CN103196875A - 基于纳米金催化的共振散射光谱四环素检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于纳米金催化的共振散射光谱四环素检测方法，通过构建含有已知四环素浓度的检测体系后，荧光光度计进行共振散射光谱信号扫描得到共振散射信号变化量标准曲线，然后将待测对象与超纯水，即对照样分别加入含有四环素适配体和纳米金的混合液，并通过加入氯化钠溶液进行聚集反应，最后与含有硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠的溶液混合，最后经荧光光度计进行共振散射光谱信号扫描得到共振散射信号变化量标准曲线得到待测对象中的四环素浓度。本发明克服核酸适配体需要修饰及检测线不理想等缺陷，相比现有技术具有灵敏、选择性好、成本低且高效的优点。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种食品安全技术领域的方法，具体是一种利用被适配体包裹的纳米金催化产生氧化亚铜增强共振散射光谱检测牛奶中四环素浓度范围为0.0095–2.5μmol/L，最低检测限为9.5nmol/L的四环素的方法。
背景技术
四环素是一种常见的抗生素类药物，但是随着使用量的增加，其在动物性食品和环境中的残留问题引起了广泛的关注。环境中的四环素残留可以增强微生物耐药性甚至超级细菌的滋生，还可通过食物链在动植物中富积；动物性食品中四环素的残留危害表现为慢性毒性危害，但是长时间的摄取可能会导致各种器官的病变甚至某些过敏体质会因此而产生变态反应。所以，建立高灵敏度、高选择性的四环素检测方法显得尤为重要。
传统的四环素检测方法有仪器分析法如高效液相色谱、毛细管电泳、气质联用技术等；免疫分析法如酶联免疫等；微生物抑制法等等。其中仪器分析方法虽然准确可靠，但是实际应用中需要昂贵精密的仪器以及专业的技术操作人员，费时费力，难以满足大规模应用及实时原位检测的需求。免疫分析方法和微生物抑制法虽然成本廉价但是却容易出现假阳性，结果不可靠。
最近研究发现，四环素可以与特定核酸适配体（DNA序列）特异性结合。其相互间的高亲和性可以使其形成稳定的适配体-四环素复合物。同时，许多文献报道DNA容易覆盖在纳米金表现，使纳米金形成稳定的分散体系，被DNA覆盖后的纳米金仍具有很强的催化活性；而裸露的纳米金在高浓度NaCl的作用下会聚集，聚集后的纳米金催化活性很低可以忽略。这为利用四环素适配体和纳米金检测四环素提供了理论依据。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于纳米金催化的共振散射光谱四环素检测方法，克服核酸适配体需要修饰及检测线不理想等缺陷，提供一种灵敏、选择性好、成本低且高效的四环素检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种四环素光敏性的实现方法，通过将四环素适配体和纳米金混合后加入四环素溶液，然后通过加入氯化钠溶液进行聚集反应，最后与含有硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠的溶液混合，使得混合后得到的产物在620nm波长处的共振散射信号的变化量与四环素浓度呈反比例关系。
上述加入四环素溶液后混合液中四环素的浓度范围为：0.0095–2.5μmol/L；
所述的四环素适配体溶液通过以下方式制备得到：将定制合成好的含有1.29nmol四环素适配体的离心管在10000转每分钟的离心机下离心2分钟，然后向离心管中加入258μL超纯水溶解混合均匀，制成5μmol/L的四环素适配体，置于4°C冰箱保存备用。
所述的纳米金溶液是指：向100mL沸腾的0.01wt%的氯金酸中加入3.5mL1.0%的柠檬酸酸三钠溶液，加热煮沸搅拌30分钟，溶液颜色由灰色变为亮红色，停止加热并继续搅拌至冷却，然后用0.2μm超滤膜过滤。所得溶液即为纳米粒径为15nm的纳米金，并置于4°C冰箱保存备用。
所述的氯化钠溶液为500mmol/L，检测时体系添加7μL。
所述的硫酸铜为0.028mol/L，检测时体系添加10μL；氢氧化钠为6.25mol/L检测时体系添加100μL；酒石酸钾钠为1.23mol/L，检测时体系添加200μL；葡萄糖为10mg/mL，检测时体系添加50μL。
本发明涉及一种基于纳米金催化的共振散射光谱四环素检测方法，通过构建含有已知四环素浓度的检测体系后，荧光光度计进行共振散射光谱信号扫描得到共振散射信号变化量标准曲线，然后将待测对象与超纯水，即对照样分别加入含有四环素适配体和纳米金的混合液，并通过加入氯化钠溶液进行聚集反应，最后与含有硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠的溶液混合，最后经荧光光度计进行共振散射光谱信号扫描得到共振散射信号变化量标准曲线得到待测对象中的四环素浓度。
所述的检测体系通过以下步骤制备得到：
1)制备已知浓度的四环素检测体系：取11支包含四环素核酸适配体与纳米金混合液的离心管，在25℃条件下孵育15分钟；然后分别加入5μL不同浓度四环素标准液，使得整个检测体系中的四环素含量维持在0.0095-2.5μmol/L，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育15min；在上述混合液中加入7μL 500mmol/L NaCl溶液充分混合均匀并定容至500μL，留作以下测定用。
2)取一支离心管将四环素标准溶液用5μL超纯水替代，其他按步骤1处理后作为空白对照体系溶液。
3)制备菲林试剂-葡萄糖还原体系：取11支试管，在每支试管中加入10μL 0.028mol/LCuSO4，100μL6.25mol/L NaOH，200μL 1.23mol/L KNaC4H4O6混合均匀，取50μL 10mg/mL葡萄糖加入以上试管中混合均匀；分别将步骤1和步骤2中的标准溶液体系和空白体系转移到以上11支试管中，混合均匀后定容到1000μL，置于60℃恒温孵育器里孵育6分钟。取出后用自来水冷却至室温待用。
所述的共振散射信号变化量标准曲线是指：用荧光光度计对检测体系以620nm条件下同步扫描获得其共振散射信号光谱，将不同浓度的四环素混合液和空白对照液的共振散射光谱信号差值作为纵坐标，四环素混合液的浓度作为横坐标得到标准曲线。
所述的同步扫描进一步优选为采用石英荧光用比色皿盛放检测体系，用荧光光度计以激发光狭缝为5nm，发射光狭缝为2.5nm，激发光和发射光波长均为620nm条件下同步扫描。
本发明的原理在于：被四环素适配体（ssDNA）覆盖的纳米金能均匀分散在溶液中，并具有很强的催化活性；但是当靶物质四环素加入后，适配体由于与四环素具有更强亲和性而使纳米金裸露，形成单个纳米金颗粒，裸露的纳米金颗粒在高浓度NaCl存在时发生聚集；菲林试剂与葡萄糖还原反应在60℃时很能进行，而当加入被四环素覆盖的纳米金后，该反应能迅速形成Cu2O沉淀，该产物能使共振散射信号在620nm处发生显著变化，且共振散射信号变化与四环素浓度呈现反向关系，所以通过分析共振散射信号变化，就可以实现样品中四环素的检测。
技术效果
与现有技术相比，本发明提供的检测方法不需要大型仪器设备，检测灵敏度高，选择性好，操作简单，价格低廉，可用于检测牛奶中的四环素含量是否超标。
附图说明
图1为本发明检测示意图。
图2为不同浓度四环素加入溶液后形成的共振散射光谱图。
图3为检测体系的共振散射信号变化与不同浓度四环素关系。
图4为不同其他物质加入该检测体系后的共振散射信号变化量。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例包括以下步骤：
1)制备已知浓度的四环素检测体系：取11支包含四环素核酸适配体与纳米金混合液的离心管，在25℃条件下孵育15分钟；然后分别加入5μL不同浓度四环素标准液，使得整个检测体系中的四环素含量维持在0.0095-2.5μmol/L，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育15min；在上述混合液中加入7μL500mmol/L NaCl溶液充分混合均匀并定容至500μL，留作以下测定用。
2)取一支离心管将四环素标准溶液用5μL超纯水替代，其他按步骤1处理后作为空白对照体系溶液。
3)制备菲林试剂-葡萄糖还原体系：取11支试管，在每支试管中加入10μL 0.028mol/LCuSO4，100μL 6.25mol/L NaOH，200μL 1.23mol/L KNaC4H4O6混合均匀，取50μL 10mg/mL葡萄糖加入以上试管中混合均匀；分别将步骤1和步骤2中的标准溶液体系和空白体系转移到以上11支试管中，混合均匀后定容到1000μL，置于60℃恒温孵育器里孵育6分钟。取出后用自来水冷却至室温待用。
4)共振散射值测定：分别取500μL步骤3)制备的标准溶液和空白对照液，置于石英荧光用比色皿(内径为0.5cm×0.5cm，外径为1.0cm×1.0cm)中，用荧光光度计进行扫描测定信号。具体的扫描条件为：激发光狭缝为5nm，发射光狭缝为2.5nm，激发光和发射光波长均为620nm条件下同步扫描，获得其共振散射信号光谱。四环素和空白对照液的共振散射光谱信号分别为I和I0，计算ΔI=I-I0。
5)标准曲线绘制：以不同浓度四环素与对应的共振散射信号变化量ΔI作图，绘制标准曲线，其回归方程为：ΔI620nm=1.7986CTET+99.575。
6)制备样品检测体系：取5μL待测溶液，按步骤1-3制样，按步骤4)方法测定其ΔI。
7)根据样品测得的ΔI，查标准曲线，可以求得样品中四环素含量。
8)验证：用本方法测定3份含四环素浓度分别为20nmol/L、50nmol/L和100nmol/L的纯净牛奶样品各一份，得到的回收率为105%-107%，证明了本方法的可靠性。
9)本方法测定牛奶中四环素的浓度范围为0.0095–2.5μmol/L，最低检测限为9.5nmol/L。
Claims (10)
1.一种四环素光敏性的实现方法，其特征在于，通过将四环素适配体和纳米金混合后加入四环素溶液，然后通过加入氯化钠溶液进行聚集反应，最后与含有硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠的溶液混合，使得混合后得到的产物在620nm波长处的共振散射信号的变化量与四环素浓度呈反比例关系。
2.根据权利要求1所述的方法，去特征是，加入四环素溶液后混合液中四环素的浓度范围为：0.0095–2.5μmol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，去特征是，所述的四环素适配体溶液通过以下方式制备得到：将定制合成好的含有1.29nmol四环素适配体的离心管在10000转每分钟的离心机下离心2分钟，然后向离心管中加入258μL超纯水溶解混合均匀，制成5μmol/L的四环素适配体，置于4°C冰箱保存备用。
4.根据权利要求1所述的方法，去特征是，所述的纳米金溶液是指：向100mL沸腾的0.01wt%的氯金酸中加入3.5mL1.0%的柠檬酸酸三钠溶液，加热煮沸搅拌30分钟，溶液颜色由灰色变为亮红色，停止加热并继续搅拌至冷却，然后用0.2μm超滤膜过滤，所得溶液即为纳米粒径为15nm的纳米金，并置于4°C冰箱保存备用。
5.根据权利要求1所述的方法，去特征是，所述的氯化钠溶液为500mmol/L，检测时体系添加7μL。
6.根据权利要求1所述的方法，去特征是，所述的硫酸铜为0.028mol/L，检测时体系添加10μL；氢氧化钠为6.25mol/L检测时体系添加100μL；酒石酸钾钠为1.23mol/L，检测时体系添加200μL；葡萄糖为10mg/mL，检测时体系添加50μL。
7.一种基于纳米金催化的共振散射光谱四环素检测方法，其特征在于，通过构建含有已知四环素浓度的检测体系后，荧光光度计进行共振散射光谱信号扫描得到共振散射信号变化量标准曲线，然后将待测对象与超纯水，即对照样分别加入含有四环素适配体和纳米金的混合液，并通过加入氯化钠溶液进行聚集反应，最后与含有硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠的溶液混合，最后经荧光光度计进行共振散射光谱信号扫描得到共振散射信号变化量标准曲线得到待测对象中的四环素浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是，所述的检测体系通过以下步骤制备得到：
1)制备已知浓度的四环素检测体系：取11支包含四环素核酸适配体与纳米金混合液的离心管，在25℃条件下孵育15分钟；然后分别加入5μL不同浓度四环素标准液，使得整个检测体系中的四环素含量维持在0.01–2.5μmol/L，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育15min；在上述混合液中加入7μL500mmol/L NaCl溶液充分混合均匀并定容至500μL，留作以下测定用；
2)取一支离心管将四环素标准溶液用5μL超纯水替代，其他按步骤1处理后作为空白对照体系溶液；
3)制备菲林试剂-葡萄糖还原体系：取11支试管，在每支试管中加入10μL 0.028mol/LCuSO4，100μL 6.25mol/L NaOH，200μL 1.23mol/L KNaC4H4O6混合均匀，取50μL 10mg/mL葡萄糖加入以上试管中混合均匀；分别将步骤1和步骤2中的标准溶液体系和空白体系转移到以上11支试管中，混合均匀后定容到1000μL，置于60℃恒温孵育器里孵育6分钟，取出后用自来水冷却至室温待用。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征是，所述的共振散射信号变化量标准曲线是指：用荧光光度计对检测体系以620nm条件下同步扫描获得其共振散射信号光谱，将不同浓度的四环素混合液和空白对照液的共振散射光谱信号差值作为纵坐标，四环素混合液的浓度作为横坐标得到标准曲线。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征是，所述的同步扫描进采用石英荧光用比色皿盛放检测体系，用荧光光度计以激发光狭缝为5nm，发射光狭缝为2.5nm，激发光和发射光波长均为620nm条件下同步扫描。
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