CN104677869A - 一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇的方法 - Google Patents
一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇方法，包括一个制备适配体-纳米金探针序列的步骤，适配体为一段功能核苷酸序列，核酸序列为：5'-GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CAG-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA-TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3'，将纳米金和适配体结合，形成稳定的适配体-纳米金探针；在探针溶液中加入待检测的怀疑含有17β-雌二醇的水溶液，孵育，加入氯化钠溶液，通过测定共振散射信号强度来判断待测溶液中17β-雌二醇的含量。通过比较共振散射值的变化，实现对17β-雌二醇的检测。
Description
技术领域
本发明食品领域，涉及一种检测食品的方法，尤其涉及一种17β-雌二醇，具体来说是一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇的方法。
背景技术
环境雌激素，又称“内分泌干扰化合物”，是一类广泛地存在于环境中的污染物，可扰乱人体及动物体的正常内分泌功能，改变机体在发育和成年阶段胞内信号过程，从而造成它们的生殖、免疫、神经等系统的多种病变。然而，17β-雌二醇是诸多环境雌激素中作用最强烈的一种，普遍存在于各类环境，特别是水环境中，食品比如牛奶，蜂蜜等。17β-雌二醇在动物和人体内合成，具有内源性激素的活性，对人类和动物的影响是通过模拟、干扰或对抗机体内生荷尔蒙原有的正常合成、运输、释放和作用，使其无法维持自身的平衡和调节。
然而，就目前来看，传统的方法(色谱法等)虽然检测限很好，但是却具有分析时间长，操作复杂，需要大型精密仪器等缺点；免疫学方法虽然成本低廉但是容易出现假阳性的结果；而电化学方法则需要对电极进行修饰，识别能力不够，因此，开发一种快速、灵敏、便捷、实时检测17β-雌二醇的方法变的尤为重要。
功能核酸是一种新型识别分子，其本质是一段20-100bp长的单链DNA，是通过指数富集配体的系统进化技术(SELEX)筛选而来的，可以特异性结合目标分子。功能核酸容易人工合成，易修饰，而且具有较高的选择性和稳定性，因此被广泛应用在检测领域。本发明所采用的17β-雌二醇适配体，是由Kim等人在2007年首次筛选出并且应用电化学方法实现了对17β-雌二醇的检测。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇的方法，所述的这种方法解决了现有技术中检测17β-雌二醇的方法容易出现假阳性、成本高、检测时间长的技术问题。
本发明提供了一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇方法，包括以下步骤：
(1)一个制备适配体-纳米金探针序列的步骤，所述的适配体为一段功能核苷酸序列，所述的功能核苷酸的序列为：5'-GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CA G-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA-TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3'，将纳米金和所述的适配体结合，形成稳定的适配体-纳米金探针；
(2)在探针溶液中加入待检测的怀疑含有17β-雌二醇的水溶液，孵育，加入氯化钠溶液，通过测定共振散射信号强度来判断待测溶液中17β-雌二醇的含量。
进一步的，上述步骤(1)中，将功能核苷酸配制成1μmol/L的母液，步骤(2)中氯化钠溶液配制成浓度为2mol/L的母液。
进一步的，所述的纳米金纳米金通过以下方法制备：在每100毫升煮沸的质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液中，加入3.5毫升质量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，搅拌30分钟，移除加热装置后继续搅拌混合物10分钟，最后，使溶液达到室温并且使用0.2μm超滤膜过滤，然后储存在恒温为4度的黑色玻璃瓶中备用。
进一步的，上述步骤(1)中，检测体系中功能核酸的终浓度为20nM，使用量为1μmol/L的母液取10μL，纳米金的使用量为100μL，步骤(2)中，检测体系中氯化钠的浓度为120mM，使用量为2mol/L母液取30μL。
具体的，上述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇方法，包括以下步骤：
(1)一个建立已知17β-雌二醇浓度的检测体系的步骤，取至少六支分别加入10μL，1μmol/L 17β-雌二醇适配体的离心管，加入100μL纳米金溶液，充分混匀后将离心管置于25℃条件下孵育15min，然后分别加入10μL不同浓度的17β-雌二醇溶液，使得整个检测体系中17β-雌二醇的含量维持在0.1-3.0μmol/L，然后充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育15min，在上述混合液中加入30μL、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且采用缓冲液定容至500μL，留作以下测定用；
(2)另取1支离心管将17β-雌二醇溶液用10μL超纯水替代，按照上述步骤(1)的方法处理后作为空白对照体系溶液；
(3)分别取500μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液，置于石 英荧光比色皿中，所述的石英荧光比色皿的内径为0.5cm×0.5cm，外径为1.0cm×1.0cm，用荧光光度计进行扫描测定信号，扫描条件为：激发光狭缝为2.5nm，发射光狭缝为2.5nm，激发光波长为550nm条件下扫描，获得其共振散射信号光谱，17β-雌二醇和空白对照液的共振散射光谱信号分别为I550nm和(I550nm)b，计算相对共振散射强度值ΔI＝I550nm-(I550nm)b；
(4)以不同浓度17β-雌二醇(CE2)与对应的相对共振散射强度值ΔI作图，绘制标准曲线；
(5)制备样品检测体系：取10μL待测样品，加入到步骤(1)方法制备的检测体系离心管中，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育15min后，在混合液中加入30μL、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容至500μL，按步骤(3)方法测定共振散射信号并计算ΔI。
(6)根据计算所得的ΔI值，查标准曲线，可以求得样品中17β-雌二醇含量。
进一步的，所述的缓冲液为丙磺酸缓冲液，浓度为10mmol/L，PH值为7.0。
本发明的原理是：通过使用纳米金与17β-雌二醇的适配体---与功能核酸相结合形成适配体-纳米金探针，当检测体系中没有17β-雌二醇时，适配体-纳米金探针相对稳定，当加入高浓度盐溶液氯化钠时，溶液不会发生变化，共振散射信号不变；当检测体系中存在17β-雌二醇时，适配体-纳米金探针上的17β-雌二醇适配体会与17β-雌二醇发生特异性结合，从而释放出纳米金颗粒，当加入高浓度盐溶液氯化钠时，纳米金颗粒发生聚集，共振散射信号大大增加，并且随着17β-雌二醇浓度的增加，共振散射信号不断增加。通过比较共振散射值的变化，即可实现对17β-雌二醇的检测。
本发明建立了一种基于17β-雌二醇适配体利用共振散射光谱实现对17β-雌二醇的检测方法。纳米金具有较好的稳定性、生物相容性和共振瑞利散射效应，能与功能核酸组合成探针在共振瑞利散射光谱分析方面具有很好的应用；而共振瑞利散射光谱法是一种简便、快速、灵敏的光谱分析新技术，在核酸、蛋白质、小分子分析等领域获得了较好的应用。本发明在基于功能核酸的基础上，利用共振散射光谱对食品(包括牛奶)中17β-雌二醇进行快速、灵敏、便捷、实时检测。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明提供的检测方法不需 要大型仪器设备，成本低，检测灵敏度高，选择性好，操作简单且高效，可用于检测食品包括牛奶中17β-雌二醇的含量，检测的浓度范围是0.1-3.0μmol/L，最低检测限为9.0nM。
附图说明
图1是本发明检测17β-雌二醇的原理图。
图2显示了优化方法中不同氯化钠浓度的相对共振散射值。
图3显示了优化方法中不同17β-雌二醇适配体浓度的相对共振散射值。
图4显示了检测体系的共振散射信号变化与不同浓度17β-雌二醇的关系。
图5显示了是不同其他物质加入该检测体系后的共振散射信号变化量。
具体实施方式
实施例1 优化体系中氯化钠浓度
在1.5mL离心管中加入100μL纳米金溶液，再加入丙磺酸缓冲液(浓度为10mmol/L、PH为7.0)，混匀，依次加入浓度范围为0-160mmol/L的氯化钠溶液，五分钟之后测定共振散射值，得到相对共振散射值，绘制曲线，峰值最高对应的氯化钠浓度为120mmol/L，如图2所示。
实施例2 优化体系中17β-雌二醇适配体浓度
17β-雌二醇适配体购于上海生工，将收到的样品配制成1μmol/L的母液，然后分别加入浓度范围为0-40nmol/L的适配体于100μL纳米金溶液中配制成适配体-纳米金探针，孵育15min后加入一定浓度的雌二醇溶液，孵育15min，加入优化好的氯化钠溶液，丙磺酸缓冲液定容至500μL，五分钟后测定共振散射值，绘制曲线，峰值最高处对应的适配体浓度为20nmol/L，如图3所示。
实施例3 采用本发明的方法检测牛奶样品中是否含有17β-雌二醇的过程具体包括以下步骤：
(1)制备已知17β-雌二醇浓度的检测体系：取11支分别加入10μL，1μmol/L17β-雌二醇适配体的离心管，加入100μL纳米金溶液，充分混匀后将离心管置于25℃条件下孵育15min，然后分别加入10μL不同浓度的17β-雌二醇溶液，使得整个检测体系中17β-雌二醇的含量维持在0.1-3.0μmol/L，然后充分混匀 后再将离心管置于25℃条件下孵育15min，在上述混合液中加入30μL、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容至500μL，留作以下测定用；
(2)另取1支离心管将17β-雌二醇溶液用10μL超纯水替代，按照上述步骤(1)的方法处理后作为空白对照体系溶液；
(3)分别取500μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液，置于石英荧光用比色皿(内径为0.5cm×0.5cm，外径为1.0cm×1.0cm)中，用荧光光度计进行扫描测定信号。具体的扫描条件为：激发光狭缝为2.5nm，发射光狭缝为2.5nm，激发光波长为550nm条件下扫描，获得其共振散射信号光谱。17β-雌二醇和空白对照液的共振散射光谱信号分别为I550nm和(I550nm)b，计算相对共振散射强度值ΔI＝I550nm-(I550nm)b。
(4)以不同浓度17β-雌二醇(CE2)与对应的相对共振散射强度值ΔI作图，绘制标准曲线，其回归方程为：ΔI＝1893CE2+0.61。(如图4所示)
(5)制备样品检测体系：将某品牌纯牛奶加入三氯乙酸，去除牛奶中的蛋白质，离心后取上清液10μL，加入到具体实施方式步骤(1)方法孵育好的纳米金-适配体探针检测体系的离心管中，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育15min后，在混合液中加入30μL、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容至500μL，加入按步骤(3)方法测定共振散射信号并计算ΔI。
(6)根据计算所得的ΔI值，查标准曲线ΔI＝1779CE2-5.54，可以求得牛奶样品中17β-雌二醇含量。
(7)验证：用本发明方法测定3份含17β-雌二醇浓度分别为100nM、300nM、和500nM的处理后牛奶各一份，得到的平均回收率分别为108.3％，93.9％，107.6％，RSD值分别为5.8％，6.1％，4.6％，从而证明了本方法的可靠性。
采用本发明的方法测定牛奶中17β-雌二醇的浓度范围为0.1-3.0μM，最低检测限为9.0nM。
实施例4 17β-雌二醇的特异性实验
(1)取8支分别加入10μL，1μmol/L 17β-雌二醇适配体的离心管，加入100μL纳米金溶液，充分混匀后将离心管置于25℃条件下孵育15min，然后分别加入10μL，10μmol/L的17β-雌二醇、滴滴涕、乙烯雌酚、双酚A、铜离子、镉离子、四环素、氨基头孢烷酸溶液，然后充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育15min，在上述混合液中加入30μL、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并 且缓冲液定容至500μL，留作以下测定用；
(2)另取1支离心管加入10μL超纯水，按照上述步骤(1)的方法处理后作为空白对照体系溶液；
(3)按照实施例3中(3)的步骤进行测定共振散射值，绘制柱状图，通过柱状图可以看出17β-雌二醇具有较高的特异性 (如图5所示) 。
Claims (6)
1.一种基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)一个制备适配体-纳米金探针序列的步骤，所述的适配体为一段功能核苷酸序列，所述的功能核苷酸的序列为：5'-GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CAG-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA-TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3'，将纳米金和所述的适配体结合，形成稳定的适配体-纳米金探针；
(2)在探针溶液中加入待检测的怀疑含有17β-雌二醇的水溶液，孵育，加入氯化钠溶液，通过测定共振散射信号强度来判断待测溶液中17β-雌二醇的含量。
2.根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇方法，其特征在于：上述步骤(1)中，将功能核苷酸配制成1μmol/L的母液，步骤(2)中氯化钠溶液配制成浓度为2mol/L的母液。
3.根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇方法，其特征在于所述的纳米金通过以下方法制备：在100毫升煮沸的质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液中，加入3.5毫升质量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，搅拌30分钟，移除加热装置后继续搅拌混合物10分钟，最后，使溶液达到室温并且使用0.2μm超滤膜过滤，然后储存在恒温为4℃的黑色玻璃瓶中备用。
4.根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇方法，其特征在于，上述步骤(1)中，检测体系中功能核苷酸的终浓度为20nmol/L，使用量为1μmol/L的母液取10μL，纳米金的使用量为100μL，步骤(2)中，检测体系中氯化钠的浓度为120mM，使用量为2mol/L母液取30μL。
5.根据权利要求1所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)一个建立已知17β-雌二醇浓度的检测体系的步骤，取至少六支分别加入10μL，1μmol/L 17β-雌二醇适配体的离心管，加入100μL纳米金溶液，充分混匀后将离心管置于25℃条件下孵育15min，然后分别加入10μL不同浓度的17β-雌二醇溶液，使得整个检测体系中17β-雌二醇的含量维持在0.1-3.0μmol/L，然后充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育15min，在上述混合液中加入30μL、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且采用缓冲液定容至500μL，留作以下测定用；
(2)另取1支离心管将17β-雌二醇溶液用10μL超纯水替代，按照上述步骤(1)的方法处理后作为空白对照体系溶液；
(3)分别取500μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液，置于石英荧光比色皿中，所述的石英荧光比色皿的内径为0.5cm×0.5cm，外径为1.0cm×1.0cm，用荧光光度计进行扫描测定信号，扫描条件为：激发光狭缝为2.5nm，发射光狭缝为2.5nm，激发光波长为550nm条件下扫描，获得其共振散射信号光谱，17β-雌二醇和空白对照液的共振散射光谱信号分别为I550nm和(I550nm)b，计算相对共振散射强度值ΔI＝I550nm-(I550nm)b；
(4)以不同浓度17β-雌二醇(CE2)与对应的相对共振散射强度值ΔI作图，绘制标准曲线；
(5)制备样品检测体系：取10μL待测样品，加入到步骤(1)方法制备的检测体系离心管中，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育15min后，在混合液中加入30μL、2mol/L的氯化钠溶液充分混匀并且缓冲液定容至500μL，按步骤(3)方法测定共振散射信号并计算ΔI。
(6)根据计算所得的ΔI值，查标准曲线，可以求得样品中17β-雌二醇含量。
6.根据权利要求5所述的基于功能核酸利用共振散射光谱检测17β-雌二醇方法，其特征在于：所述的缓冲液为丙磺酸缓冲液，浓度为10mmol/L，PH值为7.0。
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