226141A (zh) | 一种基于原位合成的Ag纳米簇电致化学发光传感器的研制及其应用 | |
Ismail et al. | Enhanced bipolar electrochemistry at solid-state micropores: demonstration by wireless electrochemiluminescence imaging | |
Gou et al. | A Close Look at Mechanism, Application, and Opportunities of Electrochemiluminescence Microscopy | |
Zhang et al. | A sensitive signal-off electrogenerated chemiluminescence biosensing method for the discrimination of DNA hydroxymethylation based on glycosylation modification and signal quenching from ferroceneboronic acid | |
Wang et al. | Electrochemiluminescent TiO 2/CdS nanocomposites for efficient immunosensing of HepG2 cells | |
Li et al. | Electrochemical detection of circulating tumor cells: A mini review | |
Douglas et al. | DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array | |
Mehto et al. | Towards papertronics based electrode decorated with zinc oxide nanoparticles for the detection of the yellow fever virus consensus sequence | |
Dena et al. | Surface-imprinted polymers (SIPs): advanced materials for bio-recognition | |
Xu et al. | Resistive analysis of hydrogen peroxide in one axon of single neuron with nanopipets | |
Lulek et al. | Electrochemical sensing of doxorubicin hydrochloride under sodium alginate antifouling conditions using silver nanoparticles modified glassy carbon electrodes | |
Liang et al. | A novel cloth-based multiway closed bipolar electrochemiluminescence biosensor for accurate detection of uric acid | |
Chen et al. | Multiplexed detection of biomarkers using a microfluidic chip integrated with mass-producible micropillar array electrodes | |
Yea et al. | In situ electrochemical detection of embryonic stem cell differentiation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200623 |