CN107121415A - 一步式免标记荧光快速检测汞离子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一步式免标记荧光快速检测汞离子的方法，基于ssDNA可与Hg²⁺形成稳定的T‑Hg²⁺‑T复合物，并可折叠成稳定的发卡结构双链DNA(dsDNA)的原理，利用荧光染料SG I可以嵌入dsDNA双螺旋结构的小沟结构区域中，可被激发出较强的荧光，且荧光强度与Hg²⁺的浓度呈正相关，实现了对Hg²⁺的快速检测。对水样中Hg²⁺的最低检出限为3nM，低于美国环境保护署标准，而且特异性强，不受其它金属离子干扰，重复性好，本发明的检测方法成本较低、操作简单，易通过新型检测平台在现场Hg²⁺检测方面推广应用，实现自动化，在重金属的应急处置、环境监测、风险评估和管理等方面具有很大的潜力。

Description

一步式免标记荧光快速检测汞离子的方法

技术领域

本发明涉及一步式免标记荧光检测汞离子的方法，属于荧光检测技术领域。

背景技术

重金属污染已成为一个重要的全球性问题，人类由于接触污染的天然水和饮用水，尤其是剧毒的重金属汞，严重威胁着人类的健康。无机汞，即Hg和Hg²⁺通过人为原因或者自然原因被释放到环境中。汞的工业来源包括煤炭和黄金开采、垃圾焚烧、木材制浆、化石燃料燃烧和化学制造等。人类更多的暴露途径包括家庭和工作场所、宗教活动、牙科用汞齐合金等。此外，Hg²⁺很难被生物降解，可通过生物放大作用在体内富集，这将引起不同的人类疾病，如肾功能衰竭，产前脑损伤，认知和运动障碍，视力和听力损失，甚至死亡。它同时也是一种神经毒素，并可导致免疫系统功能障碍。

基于Hg²⁺对人类健康的严重危害以及可持续发展的要求，建立一种快速、低成本、高灵敏、高特异性检测Hg²⁺的方法非常有必要。传统的定量检测水样中Hg²⁺的方法包括电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法(atomic fluorescence spectroscopy,AFS)、原子吸收光谱法、荧光分光光度法和X射线吸收光谱法等。然而，这些传统的方法往往需要精密仪器，复杂样品前处理、较大的样本量以及对操作的专业培训，这都限制了其广泛应用。因此，建立一种新型的高灵敏、高特异性、低成本、快速简便的适用于自然环境和生物环境中Hg²⁺检测的方法尤为重要。

SYBR Green I(SG I)作为一种荧光染料，在分析和诊断领域发挥着越来越重要的作用。自推出以来，SG I已经被有效地应用于凝胶中核酸的检测，荧光成像技术，实时定量聚合酶链反应以及生物芯片领域等。它更倾向于与双链DNA(dsDNA)结合，发出较强的荧光信号；而与单链DNA(ssDNA)相互作用较弱，只发出微弱的荧光信号。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种一步式免标记荧光快速检测汞离子的方法。

本发明的技术方案概述如下：

(1)在6-8支离心管中加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SYBR Green I荧光染料，再分别加入50μL浓度呈梯度的选自5-1000nM的6-8个Hg²⁺水溶液，混匀，室温下孵育0.5-3min；

(2)采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下分别对步骤(1)获得的液体进行扫描，获得各自的荧光强度值，制备荧光强度响应标准曲线；

(3)重新取3-5支离心管，加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SYBR Green I荧光染料，再加入经0.45μm微孔滤膜过滤的50μL待测水样，混匀，室温下孵育0.5-3min；采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下对待测水样进行扫描，获得荧光强度值，与荧光强度响应标准曲线比对，得到待测水样的Hg²⁺浓度，所述ssDNA的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；所述ssDNA溶液的溶剂的配方为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸:10mM,NaNO₃:20mM,pH:7.6，余量为水。

本发明的优点：

本发明的方法灵敏、便捷、快速、经济，满足现场快速检测的要求。

附图说明

图1为汞特异性ssDNA序列二级结构。

图2为T-Hg²⁺-T结构示意图，其中T为胸腺嘧啶。

图3为实验原理图。

图4为不同浓度Hg²⁺的荧光响应曲线。

图5为检测体系的荧光强度响应标准曲线。

图6为检测体系的特异度验证。

阳性对照组(虚线框):黑色柱:1μM Hg²⁺；浅色柱:300nM Hg²⁺。

实验组:黑色柱:1μM干扰离子；浅色柱:900nM干扰离子与300nM Hg²⁺混合物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

一种富含T碱基的汞特异性ssDNA，它包含24个碱基，其中可以组成7对T-T。当Hg²⁺不存在时，ssDNA为无规则卷曲结构，当加入荧光染料SG I后，荧光信号较弱。通过Mfold软件模拟可知其自由能分别为ΔG_{Hairpin loop}＝2.98KJ/mol,ΔG_{External loop}＝-0.49KJ/mol，二级结构如图1所示，结果表明该二级结构较为稳定，不会发生自杂交和假阳性结果。当Hg²⁺存在时，由于T-Hg²⁺-T(见图2)的形成，ssDNA可以形成稳定的发夹结构，因为T-Hg²⁺-T比A-T碱基对更稳定。当加入SG I时，它可以嵌入双螺旋结构的小沟里，在535nm的发射波长处发出较强的荧光(图3)，且荧光强度与形成的dsDNA的量呈正相关，如果没有Hg²⁺存在，则SG I保持基线态，不发射荧光。因此，根据测得的荧光强度可以推算出水样中Hg²⁺的浓度。

实施例1

1实验方法

1.1试剂与材料通过Mfold(http://unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)设计ssDNA，由生工合成(上海，中国)，通过高效液相色谱法纯化。该汞特异性ssDNA的序列为:5’-CTTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTTG-3’(SEQ ID NO.1所示)。SG I(10,000×)购买于Invitrogen Biotechnology Co.,Ltd(上海，中国)，在-20℃储存。

Hg²⁺，Pb²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，Cr⁶⁺和Cd²⁺的标准液购买于AccuStandard,Inc.(纽黑文，美国)，浓度分别为1mg mL^-1。其余的化学药品均为分析纯。实验用水为超纯水。所有实验操作均在室温下进行。

1.2仪器荧光强度值(FIs)由F-4500荧光分光光度计测得(日立，日本)，测量参数如下：反应时间2s，光电管负高压700V，扫描速度1200nm min^-1，激发波长490nm，激发狭缝和发射狭缝为5nm。实验室方法比对采用国家标准Hg²⁺检测方法-原子荧光光谱法(GB/T-5750.6-2006,中国)(AFS-9800,北京海光，北京，中国)完成。

1.3汞特异性ssDNA的准备.将装有汞特异性ssDNA冻干粉的离心管在10000rpm下离心1分钟，然后用超纯水溶解，配置成100μM的储备液，-20℃储存。

1.4检测方法

(1)在7支离心管中加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SG I荧光染料，再分别加入50μL浓度呈梯度的Hg²⁺(5，10，50，100，200，500和1000nM)水溶液，混匀，室温下孵育1min；

(2)采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在510到600nm的发射波长下扫描，获得荧光强度响应曲线。随着Hg²⁺浓度的增大，荧光强度呈上升趋势，说明荧光强度与Hg²⁺浓度呈正相关，见图4。在535nm的发射波长下分别对步骤(1)获得的液体进行扫描，每个样品均重复测量3次，获得各自的荧光强度值，制备荧光强度响应标准曲线以及最低检出限，荧光强度响应标准曲线如图5所示，在5-200nM之间，Logistic回归曲线方程为y＝0.5625-0.6577/(1+(x/43.5960)^1.9243)(R²＝0.9961)；在100-1000nM之间，线性方程为y＝7.3725x+1.4825(R²＝0.9996)。根据3σ可推知该方法的最低检出限为3nM，低于美国环境保护署的标准(10nM)，其中σ为不加Hg²⁺时空白对照的标准差。而且，整个检测过程在1min内即可完成，具有较高的灵敏度，满足现场检测的需求。

(3)重新取3支离心管，加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SYBR Green I荧光染料，再加入3个不同地域的，经0.45μm微孔滤膜过滤的50μL待测水样，混匀，室温下孵育1min；采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下对待测水样进行扫描，获得荧光强度值，与荧光强度响应标准曲线比对，得到待测水样的Hg²⁺浓度，检测结果见表1，所述ssDNA的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；所述ssDNA溶液的溶剂的配方为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸:10mM,NaNO₃:20mM,pH:7.6，余量为水。

表1 3个水质样品中Hg²⁺的检测结果(nM)

检测方法的可行性通过加标回收实验来评估，并与实验室经典检测方法(AFS)作比对，AFS是中国饮用水国家标准中Hg²⁺的检测方法(GB/T-5750.6-2006)，分析结果如表2所示。本发明的方法和国家标准方法AFS相比的相对标准偏差小于10％，说明该方法的可靠性较好，两种方法在检测水样时没有明显差异。因此，该方法适用于环境饮用水中Hg²⁺的实际检测。

表2水质样品中Hg²⁺的检测结果(nM)

1.5特异性检测为了验证方法的特异性，在9支离心管中，加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SG I荧光染料，再各自加入50μL浓度均为1μMHg²⁺,Pb^{2 +},Ni²⁺,Zn²⁺,Ca²⁺,Cu²⁺,Fe³⁺,Cr⁶⁺或Cd²⁺，混匀，室温下孵育1min；采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下对待测水样进行扫描，获得荧光强度值，见图6的黑色柱，差异显著。

另取9支离心管，加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SGI荧光染料，再分别加入离子如下：

离心管1：50μL300nM Hg²⁺；

离心管2：50μL的Hg²⁺和Pb²⁺的混合溶液，其中Hg²⁺浓度为300nM，Pb²⁺浓度为900nM；

离心管3：50μL的Hg²⁺和Pb²⁺的混合溶液，其中Hg²⁺浓度为300nM，Ni²⁺浓度为900nM；

离心管4：50μL的Hg²⁺和Pb²⁺的混合溶液，其中Hg²⁺浓度为300nM，Zn²⁺浓度为900nM；

离心管5：50μL的Hg²⁺和Pb²⁺的混合溶液，其中Hg²⁺浓度为300nM，Ca²⁺浓度为900nM；

离心管6：50μL的Hg²⁺和Pb²⁺的混合溶液，其中Hg²⁺浓度为300nM，Cu²⁺浓度为900nM；

离心管7：50μL的Hg²⁺和Pb²⁺的混合溶液，其中Hg²⁺浓度为300nM，Fe³⁺浓度为900nM；

离心管8：50μL的Hg²⁺和Pb²⁺的混合溶液，其中Hg²⁺浓度为300nM，Cr⁶⁺浓度为900nM；

离心管9：50μL的Hg²⁺和Pb²⁺的混合溶液，其中Hg²⁺浓度为300nM，Cd²⁺浓度为900nM；

混匀，室温下孵育1min；采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下对待测水样进行扫描，获得荧光强度值，见图6的灰色柱，每组值非常接近。说明该检测Hg²⁺的方法几乎不受其他离子的干扰，特异性良好，满足实际检测的需求。

实施例2

一步式免标记荧光快速检测汞离子的方法，包括如下步骤：

(1)在6支离心管中加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SG I荧光染料，再分别加入50μL浓度呈梯度的选自5-1000nM的6个Hg²⁺水溶液，分别为5，20，100，400，800和1000nM混匀，室温下孵育0.5min；

(2)采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下分别对步骤(1)获得的液体进行扫描，获得各自的荧光强度值，制备荧光强度响应标准曲线；

(3)重新取4支离心管，加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SG I荧光染料，再加入50μL经0.45μm微孔滤膜过滤的待测水样，混匀，室温下孵育0.5min；采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下对待测水样进行扫描，获得荧光强度值，与荧光强度响应标准曲线比对，得到待测水样的Hg²⁺浓度，所述ssDNA的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；所述ssDNA溶液的溶剂的配方为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸:10mM,NaNO₃:20mM,pH:7.6，余量为水。

实施例3

一步式免标记荧光快速检测汞离子的方法，包括如下步骤：

(1)在8支离心管中加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SGI荧光染料，再分别加入50μL浓度呈梯度的选自5-1000nM的8个Hg²⁺水溶液，分别为5，10，20，80，160，320，640和1000nM混匀，室温下孵育3min；

(2)采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下分别对步骤(1)获得的液体进行扫描，获得各自的荧光强度值，制备荧光强度响应标准曲线；

(3)重新取5支离心管，加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SG I荧光染料，再加入50μL经0.45μm微孔滤膜过滤的待测水样，混匀，室温下孵育3min；采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下对待测水样进行扫描，获得荧光强度值，与荧光强度响应标准曲线比对，得到待测水样的Hg²⁺浓度，所述ssDNA的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；所述ssDNA溶液的溶剂的配方为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸:10mM,NaNO₃:20mM,pH:7.6，余量为水。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州医科大学;兰州大学

<120> 一步式免标记荧光快速检测汞离子的方法

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cttctttctt ccccttgttt gttg 24

Claims (1)

1.一步式免标记荧光快速检测汞离子的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)在6-8支离心管中加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SYBR Green I荧光染料，再分别加入50μL浓度呈梯度的选自5-1000nM的6-8个Hg²⁺水溶液，混匀，室温下孵育0.5-3min；

(2)采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下分别对步骤(1)获得的液体进行扫描，获得各自的荧光强度值，制备荧光强度响应标准曲线；

(3)重新取3-5支离心管，加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SYBR Green I荧光染料，再加入经0.45μm微孔滤膜过滤的50μL待测水样，混匀，室温下孵育0.5-3min；采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下对待测水样进行扫描，获得荧光强度值，与荧光强度响应标准曲线比对，得到待测水样的Hg²⁺浓度，所述ssDNA的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；所述ssDNA溶液的溶剂的配方为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸:10mM,NaNO₃:20mM,pH:7.6，余量为水。