CN101401722A - 一种多模式共聚焦成像方法及其装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多模式共聚焦成像方法及其装置，该方法将两种信号采集装置的发射光源通过二向色分光镜合光投射到目标组织；其反射信号光再通过二向色分光镜分光到达各自的滤波元件滤去干涉信号，再到达各自的检测元件，对同一样品的检测信号进行同时成像处理。该装置包括反射信号采集装置和荧光信号采集装置，两装置公用起合光作用的第一二向色分光镜、扫描镜和物镜的光路，其各自的检测光路分别包括滤波片、透镜、共聚焦针孔和光电探测器，光电探测器与成像电脑系统连接。这样由于两套共聚焦系统采集的是来自同一时间点和位置点的信号，同时采用光学设计避免多路激光与探测系统的互相干扰；从而完成实时无创地进行生物组织的三维检测。

Description

一种多模式共聚焦成像方法及其装置

技术领域

本发明涉及一种光学成像的方法，尤其涉及一种利用反射和荧光进行多模式共焦光学成像的方法，主要适合于生物组织多模式共聚焦成像；

本发明还涉及一种光学成像的装置，尤其涉及一种利用反射和荧光进行多模式共焦光学成像的装置。

背景技术

在先技术[1](参见Opt.Photonics News，P.Daucatas，18，2007，pp.28-33)所提出的共焦反射式成像装置利用组织的反射光进行成像。由于反射信号仅对折射率敏感，因此不能实现特定生物分子的选择性成像。

在先技术[2](参见J.Microsc.，A.L.Carlson et al.，228，2007，pp.11-24)中所描述的是共焦反射和荧光双模式成像方法。其基本原理是通过切换激光波长和不同的滤波系统，分别对组织进行共焦反射成像和共焦荧光成像。由于这两种模式不是同时采集，因此由呼吸、心跳带来的组织运动将使两种模式所得到的信息无法直接比对。

功能性成像指的是通过提取生物组织的生化信息用于分析其生物化学功能的成像模式。结构性成像指的是利用组织生物物理特性，提取组织对光的反射、散射等结构性信号用于组织成像。目前，采用共聚焦反射信号提取黑色素和角蛋白信息，以及利用荧光信号提取生物新陈代谢信息已经得到初步研究。

在活体组织的多模式成像中，一个很大的问题是如何避免组织运动造成的影响，在组织显微的过程中提取多模信息并将其叠加起来。现有的在先技术均不能达到以上目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种多模式反射-荧光共焦成像进行同点多模式成像的方法及其装置，该方法及装置能将多模式成像与共聚焦三维成像技术结合，利用光学的方法实时无创地对生物组织进行三维检测。

本发明为解决上述技术问题采用如下的技术方案：

一种多模式共聚焦成像方法：包括反射信号采集和荧光信号采集，

该方法将上述两种信号采集装置的发射光源通过二向色分光镜合光投射到目标组织；其反射信号光再通过二向色分光镜分光到达各自的滤波元件滤去干涉信号，再到达各自的检测元件，对同一目标样品的同一时间点的检测信号进行同时成像处理。

具体地，该方法包括：

第一和第二激光光源分别选择适于穿透组织的近红外光和适于激发组织自发荧光信号的波长，其中第一和第二激光光源的波长应不相同；

其中所述的反射信号采集：

a.由第一激光光源所发射的激光，透过棱镜起偏器到达四分之一波片，波片可将线偏振光转为圆偏振光，然后到达第一二向色分光镜由第一二向色分光镜透射，此第一二向色分光镜选择为透射第一激光的波长而反射短波波段(包含第二激光和生物组织自发荧光)，

b.透过第一二向色分光镜后，到达扫描镜，经过扫描镜反射后，光被物镜会聚到样品；

c.样品反射的信号被物镜收集，经过扫描镜后，透过第一二向色分光镜，到达四分之一波片，

d.由于反射光为圆偏振光，因此在经过波片后变为与入射光成90度的偏振态，这一偏振光经过棱镜后被反射，通过第一滤波片，第一滤波片设计为带通滤波器，仅让第一激光光源的波长通过而滤去第二激光光源的光以及荧光；

e.然后再经过第一透镜到达第一共聚焦针孔后，利用第一光电探测器将探测到的光信号转成电信号输入电脑成像。

同时采集荧光信号：

a.从第二激光光源发出的激光透过第二二向色分光镜后到达第一二向色分光镜，在第一二向色分光镜上与第一激光光源所发出的激光合光，其中第二二向色分光镜用于分开返回的激光与生物组织自发荧光，(可选择为透射短波长的激发光而反射长波长信号；)

b.激光经过第一二向色分光镜反射后，经过扫描镜反射，到达物镜，物镜将激光会聚于样品，其焦点与反射式共聚焦光路中的焦点重合；

c.从样品激发出的荧光被物镜收集，经过扫描镜后，被第一二向色分光镜反射；

d.在第二二向色分光镜上被反射，然后用第二滤光片滤光，该第二滤光片用于选择荧光通过而滤去第一、第二激光光源的波长；

e.荧光信号再经过第二透镜到达第二共聚焦针孔后，再由第二光电探测器将探测到的光信号转成电信号输入电脑成像。

上述两种方式的信号采集后同时输入电脑，同时成像处理，就能获得同一目标样品同一时间的多模式信息的叠加影像。

同时本发明提供了一种使用上述方法的多模式共聚焦成像装置，该装置包括反射信号采集装置和荧光信号采集装置，

其中反射信号采集装置包括沿光路顺序设置的第一激光光源、棱镜起偏器、四分之一波片、第一二向色分光镜、扫描镜和物镜，在棱镜起偏器的由物镜返回的光路的反射光路上顺序设置有第一滤波片、第一透镜、第一共聚焦针孔和第一光电探测器，该第一光电探测器与成像电脑系统连接；

同时该装置还设置有荧光信号采集装置，并且荧光信号采集装置与反射信号采集装置公用上述的从第一二向色分光镜到物镜的光路，其包括：沿光路顺序设置的第二激光光源、第二二向色分光镜、第一二向色分光镜、扫描镜和物镜，第二二向色分光镜设置于光路由物镜返回第一二向色分光镜的反射光路上，在第二二向色分光镜的由物镜返回的光路的反射光路上顺序设置有第二滤波片、第二透镜、第二共聚焦针孔和第二光电探测器，该第二光电探测器与成像电脑系统连接。

上述方法同时使用了多路激发光，将其共聚焦点在组织中重合，同时采用光学设计避免多路激光与探测系统的互相干扰；这样，由于两套共聚焦系统采集的是来自同一时间点和位置点的信号，因此生物组织的位移对两套系统是一致的，即不存在相对位移。由于不同模式同时、同点聚焦于样品中，因此组织的运动不会影响两种模式测量信号的耦合，这样得到的图像信息就是同时具有结构与功能信息的多模式成像；从而完成实时无创地进行生物组织的三维检测，其完全消除了活体组织的组织运动对多模成像结合分析带来的影响。

附图说明

为让本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，以下结合附图对本发明的具体实施方式作详细说明，其中：

图1是本发明多模式共聚焦成像装置的结构示意图。

图中：

101.第一激光光源        102.棱镜起偏器        103.四分之一波片

104.第一二向色分光镜    105.扫描镜            106.物镜

107.目标样品            108.第一滤波片        109.第一透镜

110.第一共聚焦针孔      111.第一光电探测器    113.电脑系统

201.第二激光光源        202.第二二向色分光镜  203.第二滤光片

204.第二透镜            205.第二共聚焦针孔    206.第二光电探测器

具体实施方式

附图1示出了一种多模式共聚焦成像装置，该装置包括该装置包括反射信号采集装置和荧光信号采集装置，

其中反射信号采集装置包括沿光路顺序设置的第一激光光源101、棱镜起偏器102、四分之一波片103、第一二向色分光镜104、扫描镜105和物镜106，在棱镜起偏器102的由物镜106返回的光路的反射光路上顺序设置有第一滤波片108、第一透镜109、第一共聚焦针孔110和第一光电探测器111，该第一光电探测器111与成像电脑系统113连接；

同时该装置还设置有荧光信号采集装置，并且荧光信号采集装置与反射信号采集装置公用上述的从第一二向色分光镜104到物镜106的光路，其包括：沿光路顺序设置的第二激光光源201、第二二向色分光镜202、第一二向色分光镜104、扫描镜105和物镜106，第二二向色分光镜202设置于光路由物镜106返回第一二向色分光镜104的反射光路上，在第二二向色分光镜202的由物镜106返回的光路的反射光路上顺序设置有第二滤波片203、第二透镜204、第二共聚焦针孔205和第二光电探测器206，该第二光电探测器206与成像电脑系统113连接。

首先，反射式共聚焦激发光采用的激光光源101为近红外808nm，经过棱镜起偏器(格兰-泰勒棱镜)102起偏之后，经过四分之一波片103，将线偏振光转为圆偏振光，所形成的圆偏振光透过第一二向色分光镜104，到达一对检流式共聚焦扫描镜105。扫描镜将光反射到物镜106，并被物镜会聚到焦点，照射到样品107上；扫描镜105和物镜106由电脑系统113控制，分别完成检测光焦点的横向和纵向的移动。

生物样品的折射率不匹配造成了样品对信号的反射，经过样品反射的信号被物镜106收集，在透过第一二向色分光镜104后到达四分之一波片103。由于反射光保持了圆偏振性，因此在经过波片后变为与入射光成90度的偏振态。这一偏振光经过棱镜102后被反射，到达第一滤波片(镀膜波片)108上，此波片为带通滤波片，仅能使808nm激光通过而对其他光尤其是375nm激光有着OD5的高吸收。

再经过第一透镜109聚焦后，一根单模光纤系统被用作共聚焦系统的小孔第一共聚焦针孔110。在反射信号经过光纤后，利用第一光电探测器(PMT光探测器)111探测其强度，并输入电脑系统113成像；

采集功能信号的激光器201是一台375nm激光器，被用于激发生物组织自发荧光。激光通过第二二向色滤波片202后，被第一二向色分光镜104反射到检流式扫描镜105上。通过调整激光器的方向，可保证两台激光器的光路共轭。

从样品激发出的荧光被物镜106收集，被第一、第二二向色分光镜104、202反射。通过一个400-500nm第二滤波器(带通滤波器)203，可滤除反射回来的375nm激光和800nm激光，只探测400-500nm的荧光信号。同样，一根单模光纤系统被用作共聚焦系统的小孔第一共聚焦针孔204。在反射信号经过光纤后，利用第二光电探测器(PMT光探测器)205探测其强度，并输入电脑系统113成像；

上述两种方式的信号采集后同时输入电脑，同时成像处理，就能获得同一目标样品同一时间的多模信息的叠加影像，从而完成实时无创地进行生物组织的三维检测。

Claims (3)

1.一种多模式共聚焦成像方法：包括反射信号采集和荧光信号采集，其特征在于：

该方法将上述两种信号采集装置的发射光源通过二向色分光镜合光投射到目标组织；其反射信号光再通过二向色分光镜分光到达各自的滤波元件滤去干涉信号，再到达各自的检测元件，对同一目标样品的同一时间点的检测信号进行同时成像处理。

2.根据权利要求1所述的多模式共聚焦成像方法，其特征在于：

第一和第二激光光源分别选择适于穿透组织的近红外光和适于激发组织自发荧光信号的波长，其中第一和第二激光光源的波长应不相同；

其中所述的反射信号采集：

a.由第一激光光源所发射的激光，透过棱镜起偏器到达四分之一波片，波片可将线偏振光转为圆偏振光，然后到达第一二向色分光镜由第一二向色分光镜透射，此第一二向色分光镜选择为透射第一激光的波长而反射短波波段(包含第二激光和生物组织自发荧光)，

b.透过第一二向色分光镜后，到达扫描镜，经过扫描镜反射后，光被物镜会聚到样品，

c.样品反射的信号被物镜收集，经过扫描镜后，透过第一二向色分光镜，到达四分之一波片，

d.由于反射光为圆偏振光，因此在经过波片后变为与入射光成90度的偏振态，这一偏振光经过棱镜后被反射，通过第一滤波片，第一滤波片设计为带通滤波器，仅让第一激光光源的波长通过而滤去第二激光光源的光以及荧光，

e.然后再经过第一透镜到达第一共聚焦针孔后，利用第一光电探测器将探测到的光信号转成电信号输入电脑成像；

同时采集荧光信号：

a.从第二激光光源发出的激光透过第二二向色分光镜后到达第一二向色分光镜，在第一二向色分光镜上与第一激光光源所发出的激光合光，其中第二二向色分光镜用于分开返回的激光与生物组织自发荧光，

b.激光经过第一二向色分光镜反射后，经过扫描镜反射，到达物镜，物镜将激光会聚于样品，其焦点与反射式共聚焦光路中的焦点重合，

c.从样品激发出的荧光被物镜收集，经过扫描镜后，被第一二向色分光镜反射；

d.在第二二向色分光镜上被反射，然后用第二滤光片滤光，该第二滤光片用于选择荧光通过而滤去第一、第二激光光源的波长；

e.荧光信号再经过第二透镜到达第二共聚焦针孔后，再由第二光电探测器将探测到的光信号转成电信号输入电脑成像。

上述两种方式的信号采集后同时输入电脑，同时成像处理，就能获得同一目标样品同一时间的多模式信息的叠加影像。

3.一种使用上述方法的多模式共聚焦成像装置，其特征在于：该装置包括反射信号采集装置和荧光信号采集装置，

其中反射信号采集装置包括沿光路顺序设置的第一激光光源、棱镜起偏器、四分之一波片、第一二向色分光镜、扫描镜和物镜，在棱镜起偏器的由物镜返回的光路的反射光路上顺序设置有第一滤波片、第一透镜、第一共聚焦针孔和第一光电探测器，该第一光电探测器与成像电脑系统连接；

同时该装置还设置有荧光信号采集装置，并且荧光信号采集装置与反射信号采集装置公用上述的从第一二向色分光镜到物镜的光路，其包括：沿光路顺序设置的第二激光光源、第二二向色分光镜、第一二向色分光镜、扫描镜和物镜，第二二向色分光镜设置于光路由物镜返回第一二向色分光镜的反射光路上，在第二二向色分光镜的由物镜返回的光路的反射光路上顺序设置有第二滤波片、第二透镜、第二共聚焦针孔和第二光电探测器，该第二光电探测器与成像电脑系统连接。