CN113125397A - 一种汞离子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种汞离子的检测方法。该方法包括S1、采用所述共同激发波长激发SG I和NMM分别获得两者的发射峰520nm和615nm;S2、将不同已知浓度的Hg2+分别加入缓冲液中得到多组第一混合液;分别向每组所述第一混合液中添加NMM,SG I和KCl得到多组第二混合液;S3、得到每组所述第二混合液在发射峰520nm和615nm对应的荧光强度的比值R,得到Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的对应关系;S4、根据待测液的荧光光谱图,结合所述Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的关系,得到所述待测液中Hg2+的浓度。该方法能够实现精准又不受其他离子干扰,且检测限低的检测汞离子。
Description
技术领域
本发明涉及汞离子浓度的检测分析技术领域,尤其涉及一种汞离子的检测方法。
背景技术
众所周知,汞离子(Hg2+)是一种有毒重金属离子。由于Hg2+与巯基具有较高的亲和力,可以通过形成Hg-S键使一些关键酶和蛋白质失活,从而对人类健康造成严重损害,如引起耳聋、视力丧失和运动、认知障碍等。同时,Hg2+具有生物累积效应,可通过食物链在人体中富集。因此,即使在低浓度下,它也对人类健康有害。世界卫生组织(WHO)规定的饮用水中最高允许Hg2+含量为30nM。因此,开发一种简单、灵敏、选择性的Hg2+检测方法是非常重要和迫切的。
传统方法主要依靠原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、X射线荧光光谱法(R-FS)、冷蒸气原子荧光光谱法(CVAF)和高效液相色谱法(HPLC)等,但这些方法通常需要昂贵的设备和专业的操作人员。寡核苷酸DNA生物传感器由于成本低、稳定性高、易于修饰等优点,引起人们的广发关注。然而,这类方法大多只依赖于单个荧光信号的变化(引起信号上升或下降),通常会受到环境条件波动的影响,从而导致检测的稳定性和可靠性较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:如何实现精准又不受其他离子干扰,且检测限低的检测汞离子。
本发明提出一种汞离子的检测方法,包括以下步骤:
S1、利用荧光分光光度计扫描SG I和NMM的激发光谱,获得SG I和NMM的共同激发波长,采用所述共同激发波长激发SG I和NMM分别获得两者的发射峰520nm和615nm;
S2、将不同已知浓度的Hg2+分别加入至含有DNA序列P1和P2的缓冲液中得到多组第一混合液;分别向每组所述第一混合液中添加NMM,SG I和KCl得到多组第二混合液;其中,P1序列为:5’-AGGGTTTTGGGTTTTGGGTTTTGGGA-3’,P2序列为:5’-ACCCTTTTCCCTTTTCCCTTTTCCCT-3’;
S3、获取每组所述第二混合液的荧光光谱图,得到每组所述第二混合液在发射峰520nm和615nm对应的荧光强度的比值R,得到Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的对应关系;其中,R0为Hg2+的浓度为0时,所述第二混合液在发射峰520nm和615nm处的荧光强度的比值;
S4、根据待测液的荧光光谱图,结合所述Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的关系,得到所述待测液中Hg2+的浓度。
进一步地,得到所述待测液中Hg2+的浓度进一步包括:
S41、将所述待测液加入至含有DNA序列P1和P2的缓冲液中得到第三混合液;
S42、向所述第三混合液中添加NMM,SG I和KCl得到第四混合液;
S43、获得待测液的荧光光谱图,得到所述待测液在发射峰520nm和615nm处的荧光比值R1,结合所述待测液的荧光信号变化R1/R0和所述Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的关系,得到所述待测液中Hg2+的浓度。
进一步地,在步骤S3中,所述Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的关系为Y=2.161X-0.3456,Y为R/R0,X为Hg2+的浓度。
进一步地,在步骤S1中,所述共同激发波长在380nm-400nm之间。
进一步地,在步骤S1中,所述共同激发波长为395nm。
进一步地,在步骤S3中,还包括用酶标仪来记录发射峰520nm和615nm处的荧光信号的变化。
进一步地,在步骤S41中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液,所述磷酸盐缓冲液中,磷酸盐的浓度为20mM,P1和P2的浓度为200nM。
进一步地,在步骤S42中,添加7μM以上的NMM,添加3.92μM以上的SG I至所述第四混合液中。
进一步地,在步骤S41中,将所述待测液加入至含有DNA序列P1和P2的缓冲液中,并在37℃下反应2-3h得到多组所述第三混合液。
进一步地,在步骤S42中,向所述第三混合液中添加NMM,SG I和KCl,并在37℃下反应30min以上得到所述第四混合液。
为解决上述技术问题,本发明提出了一种汞离子的检测方法。
本发明与现有技术对比的有益效果包括:利用荧光分光光度计扫描SG I和NMM的激发光谱,获得SG I和NMM的共同激发波长,采用所述共同激发波长激发SG I和NMM分别获得两者的发射峰520nm和615nm,相同的激发波长可同时检测出SG I和NMM,从而可在后续荧光光谱图中检测到相应浓度的SG I和NMM,在此基础上,将不同已知浓度的Hg2+分别加入至含有DNA序列P1和P2的缓冲液中得到多组第一混合液,Hg2+存在时,P1和P2可以通过T-Hg-T错配,实现完全互补配对;分别向每组所述第一混合液中添加NMM,SG I和KCl得到多组第二混合液,T-Hg-T错配后可与SG I结合,在520nm处有较强的荧光强度,并且P1不能形成G-四聚体结构,不能与NMM结合,从而在615nm处的荧光强度减弱,之后获取每组所述第二混合液的荧光光谱图,得到每组所述第二混合液在发射峰520nm和615nm对应的荧光强度的比值R,进而可得到Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的对应关系;其中,R0为Hg2+的浓度为0时,所述第二混合液在发射峰520nm和615nm处的荧光强度的比值,根据待测液的荧光光谱图,结合所述Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的关系,得到所述待测液中Hg2+的浓度;通过双峰的荧光强度的比值确定Hg2+的浓度,并排除了单独的SG I和NMM本身的荧光强度的干扰,不受环境条件波动影响,检测结果精准可靠,而且该方法也不受其他干扰离子的影响对汞离子具有选择性,该方法的最低检测限为9.34nM,该方法能够实现精准又不受其他离子干扰,且检测限低的检测汞离子。
附图说明
通过参考附图会更加清楚的理解本发明的特征和优点,附图是示意性的而不应理解为对本发明进行任何限制,在附图中:
图1为本发明提出的汞离子检测方法的原理图。
图2为SGⅠ和NMM的荧光激发光谱和不同处理条件下的荧光光谱;图2A为SGⅠ的荧光激发光谱;图2B为SGⅠ和NMM不同处理条件下的荧光光谱。
图3为实施例1中检测到的相关荧光信号变化和荧光强度结果图;其中,图3A为不同激发波长下的荧光信号信号变化;图3B为615nm处不同NMM浓度的荧光强度;图3C为520nm处不同SGⅠ浓度的荧光强度;图3D为615nm处不同反应时间下的NMM的荧光强度。
图4为荧光光谱图和荧光信号变化图;图4A为不同Hg2+浓度下的荧光光谱图;图4B为不同Hg2+浓度下的荧光信号变化图。
图5为Hg2+的选择性分析结果图。
具体实施方式
本具体实施方式提出一种汞离子的检测方法,包括以下步骤:
S1、利用荧光分光光度计扫描SG I和NMM的激发光谱,获得SG I和NMM的共同激发波长在380nm-400nm之间,采用所述共同激发波长激发SG I和NMM分别获得两者的发射峰520nm和615nm;所述共同激发波长优选为395nm;
S2、将不同已知浓度的Hg2+分别加入至含有DNA序列P1和P2的缓冲液中,并在37℃下反应2-3h得到多组第一混合液;分别向每组所述第一混合液中添加NMM,SG I和KCl得到多组第二混合液;其中,P1序列为:5’-AGGGTTTTGGGTTTTGGGTTTTGGGA-3’,P2序列为:5’-ACCCTTTTCCCTTTTCCCTTTTCCCT-3’;
S3、获取每组所述第二混合液的荧光光谱图,并用酶标仪来记录发射峰520nm和615nm处的荧光信号的变化,得到每组所述第二混合液在发射峰520nm和615nm对应的荧光强度的比值R,得到Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的对应关系Y=2.161X-0.3456,Y为R/R0,X为Hg2+的浓度;其中,R0为Hg2+的浓度为0时,所述第二混合液在发射峰520nm和615nm处的荧光强度的比值;
S4、根据待测液的荧光光谱图,结合所述Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的关系,得到所述待测液中Hg2+的浓度。
得到所述待测液中Hg2+的浓度进一步包括:
S41、将所述待测液加入至含有DNA序列200nM P1和200nM P2的磷酸盐缓冲液中,并在37℃下反应2-3h得到第三混合液;其中,磷酸盐的浓度为20mM;
S42、向所述第三混合液中添加7μM以上的NMM,3.92μM以上的SG I和KCl,并在37℃下反应30min以上得到第四混合液;
S43、获得待测液的荧光光谱图,得到所述待测液在发射峰520nm和615nm处的荧光比值R1,结合所述待测液的荧光信号变化R1/R0和所述Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的关系,得到所述待测液中Hg2+的浓度。
本发明的发明原理结合图1,具体如下:
我们设计了两条DNA链,P1和P2,其中,P1序列为:5’-AGGGTTTTGGGTTTTGGGTTTTGGGA-3’,P2序列为:5’-ACCCTTTTCCCTTTTCCCTTTTCCCT-3’。P1为G-四聚体DNA,P2为P1的不完全互补序列。当Hg2+不存在时,游离的P1可以自发形成G4结构,然后和NMM结合,在615nm处产生强烈荧光。当Hg2+存在时,P1和P2可以通过T-Hg-T错配,实现完全互补配对,从而导致P1不能形成G-四聚体结构,此时加入SGⅠ,在520nm处产生强烈荧光,而NMM在615nm处的荧光强度降低。随着Hg2+浓度的增加,520nm处的荧光强度逐渐增大,与此同时615nm处的荧光强度随之减小,通过计算荧光信号变化(R/R0)(其中R是在Hg2+存在时发射峰520nm和615nm对应的荧光强度的比值;R0是不存在Hg2+的情况下发射峰520nm和615nm对应的荧光强度的比值,从而达到检测Hg2+的目的。
需要说明的是,本发明中,NMM为N-甲基卟啉二丙酸IX的缩写,SG I为Sybr GreenⅠ的缩写;1×SG I表示SG I的浓度为1.96μM,2×SG I表示SG I的浓度为3.92μM;磷酸盐缓冲液(20mM,pH 7.5)是指磷酸二氢钠(NaH2PO4)和磷酸氢二钠(Na2HPO4)组成的缓冲液,两种成分混合后,磷酸根的浓度为20mM,pH为7.5。
下面结合附图来具体描述本发明的优选实施例,其中,附图构成本申请一部分,并与本发明的实施例一起用于阐释本发明的原理,并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例主要包括以下步骤:
利用荧光分光光度计扫描SG I和NMM的激发光谱;利用酶标仪研究方法的可行性;优化激发波长;探索SG I和NMM的最佳添加浓度;探索T-Hg-T的最佳结合反应时间;检测方法的灵敏度和线性检测范围;检测方法的选择性;对水中的Hg2+进行检测。
(1)SG I和NMM的激发光谱扫描及可行性试验;
首先,我们对SG I和NMM进行了激发光谱扫描,准备两组样品。分别为200nM P1+20mM KCl+3μM NMM和200nM P1+200nM P2+3μM Hg2++1×SG I。每组样品中DNA P1+DNA P2+Hg2+混合液在磷酸盐缓冲液(20mM,pH 7.5),37℃反应2h,使其充分反应;然后加入KCl,NMM及SG I,混合均匀,37℃反应30min。最后,每组样品取200μL加入到光径为4mm的微量比色皿中,利用荧光分光光度计分别扫描NMM和SG I的激发光谱。结果如图2A所示:NMM的最大激发波长为399nm;SG I有两个激发波峰,分别为强的497nm和弱的380nm。由于380nm和399nm比较近,因此,SG I和NMM可能被一个激发波长激发。然后,我们选取中间波长390nm进行可行性验证。准备两组样品,分别为:200nM P1+200nM P2+20mM KCl+1×SG I+3μM NMM,200nMP1+200nM P2+3μM Hg2++20mM KCl+1×SG I+3μM NMM。每组样品取200μL加入到96孔酶标板中,用酶标仪记录荧光信号变化。结果如图2B所示,在没有Hg2+的情况下,在520nm和615nm处获得了两个发射峰,分别对应于SG I和NMM。在Hg2+的存在下,因为G-四聚体会通过T-Hg-T错配转变为dsDNA结构,所以SG I的荧光升高,NMM的荧光减少。这些结果与原理一致。因此,SGI的弱激发峰可以用来开发Hg2+比率型生物传感器。此实验结果表明我们设计的新方法是可行的。
(2)反应条件的优化;
根据方法的原理可知,激发波长是非常关键的一个因素。因此,我们首先对激发波长进行了优化。我们比较了380-400nm之间不同激发波长下Hg2+存在与否的样品的荧光信号变化(R/R0)。准备两组样品。分别为:200nM P1+200nM P2+20mM KCl+3μM NMM+1×SG I;200nM P1+200nM P2+20mM KCl+3μM NMM+1×SG I+3μM Hg2+。每个处理样品取200μL加入到96孔酶标板中,利用酶标仪记录样品在520nm和615nm处的荧光强度,并计算荧光信号变化R/R0。有趣的是,如图3A所示,最高的变化出现在395nm,偏于NMM的激发波长,而不是中间波长390nm。原因可能是SG I的荧光强度比NMM要强。因此,395nm被用于后续的实验。
随后,对NMM和SG I的浓度进行了优化。在没有Hg2+的情况下,加入不同浓度的NMM、200nM P1、200nM P2、20mM KCl到磷酸盐缓冲液中(20mM,pH 7.5),充分混匀,37℃反应30min。用酶标仪来记录615nm处信号的变化。如图3B所示,结果表明,NMM浓度在0-2μM时荧光随着浓度的增大增加非常快。当继续添加NMM时,荧光增加非常缓慢。加入7μM NMM后,荧光不再增加。因此,我们使用了7μM的NMM来进行后续试验。在过量的Hg2+(3μM)的情况下,加入200nM P1、200nM P2到磷酸盐缓冲液中(20mM,pH 7.5),充分混匀,37℃反应2h,在其他实施例中也可以反应更久一点,例如3h。然后加入不同浓度的SG I,充分混匀,37℃反应30min,对SG I进行优化。最后用酶标仪记录520nm处信号变化。采用同样的方法得到SG I的最优浓度,如图3C所示,结果表明,在2×SG I中可以获得最高的荧光。因此,采用了2×SG I进行后续试验,以确保其与dsDNA的反应的完成。
形成T-Hg-T的反应时间是另一个重要的优化参数,通过加入200nM P1、200nM P2、3μM Hg2+到磷酸盐缓冲液中(20mM,pH 7.5),充分混匀,37℃分别反应不同的时间,然后添加7μM NMM,20mM KCl到混合液中,充分混匀,反应30min,最后用酶标仪记录615nm处G-四聚体/NMM的信号变化来获得的。如图3D所示,结果表明,随着反应时间从0增加到30min,荧光强度逐渐降低。然后,信号稳定,表明反应完成。因此,选择30min作为该方法的最佳时间。
(3)方法的灵敏度和线性检测范围
首先,我们把不同浓度的Hg2+加入到含有100nM P1、100nM P2的磷酸盐缓冲液中(20mM,pH 7.5),充分混匀,37℃反应30min。然后,把7μM NMM,2×SG I和20mM KCl加入到上述的混合液中,充分混匀,37℃反应30min。最后,用酶标仪记录光谱变化,并计算Hg2+浓度和荧光信号变化(R/R0)的关系。在其他实施例中,NMM的浓度也可以大于7μM,例如10μM。
结果如图4所示,在Hg2+浓度较低时,荧光信号随着Hg2+浓度的增加而增加,但是当Hg2+浓度增加到2.5μM时,荧光信号增加变得比较缓慢,达到一个平台期。随后我们对低浓度Hg2+的信号变化做了分析,发现Hg2+在0.7μM-2.5μM范围内,Hg2+浓度和荧光信号变化(R/R0)呈线性关系。线性方程为Y=2.161X-0.3456(R2=0.995),Y为R/R0,X为汞离子的浓度。根据3倍空白误差/斜率,我们计算得出该方法的最低检测限为9.34nM。
(4)该方法对Hg2+的选择性
首先,我们把2μM的Hg2+和2μM的干扰物质(Mn2+、Ba2+、Ni2+、Na+、Ag+、Cd2+、Fe3+、Pb+、Mg2+、Co2+、Ca2+、Cr3+、Cu2+、Zn2+)分别加入到含有100nM P1、100nM P2的20mM的磷酸盐缓冲液中(20mM,pH 7.5),充分混匀,37℃反应30min。然后,把20mM KCl、7μM NMM和2×SG I加入到上述的混合液中,充分混匀,37℃反应30min。最后,用酶标仪记录荧光信号变化(R/R0)。在其他实施例中也可以37℃下反应时间可以大于30min,例如40min等。
结果如图5所示,我们的新方法除了对Hg2+有强烈的响应外,加入其他物质荧光信号几乎没有变化。说明我们的方法对Hg2+具有很好的选择性。
(5)对自然水体环境样品中的Hg2+进行检测
采用标准添加法,制备不同Hg2+浓度的水样(0.7、1.0、1.5和2.5μM)。然后,用我们的新方法测量,最后,通过线性方程Y=2.161X-0.3456计算样品中Hg2+的水平。
结果如表1所示,我们方法的回收率在92.8%-100.2%之间,可以用于实际样品的检测。
表1水中Hg2+的添加与回收实验
样品 | 添加Hg<sup>2+</sup>(μM) | 检测结果(μM) | 回收率/% |
1 | 0.7 | 0.675±0.17 | 96.43 |
2 | 1 | 1.002±0.21 | 100.20 |
3 | 1.5 | 1.545±0.23 | 102.99 |
4 | 2.5 | 2.320±0.22 | 92.80 |
其他有益效果:
本发明操作简单、无需进行荧光标记且可应用于实际样品的检测,为检测水中Hg2+提供了一种新的方法。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种汞离子的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、获取SG I和NMM的激发光谱,得到SG I和NMM的共同激发波长,采用所述共同激发波长激发SG I和NMM分别获得两者的发射峰520nm和615nm;
S2、将不同已知浓度的Hg2+分别加入至含有DNA序列P1和P2的缓冲液中得到多组第一混合液;分别向每组所述第一混合液中添加NMM,SG I和KCl得到多组第二混合液;其中,P1序列为:5’-AGGGTTTTGGGTTTTGGGTTTTGGGA-3’,P2序列为:5’-ACCCTTTTCCCTTTTCCCTTTTCCCT-3’;
S3、获取每组所述第二混合液的荧光光谱图,得到每组所述第二混合液在发射峰520nm和615nm对应的荧光强度的比值R,得到Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的对应关系;其中,R0为Hg2+的浓度为0时,所述第二混合液在发射峰520nm和615nm处的荧光强度的比值;
S4、根据待测液的荧光光谱图,结合所述Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的关系,得到所述待测液中Hg2+的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,得到所述待测液中Hg2+的浓度进一步包括:
S41、将所述待测液加入至含有DNA序列P1和P2的缓冲液中得到第三混合液;
S42、向所述第三混合液中添加NMM,SG I和KCl得到第四混合液;
S43、获得待测液的荧光光谱图,得到所述待测液在发射峰520nm和615nm处的荧光比值R1,结合所述待测液的荧光信号变化R1/R0和所述Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的关系,得到所述待测液中Hg2+的浓度。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,在步骤S3中,所述Hg2+的浓度与荧光信号变化R/R0的关系为Y=2.161X-0.3456,Y为R/R0,X为Hg2+的浓度。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,在步骤S1中,所述共同激发波长在380nm-400nm之间。
5.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于,在步骤S1中,所述共同激发波长为395nm。
6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,在步骤S3中,还包括用酶标仪来记录发射峰520nm和615nm处的荧光信号的变化。
7.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,在步骤S41中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液,所述磷酸盐缓冲液中,磷酸盐的浓度为20mM,P1和P2的浓度为200nM。
8.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,在步骤S42中,添加7μM以上的NMM,添加3.92μM以上的SG I至所述第四混合液中。
9.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,在步骤S41中,将所述待测液加入至含有DNA序列P1和P2的缓冲液中,并在37℃下反应2-3h得到多组所述第三混合液。
10.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,在步骤S42中,向所述第三混合液中添加NMM,SG I和KCl,并在37℃下反应30min以上得到所述第四混合液。
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