CN110231320B - 一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明属于单分子成像技术领域，具体涉及一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统。本发明系统包括：第一物镜、第二物镜、第一平面、第二平面、第一平面镜、凹面镜、第二平面镜、EMCCD；本发明在基本倒置荧光显微镜高速二维探测系统的基础上，通过搭建第二物镜，收集上半球面的荧光信号至第二平面，再由第二平面上的凹面镜返还至样品平面；经过第二物镜放大后，使单分子信号离凹面镜的中心轴的距离与凹面镜焦距的量级相近，达到垂直方向的最佳测量精度。

Description

一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统
技术领域
本发明属于单分子成像技术领域，具体涉及一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统。
背景技术
超分辨显微镜将光学显微镜带入了纳米维度，实现了活体细胞中单个分子通路的可视化。高时间分辨率和高三维空间分辨显微镜广泛用于进一步研究细胞核孔蛋白调控基因的机理，毫秒量级甚至更快的纤毛内分子运输、细胞间分子交换及跨膜通道开关等生物问题的研究。因此要求超分辨显微镜实验系统同时具有高时间分辨率和高三维空间分辨的光电信号探测功能至关重要。
现今，超分辨显微镜主要分成两大类。一类是通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率的方法，如受激发射损耗显微技术和饱和结构照明显微技术。这两种方法对样品的要求较低，已报道的空间分辨率的极限是50nm，且因其扫描过程所需时间较长，不适合测量毫秒量级快速过程。另一大类是基于单分子成像的超分辨显微成像方法，包括光激活定位显微技术 ( photoactivated localization microscopy, PALM) 和随机光学重构显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM) 。虽然PLAM和STORM两种方法受激发方式所限，但是在极端情况下Photometry公司的Evolve128 EMEMCCD的拍摄速度可达到0.23 ms每幅。故只有基于单分子成像的方式来设计三维单分子实时定位才有可能获得满足时间空间分辨率的显微镜技术。近几年来，基于单分子成像方法上已有多种三维单分子定位的超分辨显微技术被开发出来。例如：基于PSF技术来获得z方向的信息，如Biplane技术、Angled mirror、Astigmatism、Double-helix point-spread function技术等；降低原先二维探测信号强度获得z方向的信息，如Parallax、Biplane、Interference、Double-helix point-spread function显微技术等。
但是以上这些方法不适宜用于快速分子运动过程的监测。首先，由于分子运动的速度快，分子的PSF将被破坏，所有基于PSF的技术将都不适用。第二，在提高时间分辨时，不可避免将降低单张图像的信号强度，而信号强度决定了空间定位精度（空间精度反比于获得的信号光子数的开平方）。在荧光分子已无法提高的情况下，任何导致原先二维信号强度降低的设计都是不可取的。总之基于这两点考虑，需要设计新的快速三维单分子定位研究方案，即在不降低二维探测荧光信号强度和不改变荧光信号形状的情况下来获取垂直方向位置的准确信息。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结构简单、易于操作，且适用于高精度时间空间分辨的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统。
本发明提供的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，在基本倒置荧光显微镜高速二维探测方法的基础上，通过搭建第二物镜，收集上半球面的荧光信号至搭建的第二平面，再由第二平面上的凹面镜器件返还至显微镜；经过第二物镜放大后，使得单分子信号离凹面镜中心轴的距离与凹面镜焦距的量级相近，达到垂直方向的最佳测量精度。
本发明通过平面镜和凹面镜组合，将光学信号收集优化，并在整个方案实施中采用特殊的振动消除手段。
本发明通过这种特殊形式的转换，在不通过PSF探测或操作的方式下，凭借一种显微镜第二平面荧光返还探测技术，实现兼具超高的时间和空间分辨率的三维分子荧光追踪系统，获取第三个维度的高精度空间信息。这项新技术能够提供亚毫秒级时间分辨率，Z轴方向二十纳米级的空间分辨率。
具体来说，本发明提供的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其结构参见图1所示。包括：第一物镜M1、显微镜样品平面、支架、光学平板、第二物镜M2、第一平面镜、凹面镜M3、第二平面镜、EMCCD；其中，倒置荧光显微镜包括第一物镜M1和第二物镜M2相对放置，其中间为样品平面，称之为第一平面；光学平板放置于支架上，光学平板称之为第二平面；第二平面上放置第一平面镜、凹面镜M3、第二平面镜、三角镜架、L型镜架；记S1为原始荧光信号，S2为S1经过第二物镜M2后的像点，S3为像点S2经过凹面镜后的成像点，S4为S3再次经过第二平面镜和第二物镜M2后的成像点；第一物镜M1用于收集下半球面标准单分子荧光信号S1成像；所述第一平面镜按第二平面水平正方向45度角度架设，并由三角镜架固定，第一平面镜将第二物镜M2收集的荧光反射并在点S2处聚焦成像；所述凹面镜M3放置于第一平面镜的反射光路上，并由一L型镜架固定；像点S2由凹面镜M3的成像原理成像至S3；所述第二平面镜放置于凹面镜M3的反射光路中，通过调节第二平面镜合适的角度进行修正，使得第二平面镜反射的S3返还至第二物镜M2；第二物镜M2将返还的像S3缩小至S4返还至样品平面，同时显示在显微镜二维EMCCD阵列探测器的焦平面上，在同一EMCCD上同时获得两个单分子荧光点。经过第二物镜M2放大后，使得单分子信号离凹面镜中心轴距离与凹面镜M3焦距的量级相近，达到垂直方向的最佳测量精度。当单分子运动时，通过对运动前后的两个荧光点（由凹面镜M3返还的两个荧光点）以及第一物镜M1收集的下半球面原荧光信号点S1的平面相对位置的分析，能够精确快速获取分子在垂直方向的位置信息，原荧光点S1的（x ，y）位置信息可通过二维高斯拟合获得。
本发明中，单分子上下半球的荧光分别被上、下两个物镜（即第一物镜M1、第二物镜M2）捕捉，上半球被捕捉的荧光信号，通过第一平面镜、第二平面镜、凹面镜M3组合系统放大后再返回到第一物镜M1上，第一物镜M1捕捉到的荧光信号S1与返还荧光点S4同时显示在EMCCD上。
本发明中，上、下两个物镜，通过一定机械结构搭建，样品位于两个物镜之间，能容纳一定大小范围的样品尺寸，以便满足实验要求。
本发明中，所述的第一平面镜、第二平面镜、凹面镜M3组合系统，通过特制光学平板以及各种支架搭建，独立于外界系统，以达到减小振动的目的。
本系统，通过调节第二物镜M2的工作距离，使得样品所成像在凹面镜M3的两倍焦距处，则初始荧光信号与返还荧光信号位置一致，记录此时在EMCCD处的位置为原点。在调节第二物镜M2的焦距时，需使两个物镜同步移动，确保返还荧光点与原荧光点保持同焦平面。沿Z轴移动样品，则样品与第二物镜M2的距离发生改变，通过第二物镜M2所成像位置发生改变，样品离第二物镜M2越近，所成的像距离凹面镜M3也越近，则经过凹面镜M3所成的像在EMCCD上所成荧光点位置也不同，根据返还荧光点与原荧光点的相对位置分析，便能够精确快速获取分子在垂直方向的位置信息。
本发明中，所述的平面镜经过镀铝膜，以减少荧光信号损失，所述的凹面镜经过镀铝膜和调节位置、角度，最大化消球差和色差，并增强荧光信号。
本发明对比已有技术，具有以下优点：采用非对称双物镜光学成像系统（包括第一物镜M1、第二物镜M2），无需限制样品的厚度，便能同时收集上下半球荧光信号。在第二平面上设置了专门的光学器件，经光学操作后返还至显微镜，该项设计含有多维度光学信息被充分应用和分析的自由度，结构简单，易于操作，适用于高精度时间空间分辨的显微镜系统。
附图说明
图1是本发明的结构示意图。
图中标号：1为第一物镜M1；2为第一平面；3为支架；4为光学平板即第二平面；5为第二物镜M2；6为第一平面镜；7为凹面镜M3；8为第二平面镜；9为三角镜架；10为L型镜架：11为EMCCD。
具体实施方式
参照图1所示，样品被倒置荧光显微镜激光光源激发，产生荧光信号，倒置荧光显微镜的第一物镜M1 1采用40×，数值孔径为0.9，收集下半球面原单分子荧光信号S1成像。将倒置显微镜的样品平面称之为第一平面。在第一平面 2之上，通过支架 3连接光学平板4构成第二平面，第二平面必须与显微镜固定牢固，并独立于外界系统，以达到减小振动的目的。第二平面 4上放置第一平面镜 6、凹面镜M3 7、第二平面 8、三角镜架 9、L型镜架10。S1为原始荧光信号，S2为S1经过第二物镜M2 5后的像点，S3为像点S2经过凹面镜 7后的成像点，S4为S3再次经过第二平面镜 8和第二物镜M2 5后的成像点。在第一平面 2 样品平面与第二平面之间搭建40×，数值孔径为0.7的第二物镜M2 5，收集上半球面的荧光信号至搭建的第二平面，在第二平面水平正方向45度架设镀铝膜第一平面镜 6，第一平面镜 6由三角镜架 9固定，第一平面镜 6将第二物镜M2 5收集的荧光反射并在点S2处聚焦成像，则第二物镜采集的上半球面荧光信号移至搭建的第二平面。在第一平面镜的反射光路上放置凹面镜M3 7，凹面镜M3 7由L型镜架 10固定，焦距为9 mm，像点S2由凹面镜M3 7的成像原理成像至S3，当单分子荧光信号偏离凹面镜中心轴一定距离后，凹面镜M3 7成像光路将逐渐偏离光路中轴而无法再被第二物镜M2 5采集回显微镜而造成信号损失，需要使用平面镜修正。在凹面镜M3 7的反射光路中放置第二平面镜 8，第二平面 8镜选择合适的角度进行修正，使得第二平面镜 8反射的S3返还至第二物镜M2 5，第二物镜M2 5将返还点S3返还至显样品平面形成像S4，同时显示在二维EMCCD 11阵列探测器的焦平面上，EMCCD 11的像素元为6.5μm ， 在同一EMCCD 11上同时获得S1和S4两个单分子荧光点。经过第二物镜放大后，使得单分子信号离凹面镜中心轴的距离与凹面镜焦距的量级相近，达到垂直方向的最佳测量精度。
调节第二物镜工作距离，使得样品所成像在凹面镜两倍焦距处，则初始荧光信号与返还荧光信号位置一致，记录此时在EMCCD 11处的位置为原点。在调节第二物镜焦距时，需使两个物镜同步移动，确保返还荧光点与原荧光点保持同焦平面。沿Z轴移动样品，则样品与第二物镜的距离发生改变，通过第二物镜所成像位置发生改变，样品离第二物镜越近，所成的像距离凹面镜也越近，则经过凹面镜所成的像在EMCCD 11上所成荧光点位置也不同，根据返还荧光点与原点的相对位置分析，获取分子在垂直方向的位置。当单分子运动时，通过对运动前后的两个荧光点（由凹面镜M3 7返还的两个荧光点）以及第一物镜M1收集的下半球面原荧光信号点S1的平面相对位置的分析，能够精确快速获取分子在垂直方向的位置信息，原荧光点S1的（x,y）位置信息可通过二维高斯拟合获得。
理论模型：凹面镜单分子荧光信号返还模型。
在基本倒置荧光显微镜探测单分子信号的方式中，仅收集了物镜下半球面的荧光信号，若将上半球面的荧光信号通过基于凹面镜成像原理的光路系统收集并返还，在显微镜的物平面上将出现两个单分子信号。通过二维高斯拟合原信号获取分子的x和y方向的位置，原信号的z方向位置信息将通过凹面镜的放大作用被高分辨返还到平面位置，通过对两个荧光点平面的相对位置分析，可精确获取分子在z方向的位置信息。
如图1所示，S2点离凹面镜的中心轴的距离为X2、离凹面镜的距离为Z2，经过凹面镜反射后，其放大返还的信号点S3点离凹面镜的中心轴的距离为X3、离凹面镜的距离为Z3，凹面镜焦距为f3，放大率为M3。定义b为原点（如细胞核孔中心或分子为起始运动坐标），坐标为（xb，yb，zb），根据透镜成像公式可得到单分子荧光点在z方向上相对位移为Δz：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
垂直方向的误差为：
Figure 454571DEST_PATH_IMAGE002
。
本发明通过这种特殊形式的转换，在不通过PSF探测或操作的方式下，凭借一种显微镜第二平面荧光返还探测技术，实现兼具超高的时间和空间分辨率的三维分子荧光追踪系统，获取第三个维度的高精度空间信息。这项新技术能够提供亚毫秒级时间分辨率，Z轴方向二十纳米级的空间分辨率。

Claims (5)

1. 一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，包括：第一物镜M1（1）、样品平面（2）、支架（3）、光学平板（4）、第二物镜M2（5）、第一平面镜（6）、凹面镜M3（7）、第二平面镜（8）、EMCCD（11）；其中，光学平板（4）也称为第二平面，第二平面上放置第一平面镜（6）、凹面镜M3（7）、第二平面镜（8）、三角镜架（9）、L型镜架（10）；第一物镜M1（1）和第二物镜M2（5）相对放置，组成倒置荧光显微镜；其中间为显微镜的载物台样品平面（2），称之为第一平面；记S1为原始荧光信号，S2为S1经过第二物镜M2（5）后的像点，S3为像点S2经过凹面镜（7）后的成像点，S4为S3再次经过第二平面镜（8）和第二物镜M2（5）后的成像点；第一物镜M1（1）用于收集标准单分子荧光信号S1的下半球面荧光并成像；光学平板（4）放置于支架（3）上；所述第二物镜M2（5）用于收集荧光信号S1的上半球面荧光并成像；第一平面镜（6）按第二平面水平正方向45度角度架设，并由三角镜架（9）固定，第一平面镜（6）将第二物镜M2（5）收集的荧光反射并在点S2处聚焦成像；所述凹面镜M3（7）放置于第一平面镜（6）的反射光路上，并由一L型镜架（10）固定；像点S2由凹面镜M3（7）的成像原理形成放大的像S3；所述第二平面镜（8）放置于凹面镜M3（7）的反射光路中，通过调节第二平面镜（8）合适的角度进行修正，使得第二平面镜（8）反射的像S3返还至第二物镜M2（5）；第二物镜M2（5）将像S3缩小至样品平面（2）形成像点S4，同时显示在二维EMCCD（11）阵列探测器的焦平面上，在同一EMCCD（11）上同时获得S1和S4两个单分子荧光点；经过第二物镜M2（5）放大后，使得单分子信号离凹面镜M3（7）的中心轴的距离与凹面镜M3（7）焦距的量级相近，达到垂直方向的最佳测量精度；当单分子运动时，通过对运动前后的、由凹面镜M3（7）返还的两个荧光点以及第一物镜M1收集的下半球面原荧光信号点S1的平面相对位置的分析，能够精确快速获取分子在垂直方向的位置信息，原荧光点S1的（x ，y）位置信息可通过二维高斯拟合获得；
通过调节第二物镜M2（5）的工作距离，使得样品所成像在凹面镜M3（7）的两倍焦距处，则初始荧光信号与返还荧光信号位置一致，记录此时在EMCCD（11）处的返还点的位置为原点；在调节第二物镜M2（5）的焦距时，需使两个物镜同步移动，确保返还荧光点与原荧光点保持同焦平面；沿Z轴移动样品，则样品与第二物镜M2（5）的距离发生改变，通过第二物镜M2（5）所成像位置发生改变，样品离第二物镜M2（5）越近，所成的像距离凹面镜M3（7）也越近，则经过凹面镜M3（7）所成的像在EMCCD（11）上所成荧光点位置也不同，根据运动时返还荧光点与原荧光点的相对位置分析，便能够精确快速获取分子在垂直方向的位置信息，原荧光点S1的（x,y）位置信息可通过二维高斯拟合获得。
2.根据权利要求1所述的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，单分子上下半球的荧光分别被上、下两个物镜即第一物镜M1（1）和第二物镜M2（5）捕捉，上半球被捕捉的荧光信号，通过第一平面镜（6）、第二平面镜（8）、凹面镜M3（7）组合系统放大后再返回到第一物镜M1（1）上，第一物镜M1（1）捕捉到的荧光信号S1与返还荧光点S4同时显示在EMCCD上。
3.根据权利要求2所述的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，上、下2个物镜，通过机械结构搭建，样品位于两个物镜之间，能容纳一定大小范围的样品尺寸，以便满足实验要求。
4.根据权利要求3所述的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，所述的第一平面镜（6）、第二平面镜（8）、凹面镜M3（7）组合系统，通过光学平板以及各种支架搭建，独立于外界系统，以达到减小振动的目的。
5.根据权利要求1-4之一所述的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，所述的平面镜经过镀膜，以减少荧光信号损失；所述的凹面镜经过镀膜和位置、角度调节，最大化消球差和色差，并增强荧光信号。
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"Ultra-High Resolution 3D Imaging of Whole Cells";Fang Huang.et al;《Cell》;20160831;全文 *

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