CN104122662B - 一种超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统及方法,它包括:激发光源,提供激发光;第一会聚透镜,对来自激发光源的激发光聚光;第一二向色镜,反射来自第一会聚透镜的激发光;物镜,透射来自第一二向色镜的激发光;载物台,设置生物样品,生物样品在激发光激发下发射荧光,并通过物镜发射到第一二向色镜;第二二向色镜,对来自第一二向色镜的荧光分光;第二会聚透镜,对被第二二向色镜反射的荧光聚光;第一CCD相机,对来自第二会聚透镜的荧光成像;第三二向色镜,对被第二二向色镜透射的荧光分光;第三会聚透镜,对被第三二向色镜反射的荧光聚光;第二CCD相机,对来自第三会聚透镜的荧光成像;第四会聚透镜,对被第三二向色镜透射的荧光聚光;以及第三CCD相机,对来自第四会聚透镜的荧光成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种光学成像系统及方法,特别是关于一种基于联合生物标记的超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统及方法。
背景技术
超分辨光学显微技术利用对荧光发射在空间或时间上的调制,实现了突破光学衍射极限的显微成像。超分辨光学闪烁显微成像技术(SOFI)通过荧光团自身发射荧光在时间上的闪烁特性,计算不同荧光团所发射的荧光信号的时间自相关或空间互相关函数,获得空间分辨率的提升。在传统的超分辨光学闪烁显微成像中,分辨率提高的多少与所计算的互相关累积量的阶数有关,阶数越高,所得到的分辨率提升也会越多。此外,荧光团生物标记密度的高低直接影响到重建的生物结构的连续性和完整性,但是,随着互相关累积量阶数的增加,高标记密度的图像重建会诱发严重的伪影,导致最终图像出现明显的残缺和不连续的结构,降低了成像的质量,这一数学问题限制了高阶闪烁显微成像在生命科学研究中的应用。
现有的方法只能通过适当降低生物标记的密度来减少高阶闪烁显微成像所诱发的伪影,但降低标记密度所带来的问题是会造成生物结构标记不完整,难以真实、完整地反映所研究的生物结构的细节信息。
发明内容
针对上述问题,本发明的目的是提供一种基于联合生物标记的超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统及方法,该方法能够有效降低在超高标记密度下高阶闪烁显微成像的伪影,更加真实地还原出所研究的生物样品的完整结构和细节信息。
为实现上述目的,本发明采取以下技术方案:一种超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统,其特征在于,它包括:一激发光源,用以提供一束激发光;一第一会聚透镜,对来自所述激发光源的所述激发光进行聚光,并且来自所述激发光源的所述激发光穿透所述第一会聚透镜;一第一二向色镜,反射来自所述第一会聚透镜的所述激发光;一物镜,透射来自所述第一二向色镜的所述激发光;一载物台,其上设置有生物样品,并且来自所述物镜的所述激发光照射在所述生物样品上,所述生物样品在来自所述物镜的所述激发光的激发下会发射荧光,所述荧光通过所述物镜发射到所述第一二向色镜,所述第一二向色镜透射来自所述物镜的所述荧光;一第二二向色镜,对来自所述第一二向色镜的所述荧光进行分光,一部分来自所述第一二向色镜的所述荧光被所述第二二向色镜反射,另一部分来自所述第一二向色镜的所述荧光被所述第二二向色镜透射;一第二会聚透镜,对被所述第二二向色镜反射的所述荧光进行聚光,并且来自所述第二二向色镜的所述荧光穿透所述第二会聚透镜;一第一CCD相机,用于对来自所述第二会聚透镜的所述荧光进行成像;一第三二向色镜,对被所述第二二向色镜透射的所述荧光进行分光,一部分来自所述第二二向色镜的所述荧光被所述第三二向色镜反射,另一部分来自所述第二二向色镜的所述荧光被所述第三二向色镜透射;一第三会聚透镜,对被所述第三二向色镜反射的所述荧光进行聚光,并且来自所述第三二向色镜的所述荧光穿透所述第三会聚透镜;一第二CCD相机,用于对来自所述第三会聚透镜的所述荧光进行成像;一第四会聚透镜,对被所述第三二向色镜透射的所述荧光进行聚光,并且来自所述第三二向色镜的所述荧光穿透所述第四会聚透镜;以及一第三CCD相机,用于对来自所述第四会聚透镜的所述荧光进行成像。
所述第一CCD相机、第二CCD相机和第三CCD相机具有相同的像素数,并且单个像素大小相同。
一种超高密度超分辨光学闪烁显微成像方法,包括以下步骤:1)使用三种不同荧光发射波长的量子点联合标记生物样品中的同一细胞结构;2)将经过标记的生物样品放置并固定在超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统的载物台上;3)调节物镜与生物样品之间的距离,使生物样品位于物镜的焦点上,使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系;4)开启激发光源器,调节激发光的输出功率,并同时通过多个数字成像设备观察采集到的荧光图像,当观察到明显的荧光强度闪烁现象时,稳定激发光的输出功率;5)用多个数字成像设备同时采集三种量子点独立发射的荧光信号;6)对采集的三个通道的图像时间序列分别使用高精度的漂移校正算法进行漂移校正;7)用经平衡补偿后的超分辨闪烁显微成像算法对漂移校正后的三个通道的闪烁荧光图像进行分别处理;8)将处理后的三个通道的超分辨图像进行合并融合,即可得到生物样品的超高分辨率、高保真度的图像。
所述第一二向色镜选用能够反射来自所述第一会聚透镜的激发光并且透射所标记的三种量子点发射的荧光的波长;所述第二二向色镜选用能够反射其中一种量子点的荧光并且透射另外两种量子点的荧光的波长;所述第三二向色镜选用能够反射所述第二二向色镜所透射的两种量子点中一种量子点的荧光且透射另外一种量子点的荧光的波长。
本发明由于采取以上技术方案,其具有以下优点:1、本发明由于采用三种不同荧光发射波长的量子点标记生物样品的同一细胞结构,通过分别使用超分辨闪烁显微成像算法进行处理,并将处理后的图像合并融合,有效地抑制了在超高标记密度下高阶闪烁显微成像所产生的伪影和不连续性。2、本发明中采用的三种不同荧光发射波长的量子点作为生物标记物,其可以由同一光源激发,大大降低了系统的复杂性和成本。3、本发明中标记的三种量子点的荧光波长完全分离且光谱无重叠,只需设置适当的二向色镜就能将三种量子点的荧光信号完全分离,无需后期使用相关算法进行光谱分离,提高了系统的可操作性。4、本发明由于设置有三个CCD相机,可以实现同时对三个通道的荧光图像同步采集,大大提高了系统成像的速度。本发明可以广泛应用于生物样品的荧光成像过程中。
附图说明
图1是本发明超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统的结构示意图;
图2是本发明方法中生物样本联合标记的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
如图1所示,本发明提出了一种超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统,它包括一激发光源1、三个二向色镜2、3、4、一物镜5、一载物台6、四个会聚透镜7、8、9、10和三个CCD相机11、12、13。
激发光源1用以提供一束激发光。会聚透镜7设置在激发光所行经的光路上,并对激发光源1所发出的激发光进行聚光。二向色镜2反射来自会聚透镜7的激发光,反射后的激发光通过物镜5照射在载物台6上的生物样品14上。生物样品14在激发光的激发下会发射荧光,荧光通过物镜5发射到二向色镜2。二向色镜2透射来自物镜5的荧光。二向色镜3设置在来自二向色镜2的透射荧光的光路上,并对来自二向色镜2的荧光进行分光,一部分荧光被二向色镜3反射,一部分荧光被二向色镜3透射。会聚透镜8设置在来自二向色镜3的反射荧光的光路上,并对来自二向色镜3的反射荧光进行聚光使反射荧光在CCD相机11上成像。二向色镜4设置在来自二向色镜3的透射荧光的光路上,并对来自二向色镜3的透射荧光进行再次分光,一部分荧光被二向色镜4反射,一部分荧光被二向色镜4透射。会聚透镜9设置在来自二向色镜4的反射荧光的光路上,并对来自二向色镜4的反射荧光进行聚光使反射荧光在CCD相机12上成像。会聚透镜10设置在来自二向色镜4的透射荧光的光路上,并对来自二向色镜4的透射荧光进行聚光使透射荧光在CCD相机13上成像。
本发明的每个CCD相机分别对生物样品14进行100帧左右的成像。将三个CCD相机11、12、13采集到的图像分别通过超分辨闪烁显微成像算法处理,并将处理后的图像合并,最终可以获得生物样品内部结构的高分辨率、高质量的图像。
上述实施例中,激发光源1可采用激光器。
上述实施例中,物镜5可以选用数值孔径大于1.4的物镜,以便CCD相机11、12、13能够采集到尽可能高分辨率的宽场图像,便于后期利用超分辨闪烁显微成像算法实现对空间分辨率的进一步提升,突破光学衍射极限。
上述实施例中,三个CCD相机11、12、13应具有相同的像素数,且单个像素大小应一致,以确保采集到图像具有相同大小的区域和分辨率,以便对三组图像进行合并融合。
上述实施例中,采用的是倒置荧光显微镜的方式对生物样品14进行成像,也可以采用正置式荧光显微镜的方式,两者的区别仅是将光路进行上下翻转,即当采用正置式荧光显微镜时,生物样品14设置在物镜5的下部,当采用倒置式荧光显微镜时,生物样品14设置在物镜5的上部(如图1所示)。
基于上述超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统,本发明还提出了一种超高密度超分辨光学闪烁显微成像方法,该方法包括以下步骤:
1)使用三种不同荧光发射波长的量子点15、16、17联合标记生物样品14中的同一细胞结构18。
2)将经过标记的生物样品14放置并固定在载物台6上。
3)精细调节物镜5与生物样品14之间的距离,使得生物样品14位于物镜5的焦点上,使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系。
4)开启激发光源1,调节激发光的输出功率,并同时通过CCD相机11、12、13观察采集到的荧光图像,当观察到明显的荧光强度闪烁现象时,稳定激发光的输出功率。
5)设置合适的CCD相机曝光时间(通常设置为10~30毫秒),用三个CCD相机11、12、13同时采集三种量子点独立发射的荧光信号,采集的帧数各为100帧。
6)对采集的三个通道的图像时间序列分别使用高精度的漂移校正算法进行漂移校正。
7)用经平衡补偿后的超分辨闪烁显微成像算法对漂移校正后的三个通道共300帧闪烁荧光图像进行分别处理。
8)将处理后的三个通道的超分辨图像进行合并融合,即可得到生物样品14的超高分辨率、高保真度的图像。
上述各实施例中,如图2所示,生物样品14标记了三种量子点15、16、17,三种量子点15、16、17均标记于同一细胞结构18上。其中,量子点15的荧光发射中心波长为525nm,量子点16的荧光发射中心波长为625nm,量子点17的荧光发射中心波长为705nm,三种量子点可由同一个波长的激发光进行激发,且其荧光发射光谱不存在重叠区域。
上述各实施例中,二向色镜2、3、4应当针对所标记的不同量子点选用合适的波长。二向色镜2应反射来自会聚透镜7的激发光,透射所标记的三种量子点15、16、17发射的荧光;二向色镜3应反射其中一种量子点的荧光,透射另外两种量子点的荧光;二向色镜4应反射二向色镜3所透射的两种量子点中一种量子点的荧光,透射另外一种量子点的荧光;最终将三种量子点的荧光有效地分离开。
上述实施例仅用于说明本发明,凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进,均不应排除在本发明的保护范围之外。
Claims (2)
1.一种超高密度超分辨光学闪烁显微成像方法,其特征在于包括以下步骤:
1)设置一包括有激发光源、第一会聚透镜、第一二向色镜、物镜、载物台、第二二向色镜、第二会聚透镜、第一CCD相机、第三二向色镜、第三会聚透镜、第二CCD相机、第四会聚透镜和第三CCD相机的超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统;
2)使用三种不同荧光发射波长的量子点联合标记生物样品中的同一细胞结构;
3)将经过标记的生物样品放置并固定在载物台上;
4)调节物镜与生物样品之间的距离,使生物样品位于物镜的焦点上,使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系;
5)激发光源发出的激发光经第一会聚透镜发射到第一二向色镜,经第一二向色镜反射的光经物镜照射生物样品,生物样品受激发产生荧光,荧光经物镜发射到第一二向色镜,经第一二向色镜透射的光发射到第二二向色镜,经第二二向色镜反射的光经第二会聚透镜发射到第一CCD相机进行荧光成像,经第二二向色镜透射的光发射到第三二向色镜,经第三二向色镜反射的光经第三会聚透镜发射到第二CCD相机进行荧光成像,经第三二向色镜透射的光经第四会聚透镜发射到第三CCD相机进行荧光成像;
6)调节激发光的输出功率,并同时通过三个相机观察采集到的荧光图像,当观察到明显的荧光强度闪烁现象时,稳定激发光的输出功率;
7)对采集的三个通道的图像时间序列分别使用高精度的漂移校正算法进行漂移校正;
8)用经平衡补偿后的超分辨闪烁显微成像算法对漂移校正后的三个通道的闪烁荧光图像进行分别处理;
9)将处理后的三个通道的超分辨图像进行合并融合,即可得到生物样品的超高分辨率、高保真度的图像。
2.如权利要求1所述的一种超高密度超分辨光学闪烁显微成像方法,其特征在于,所述第一二向色镜选用能够反射来自所述第一会聚透镜的激发光并且透射所标记的三种量子点发射的荧光的波长;所述第二二向色镜选用能够反射其中一种量子点的荧光并且透射另外两种量子点的荧光的波长;所述第三二向色镜选用能够反射所述第二二向色镜所透射的两种量子点中一种量子点的荧光且透射另外一种量子点的荧光的波长。
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