CN101865843B - 多组分生物标识物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时检测多组分生物标识物的方法。所述同时检测多组分生物标识物的方法包括获取生物标识物、加入探针分子、进样检测三个步骤。与传统的生物标识物的检测方法相比，本发明具有多组分同时检测、样品消耗量低、成本低、检测快、无需复杂的样品分离过程、准确度以及灵敏度高的优点。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物分子检测领域，尤其是涉及一种多组分生物标识物的检测方法。
【背景技术】
在现代临床医学中，同时快速准确的检测多种DNA、RNA、蛋白质、氨基酸等生物标识物对于疾病诊断，尤其是早期的诊断和预防，将会发挥至关重要的作用。传统的用于生物标识物检测的方法主要有电泳法、放射性分析法、传统的荧光光谱法、免疫法、色谱法等。这些方法普遍存在操作繁琐、成本高、检测过程耗时过长，准确度及灵敏度偏低等问题。如DNA的检测需要多步骤的抽样、提取，需要的样品量大、成本高、耗时长，而且样本处理的过程很容易被污染，检测灵敏度低、准确度差，在实际应用中受到了很大的限制。
【发明内容】
基于此，有必要提供一种灵敏的多组分生物标识物的检测方法。
一种多组分生物标识物的检测方法，包括如下步骤：获取生物标识物；加入第一探针、第二探针和第三探针与所述生物标识物混合形成混合物；对所述混合物使用多组分生物标识的检测设备进行进样检测；其中，所述多组分生物标识物的检测设备包括激光系统、进样系统、光路系统和数据采集分析系统；所述光路系统包括分光片、显微物镜、通光孔、聚焦镜和滤光片；
所述激光系统发出的激光进入所述光路系统，被分光片反射后照射到所述进样系统内的样品混合物上，样品混合物的发射光再经过所述显微物镜、所述分光片、所述通光孔后被分成多束光，分别进入所述数据采集分析系统；
所述分光片包括第一分光片、第二分光片和第三分光片；所述聚焦镜包括第一聚焦镜、第二聚焦镜和第三聚焦镜；所述滤光片包括第一滤光片、第二滤光片、第三滤光片；所述数据采集分析系统包括第一检测器、第二检测器、第三检测器、数据采集器、计算机终端；
进样系统内样品混合物的发射光经过显微物镜、第一分光片、通光孔、第二分光片后分成两束光；其中一束光经过第二聚焦镜和第二滤光片后进入第二检测器；另一束光经过第三分光片后再次被分成两束，其中一束光经第一聚焦镜和第一滤光片后进入第一检测器，另一束经第三聚焦镜和第三滤光片后进入第三检测器；数据采集器和计算机终端用于对第一检测器、第二检测器和第三检测器的检测结果进行采集处理。
优选的，所述生物标识物包括第一生物标识物和第二生物标识物；所述第一生物标识物、第二生物标识物、第一探针、第二探针和第三探针形成第二探针-第一生物标识物-第一探针-第二生物标识物-第三探针复合体结构。
优选的，所述生物标识物为DNA、RNA、蛋白质、生物小分子、细胞、细菌和病毒中的一种。
优选的，所述第一探针是以量子点标记的，所述第二探针和第三探针是以荧光染料标记的。
该套检测设备可实时检测通过探测区域内的每一个荧光分子所产生的荧光信号，检测灵敏度可达fM级。
以量子点标记的第一探针、荧光染料标记的第二探针和第三探针、第一生物标识物和第二生物标识物可以通过直接混合的方法形成双夹心复合体结构，避免了繁琐的生物标识物分离过程，样本处理的过程简单，需要的样品量小，不易受污染，具有检测成本低，检测灵敏度及准确度高的优点，可以广泛应用于各种生物分子的检测领域。
【附图说明】
图1是检测生物标识物的设备的示意图。
图2为检测方法的流程图。
图3为探针与生物标识物的复合体形成过程的示意图。
【具体实施方式】
下面主要结合附图说明多组分生物标识物的检测设备结构及检测流程。
图1是检测生物标识物的设备的示意图，该检测生物标识物的设备包括激光系统10、光路系统20、进样系统30以及数据采集分析系统40。
激光系统10包括激光器110和校准器120。光路系统20包括第一分光片211、第二分光片212、第三分光片213、数值孔径为1.3的显微物镜220、孔径为50μm的通光孔230、第一聚焦镜241、第二聚焦镜242、第三聚焦镜243，第一滤光片251、第二滤光片252和第三滤光片253。进样系统30包括载物台310和微流泵320。数据采集分析系统40包括第一检测器411、第二检测器412和第三检测器413、数据采集器420、计算机终端430。
激光器110发出的激光经过校准器120校准后进入光路系统20，第一分光片211反射后经过显微物镜220照射到载物台310；载物台310上的样品的发射光经过显微物镜220、第一分光片211、通光孔230、第二分光片212后分成两束光；其中一束光经过第二聚焦镜242和第二滤光片252后进入第二检测器412；另一束光经过第三分光片213后再次被分成两束，其中一束光经第一聚焦镜241和第一滤光片251后进入第一检测器411，另一束经第三聚焦镜243和第三滤光片253后进入第三检测器413；数据采集器420和计算机终端430用于对第一检测器411、第二检测器412和第三检测器413的检测结果进行处理。
图2为检测方法的流程图，检测方法包括：
S510：获取生物标识物。
生物标识物(biomarker)可以是DNA、RNA、蛋白质、生物小分子、细胞、细菌、病毒等，包括第一生物标识物和第二生物标识物。获取的生物标识物可以与量子点(QDs，Quantum Dots)标记的第一探针和荧光染料标记的第二探针、第三探针直接混合形成双夹心结构，称为第二探针-第一生物标识物-第一探针-第二生物标识物-第三探针复合体，这样可以避免繁琐的生物标识物的分离过程。荧光染料是指Cy5、Alexa Fuo 647等荧光分子。
S520：加入第一探针、第二探针和第三探针与生物标识物形成混合物。
图3为第二探针-第一生物标识物-第一探针-第二生物标识物-第三探针复合体的形成过程的示意图。以量子点标记的第一探针、荧光染料标记的第二探针和第三探针对生物标识物进行捕捉，三者可形成一种独特的双夹心结构。由于量子点受激发后可发射荧光，可以作为荧光给体，同时第二探针和第三探针上的荧光染料基团作为荧光受体，两者之间发生荧光共振能量转移的现象(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)，产生的FRET信号可以通过检测设备检出，从而达到单分子水平检测生物标识物的目的。
S530：对所述混合物进行进样检测。
激光器110发出的激光经校准器120和显微物镜220后聚焦于载物台310，经过载物台310的第二探针-第一生物标识物-第一探针-第二生物标识物-第三探针复合体经激光激发发出荧光，该荧光再经过显微物镜220、第一分光片211、通光孔230和第二分光片212后，被分成两束光，其中一束光的荧光来自第二探针，另一束光的荧光来自第一探针和第三探针。第二探针可以被激光激发，从而可以被第二检测器412检测。而第一探针也可以被激光激发，经第三分光片213后被第一检测器411检测。只有第一探针和第二探针与第一生物标识物形成第二探针-第一生物标识物1-第一探针复合体时，才能同时在第一检测器411和第二检测器412检测到荧光信号。第三探针不能被激光激发，因此单独的第三探针不能被第三检测器413检测。只有第一探针和第三探针与第二生物标识物形成第一探针-第二生物标识物-第三探针复合体时，第一探针被激发所释放的能量通过荧光共振能量转移传递给第三探针，第三探针才能释放出荧光而被第三检测器413检测。只有第一生物标识物和第二生物标识物同时存在时，才能形成第二探针-第一生物标识物-第一探针-第二生物标识物-第三探针复合体，才能同时在第一检测器411、第二检测器412和第三检测器413检测到荧光信号。根据检测的第一探针、第二探针和第三探针的荧光分子数，计算机终端430可对生物标识物进行准确定量。
该套检测设备可实时检测通过探测区域内的每一个荧光分子所产生的荧光信号，检测灵敏度可达fM级。
以量子点标记的第一探针、荧光染料标记的第二探针和第三探针、第一生物标识物和第二生物标识物可以通过直接混合的方法形成双夹心复合体结构，避免了繁琐的生物标识物分离过程，样本处理的过程简单，需要的样品量小，不易受污染，具有检测成本低，检测灵敏度及准确度高的优点，可以广泛应用于各种生物分子的检测领域。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种多组分生物标识物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取生物标识物；
加入第一探针、第二探针和第三探针与所述生物标识物混合形成混合物；
对所述混合物使用多组分生物标识的检测设备进行进样检测；
其中，所述多组分生物标识物的检测设备包括激光系统、进样系统、光路系统和数据采集分析系统；所述光路系统包括分光片、显微物镜、通光孔、聚焦镜和滤光片；
所述激光系统发出的激光进入所述光路系统，被分光片反射后照射到所述进样系统内的样品混合物上，样品混合物的发射光再经过所述显微物镜、所述分光片、所述通光孔后被分成多束光，分别进入所述数据采集分析系统；
所述分光片包括第一分光片、第二分光片和第三分光片；所述聚焦镜包括第一聚焦镜、第二聚焦镜和第三聚焦镜；所述滤光片包括第一滤光片、第二滤光片、第三滤光片；所述数据采集分析系统包括第一检测器、第二检测器、第三检测器、数据采集器、计算机终端；
进样系统内样品混合物的发射光经过显微物镜、第一分光片、通光孔、第二分光片后分成两束光；其中一束光经过第二聚焦镜和第二滤光片后进入第二检测器；另一束光经过第三分光片后再次被分成两束，其中一束光经第一聚焦镜和第一滤光片后进入第一检测器，另一束经第三聚焦镜和第三滤光片后进入第三检测器；数据采集器和计算机终端用于对第一检测器、第二检测器和第三检测器的检测结果进行采集处理。
2.如权利要求1所述的多组分生物标识物的检测方法，其特征在于，所述生物标识物包括第一生物标识物和第二生物标识物；所述第一生物标识物、第二生物标识物、第一探针、第二探针和第三探针形成第二探针-第一生物标识物-第一探针-第二生物标识物-第三探针复合体结构。
3.如权利要求1所述的多组分生物标识物的检测方法，其特征在于，所述生物标识物为DNA、RNA、蛋白质、生物小分子、细胞、细菌和病毒中的一种。
4.如权利要求1所述的多组分生物标识物的检测方法，其特征在于，所述第一探针是以量子点标记的，所述第二探针和第三探针是以荧光染料标记的。
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