CN103837516A - 一种基于金纳米团簇荧光探棒快速检测葡萄糖浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于金纳米团簇荧光探棒快速检测葡萄糖浓度的方法，以牛血清蛋白功能化的金纳米团簇为葡萄糖荧光检测探针，利用共振光散射技术来检测葡萄糖的浓度。本发明相对于色谱法及分光光度法使用的仪器成本较低；此荧光探测制备的原料均具有较高的稳定性，相对于生物传感器法检测的稳定性较差的缺点有很大的改进。本发明的荧光检测探针灵敏度高、选择性好、检测限低；所用试剂均无毒副作用；本发明方法简单、快速、易操作，不需要大型仪器。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料应用技术领域，具体涉及一种基于金纳米团簇荧光探棒对血样中葡萄糖浓度的灵敏检测方法。
背景技术
葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，是活细胞的能量来源和新陈代谢的中间产物，在食品分析和临床诊断中有着非常重要的作用。目前，已有的检测葡萄糖的方法很多，各有利弊。
在所有的葡萄糖的检测方法中，应用最广的是高效液相色谱法，该方法中的离子色谱法在近年发展非常快。采用气相色谱法分析葡萄糖需经过硅醚化处理，操作比较复杂。采用分光光度法分析需加入显色剂。此外，色谱法及分光光度法使用的仪器成本较高且需要专业的实验员进行操作，不适宜发展中国家及偏远地区的普遍使用。鉴于葡萄糖结构的复杂性，旋光度法适宜作为一种辅助的检测方法；生物传感器法具有线性检测范围宽、灵敏度高等优点，且成本较低，有很好的应用前景，但由于其重现性较差且稳定性不高，在葡萄糖的实际检测中应用较少。
色谱法及分光光度法使用的仪器成本较高，且需专业人员操作；旋光度法只能作为一种辅助手段定性的检测葡萄糖的简单结构；生物传感器法检测需建微流管道并且受环境（温度、湿度、气压等）影响较大，稳定性差。
因此亟需一种可以快速、有效检测葡萄糖浓度的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提供一种快速检测血清中低浓度葡萄糖浓度的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于金纳米团簇荧光探棒快速检测葡萄糖浓度的方法，包括以下步骤：
（1）合成牛血清蛋白功能化的金纳米团簇：
将牛血清蛋配置成50mg/mL 的溶液备用，将氯金酸配置成10mmol/L的溶液避光保存备用，取已配好的牛血清蛋白溶液10mL与氯金酸溶液10mL在避光的条件混合，在温度为37℃的水浴中剧烈搅拌2～3min，随后加入1mol/L的1mL氢氧化钠溶液，避光恒温反应12h，溶液颜色从淡黄色变为浅棕色，最后变为深棕色，得到牛血清蛋白功能化的金纳米团簇水溶液，稀释至50mL，将溶液在4℃的条件下保存备用；
（2）检测牛血清蛋白功能化的金纳米团簇的LS强度：
将所述牛血清蛋白功能化的金纳米团簇按质量比1:5的比例配成水溶液，取3mL加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型荧光分光光度计上以λem =400nm进行同步扫描激发和发射单色器获得溶液的LS强度，测定时保持电压为400V，狭缝宽度为10nm；
（3）共振光散射法检测葡萄糖浓度：
将60μL的待测溶液和0.6mg/mL 140μL葡萄糖氧化酶在37℃下混合培养10分钟，加入到2.8mL的金纳米团簇溶液，混合均匀加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型荧光分光光度计上以λem =400nm进行同步扫描激发和发射单色器获得溶液的LS强度，测定时保持电压为400V，狭缝宽度为10nm；根据线性回归方程为可以获得待测溶液的葡萄糖浓度。
所述待测溶液为非血清溶液时，线性回归方程为F = 44.5c +82.467，待测溶液为血清溶液时，线性回归方程为F = 52.027c +97.23，其中F 表示待测溶液加入金纳米团簇溶液后在400nm 处的光散射增加强度，c表示待测溶液中葡萄糖的浓度。
本方法不仅可以通过利用共振光散射技术来检测葡萄糖的浓度，且可以通过肉眼大概比较出葡萄糖的浓度高低，相对于色谱法及分光光度法使用的仪器成本较低；此共振光探测制备的原料均具有较高的稳定性，相对于生物传感器法检测的稳定性较差的缺点有很大的改进。
本发明优点：（1）由于此荧光探针制备的原料均具有较高的稳定性，因此本检测方法所使用的金纳米团簇易于制备和保存，在4℃且避光条件下可保存数月。（2）本发明检测方法提供的荧光检测探针灵敏度高、选择性好、检测限低。（3）本发明和检测过程中所用试剂均无毒副作用。（4）本发明方法简单、快速、易操作。将已知浓度的葡萄糖溶液和过量的葡萄糖氧化酶加入到荧光探针，通过检测其共振光散射强度的变化，得出光散射强度与葡萄糖浓度的标准工作曲线。然后在同样的条件下，就可以通过测定未知浓度的葡萄糖和过量的葡萄糖氧化酶加入到该荧光探针后的光散射强度，就可以从标准工作曲线上查出葡萄糖的浓度。
附图说明
图1 牛血清蛋白（BSA）为模板功能化的荧光金纳米团簇的激发和发射波长。
图2 金纳米团簇的高分辨率透射电镜图。
图3 不同浓度的葡萄糖对BSA-Au NCs光散射强度的影响。
图4 葡萄糖的浓度和光散射强度的线性关系。
图5 血清中葡萄糖的浓度和BSA-Au NCs光散射的强度的线性关系。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
葡萄糖荧光检测探针为牛血清蛋白（BSA）为模板功能化的荧光金纳米团簇。
（1）牛血清蛋白功能化的金纳米团簇（BSA-Au NCs）荧光探针的合成：
将牛血清蛋（BSA）配置成50mg/mL 的溶液备用，将氯金酸(HAuCl4)配置成10mmol/L的溶液避光保存备用。取已配好的牛血清蛋白溶液10mL与氯金酸溶液10mL在避光的条件混合，在温度为37℃的水浴中剧烈搅拌2～3min。随后加入1mL氢氧化钠溶液(1mol/L),避光恒温反应12小时。溶液颜色从淡黄色变为浅棕色,最后变为深棕色(图1)，得到牛血清蛋白功能化的金纳米团簇水溶液，稀释至50mL，其浓度为2.0mmol/L (以金原子的数量计算)，将溶液在4℃的条件下保存备用。在紫外灯（波长为365nm）照射下，牛血清蛋白功能化的荧光金纳米团簇的水溶液发红光。在波长为430nm处激发，在620nm处得到最大发射峰，图2为牛血清蛋白功能化的金纳米团簇的高分辨率透射电镜图，从图中可以看出其粒径大小在1nm左右。
（2）检测牛血清蛋白功能化的金纳米团簇的LS强度：
由于光散射与介质的不均匀性密切相关，除了真空之外的其它所有介质都有一定程度的不均匀性，所以，在自然界中光散射现象普遍地存在。因此，可以利用共振光散射技术对不同浓度的葡萄糖和牛血清蛋白功能化的金纳米团簇混合后的共振光散射强度变化进行测试。且经实验表明，利用共振光散射技术对葡萄糖浓度的检测的灵敏度更高。
共振光散射法检测血清中的葡萄糖是利用葡萄糖在葡糖糖氧化酶参与下催化生成的双氧水对金簇探针的氧化，导致其光散射强度变化的原理设计的。在进行分析时一般采用标准工作曲线法。首先将上述牛血清蛋白功能化的金纳米团簇按质量比1:5的比例配成水溶液，取3mL加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型荧光分光光度计上以(λem =λex) 进行同步扫描激发和发射单色器，测定时保持电压为400V, 狭缝宽度为10nm，最大散射波长在400nm处获得LS强度，记录为曲线a（图3）。
（3）共振光散射法检测非血清溶液中的葡萄糖浓度：
随后取出比色管洗净，将60μL的不同浓度的葡萄糖溶液和140μL葡萄糖氧化酶（0.6mg/mL）在37℃下混合培养10分钟，加入到2.8mL的金纳米团簇溶液溶液，混合均匀加入比色管中，在LS-50B型荧光分光光度计上以相同方法获得LS光谱（曲线b-j）。如图3所示，在一定范围内,而当加入的葡萄糖的浓度逐渐增大时,光散射强度出现明显增强。图4所示葡萄糖的浓度在0.5μM至7μM的范围时葡萄糖的浓度和光散射强度有一个良好关系，由此可得到葡萄糖的浓度和光散射强度之间的线性回归方程，该方程为：F = 44.5c +82.467，其中F 表示加入葡萄糖后BSA-Au NCs 在400nm 处的光散射增加强度，c表示葡萄糖的浓度。最低检测限可以达到0.1μM。
将60μL的待测溶液和0.6mg/mL 140μL葡萄糖氧化酶在37℃下混合培养10分钟，加入到2.8mL的金纳米团簇溶液，混合均匀加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型荧光分光光度计上以λem =400nm进行同步扫描激发和发射单色器获得溶液的LS强度，测定时保持电压为400V，狭缝宽度为10nm；根据线性回归方程为可以获得待测溶液的葡萄糖浓度。
（4）共振光散射法检测血清中的葡萄糖浓度：
根据同样的步骤，通过加标法，利用金纳米团簇合成的葡萄糖荧光检测探针对血清中的葡萄糖的浓度与光散射的强度之间的关系进行了实验，测试结果如图5所示，其线性回归方程为：F = 52.027c +97.23，线性拟合R值达到0.9966。
将60μL的血清溶液和0.6mg/mL 140μL葡萄糖氧化酶在37℃下混合培养10分钟，加入到2.8mL的金纳米团簇溶液，混合均匀加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型荧光分光光度计上以λem =400nm进行同步扫描激发和发射单色器获得溶液的LS强度，测定时保持电压为400V，狭缝宽度为10nm；根据线性回归方程为可以获得血清溶液的葡萄糖浓度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但实施例和附图并不是用来限定本发明，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，自当可作各种变化或润饰，但同样在本发明的保护范围之内。因此本发明的保护范围应当以本申请的权利要求保护范围所界定的为准。
Claims (2)
1.一种基于金纳米团簇荧光探棒快速检测葡萄糖浓度的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）合成牛血清蛋白功能化的金纳米团簇：
将牛血清蛋配置成50mg/mL 的溶液备用，将氯金酸配置成10mmol/L的溶液避光保存备用，取已配好的牛血清蛋白溶液10mL与氯金酸溶液10mL在避光的条件混合，在温度为37℃的水浴中剧烈搅拌2～3min，随后加入1mol/L的1mL氢氧化钠溶液，避光恒温反应12h，溶液颜色从淡黄色变为浅棕色，最后变为深棕色，得到牛血清蛋白功能化的金纳米团簇水溶液，稀释至50mL，将溶液在4℃的条件下保存备用；
（2）检测牛血清蛋白功能化的金纳米团簇的LS强度：
将所述牛血清蛋白功能化的金纳米团簇按质量比1:5的比例配成水溶液，取3mL加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型荧光分光光度计上以λem =400nm进行同步扫描激发和发射单色器获得溶液的LS强度，测定时保持电压为400V，狭缝宽度为10nm；
（3）共振光散射法检测葡萄糖浓度：
将60μL的待测溶液和0.6mg/mL 140μL葡萄糖氧化酶在37℃下混合培养10分钟，加入到2.8mL的金纳米团簇溶液，混合均匀加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型荧光分光光度计上以λem =400nm进行同步扫描激发和发射单色器获得溶液的LS强度，测定时保持电压为400V，狭缝宽度为10nm；根据线性回归方程为可以获得待测溶液的葡萄糖浓度。
2.根据权利要求1所述的基于金纳米团簇荧光探棒快速检测葡萄糖的方法，其特征在于：所述待测溶液为非血清溶液时，线性回归方程为F = 44.5c +82.467，待测溶液为血清溶液时，线性回归方程为F = 52.027c +97.23，其中F 表示待测溶液加入金纳米团簇溶液后在400nm 处的光散射增加强度，c表示待测溶液中葡萄糖的浓度。
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