CN100410719C - 采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种光学显微成像领域中的共焦成像系统，是一种通过采用虚拟共焦针孔使系统获得纵向层析能力的共焦显微系统，可广泛应用于荧光显微术、非线性光学显微术等具有三维成像能力的显微技术中。本发明包括点光源，准直透镜，分光镜，显微物镜，载物台，收集透镜以及CCD。其特点是CCD的光敏面直接位于收集透镜的焦平面位置，计算机根据收集透镜焦点的位置，在CCD采集到的二维数字图像上的相应位置设置虚拟共焦针孔，只将针孔内像元上的信号值累加起来作为当前扫描点的信号强度，排除了非焦平面杂散光对成像质量的影响。虚拟共焦针孔的作用与物理共焦针孔的作用相当，且位置、大小可由计算机控制和调整，具有校准调节方便等优点。

Description

采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统

技术领域

本发明涉及一种光学显微成像领域中的共焦成像系统，具体地说，涉及一种通过采用虚拟共焦针孔使系统获得纵向层析能力的共焦显微系统，可广泛应用于荧光显微术、非线性光学显微术等具有三维成像能力的显微技术中。

背景技术

由于共焦显微成像技术不仅具有比传统光学显微术更高的分辨率，同时还具有独特的纵向层析能力，因此被广泛地应用于生物、生物医学、工业探测以及计量学等领域。共焦针孔对共焦显微成像系统的纵向层析能力起着至关重要的作用。系统中，被测点和共焦针孔处于共轭的位置，由于共焦针孔位置的特殊性，使得汇聚在焦点前或后的光不能或者不能完全通过针孔，而只有来自焦平面的信号光才能最大限度地通过共焦针孔被探测器接收，这使得共焦系统能够不通过切片而获得厚样品的纵向层析图像，也就是说共焦系统具备了纵向层析能力。

但是，传统的共焦显微系统采用的是物理共焦针孔，如光纤的芯径。在实际实用过程中，物理共焦针孔通常存在以下一些问题：针孔的尺寸一般在微米量级范围，需要采用精密、稳定的三维定位装置，进行精确而繁琐的调整后，将针孔调节到收集透镜的焦点位置，否则会很容易引起光能损失以及分辨率下降等问题；针孔尺寸大小不能根据实际实用情况随意调节和改变；时间过长后，针孔与焦点位置很容易发生偏移，又需要重新进行三维调节和校准；另外，还存在针孔阻塞和针孔清洗麻烦等问题。

电荷耦合器件(CCD)是20世纪70年代初发展起来的半导体器件，通过CCD获得的信号是数字信号，可以直接利用计算机对获得的数字信号进行各种特殊处理；并且，CCD经过几十年的发展，各方面的性能都取得了惊人的进展，特别是在像传感器应用方面得到了迅速地发展，如可用于微弱荧光探测领域、像元尺寸仅为几个微米等，因此被广泛应用于现代测控、图像获取等领域。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷，本发明将CCD应用到共焦系统中，根据共焦系统自身的结构特点和光学特性对CCD采集到的数字信号进行相应的计算机处理，提出了一种采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统的技术方案，该系统不仅具有纵向层析能力，同时还有校准调节方便等优点。

本发明的基本思想是：

将CCD光敏面放置于系统收集透镜的焦平面位置，对于CCD采集到的数字信号，利用计算机在与收集透镜焦点相对应的位置处生成一个兴趣窗口，相当于与被测点存在共轭的关系，将窗口内像元上的信号值累加起来作为当前扫描点的信号强度。兴趣窗口的尺寸以及作用等与物理共焦针孔相同，且不是实体存在的，被称之为虚拟共焦针孔。

本发明的技术方案

这种采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统，使用准直透镜、分光镜、显微物镜、扫描系统、收集透镜、电荷耦合器件、计算机；

其特点在于它由三部分组成：

第1部分：在中心光轴依次排列点光源、准直透镜、分光镜、和显微物镜构成该系统的照明光路；

第2部分：依次排列所述显微物镜、所述分光镜、收集透镜、电荷耦合器件构成系统的探测光路；

第3部分：计算机控制扫描系统以及电荷器件，构成数据采集、处理和图像重建部分。

本发明的有益效果：

1、调节定位方便。CCD的光敏面通常为毫米量级，与尺寸仅为微米量级的物理共焦针孔相比较而言，显然，在垂直光轴面上的调节要容易得多，只要保证CCD光敏面位于焦平面，即只需进行光轴方向的精细调整，并且CCD能够接收到信号光，就可以根据收集透镜焦点的位置设置兴趣窗口，操作非常简单；

2、虚拟共焦针孔的位置、大小可以随时根据实际需要进行改变，不需要对显微系统重新进行繁琐的定位调节；

3、虚拟共焦针孔不存在针孔堵塞问题，也不需要进行清洗方面的工作。

附图说明

图1：采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统的光路示意图。

图2：反射镜距离显微物镜焦点13.8μm时CCD探测到的光强分布。

图3：反射镜距离显微物镜焦点6.8μm时CCD探测到的光强分布。

图4：反射镜位于显微物镜焦平面时CCD探测到的光强分布。

图5：反射镜距离显微物镜焦点-6.8μm时CCD探测到的光强分布。

图6：反射镜距离显微物镜焦点-13.8μm时CCD探测到的光强分布。

图7：兴趣窗口的示意图。

图中：1.点光源  2.准直透镜  3.分光镜  4.显微物镜  5.扫描系统  6.收集透镜  7.电荷耦合器件(CCD)  8.计算机

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明：

这种采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统，使用准直透镜、分光镜、显微物镜、扫描系统、收集透镜、电荷耦合器件、计算机；

其特点在于它由三部分组成：

第1部分：在中心光轴依次排列点光源1、准直透镜2、分光镜3和显微物镜4构成该系统的照明光路；

第2部分：依次排列所述显微物镜4、所述分光镜3、收集透镜6、电荷耦合器件7构成系统的探测光路；

第3部分：计算机8控制扫描系统5以及电荷耦合器件7，构成数据采集、处理和图像重建部分。

电荷耦合器件的光敏面直接位于收集透镜的焦平面位置。

所述光源是激光光源或普通光源。

所述分光镜是普通型分光镜或二向色性分光镜。

所述的采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统的成像方法，其特点在于它包括下述步骤：

1)在垂直于光轴的方向上进行两维调节使得信号光被收集透镜汇聚到CCD的光敏面上，然后进行纵向调节使得CCD的光敏面位于收集透镜的焦平面位置；

2)光斑在CCD采集到的二维图像上的位置，对应于收集透镜焦点在CCD光敏面的位置，计算机在二维数字图像上的对应位置处设置虚拟针孔，只将针孔内像元上的信号值累加起来作为当前扫描点的信号强度；

3)扫描系统驱动载物台作三维平动，对置于其上的被测样品进行三维扫描，可以得到不同扫描点的信号强度，计算机根据这些采集到的信号最终重构出被测样品的层析图像。

换一种描述方法是：

采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统，它包括在中心光轴依次排列的点光源，准直透镜，分光镜，显微物镜，载物台，收集透镜以及CCD；点光源通过准直透镜形成平行光入射到分光镜上，经显微物镜被聚焦到被测样品；从被测样品处产生的反射或散射光被同一显微物镜探测，沿原光路返回，经分光镜后被反射到收集透镜上，最后到达CCD，由CCD对信号进行采集；CCD的光敏面直接位于收集透镜的焦平面位置，前方没有采用任何物理针孔，根据收集透镜焦点的位置，在CCD采集到的二维数字图像上设置兴趣窗口，将窗口内像元上的信号值累加起来作为当前扫描点的信号强度，窗口的位置、大小可由计算机调整；一高于微米级精度的三维平移台驱动载物台作三维平动，对置于其上的被测样品进行三维扫描，得到不同扫描点的信号强度，最终重构出被测样品的层析图像。

尽管在该系统中没有采用物理共焦针孔，焦点前或后的光以及杂散光均被CCD接收，但是CCD光敏面处于系统的一个特殊位置，即位于收集透镜的焦平面，使得存在这样一种光学特性：随着离焦量的增大，来自非焦点处的光在CCD光敏面上的分布相对于收集透镜的焦点呈现向外扩散的现象，相应地对兴趣窗口内信号强度的贡献减弱，也就是说可以通过在收集透镜焦点位置处设置兴趣窗口排除非焦平面光以及杂散光的影响；另外，CCD的像元尺寸通常为几个微米，可以很容易将兴趣窗口的大小控制在微米量级。总的说来，兴趣窗口对显微系统起到的作用与物理共焦针孔的作用相同，可被称作为虚拟共焦针孔。

实施例

图1给出了采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统的光路示意图，点光源1、准直透镜2、分光镜3和显微物镜4，它们依次成光路联结，构成该系统的照明光路；扫描系统5控制被测样品的移动；显微物镜4、分光镜3、收集透镜6、CCD7依次成光路联结，构成系统的探测光路；计算机8控制扫描系统5以及CCD7，并进行数据采集、处理和图像重建。本实施例中，显微物镜4采用Olympus的平场复消色差物镜，数值孔径为0.4；扫描系统5采用德国PI公司的P-611.3S压电陶瓷三维平移台，精度为2m，有效行程为100μm；CCD7选用台湾MINTRON公司的MTV-1881EX CCD，像元尺寸为8.3μm×8.3μm，光敏面尺寸大小为6.4×4.8mm，最小照度0.02LUX，适用于微光探测。

为进一步说明非焦平面光随离焦量增大向外扩散的光学特性，对一垂直于光轴的反射镜进行纵向移动，可以得到反射镜在不同轴向位置时，CCD探测到的光强分布，如图2-图6所示。显然，随着反射镜离焦距离的增大，光强出现明显的向外扩散趋势。

物理共焦针孔的位置选择在收集透镜的焦点位置，使得非焦平面信号光不能或者不能完全被探测器接收。对于本发明所提出的显微系统，可以通过计算机对CCD采集到的二维数字图像进行处理，即加入虚拟共焦针孔的方法来实现。具体过程如下：对CCD探测到的一幅二维数字图像，在与收集透镜焦点相对应的位置上设置兴趣窗口，如图7所示，只将被黑点标注的像元上的信号值累加起来作为当前扫描点的信号强度，就可以完全排除被兴趣窗口以外像元接收到的信号光的影响，也就是说排除了非焦平面信号光以及杂散光的影响。根据MTV-1881EX型CCD的像元大小计算，图7中窗口的直径大约为41.5μm。同时由于CCD位于收集透镜的焦平面，兴趣窗口位置的选取是依据收集透镜的焦点位置，它与被测点存在共轭关系，对显微系统所起的作用与物理共焦针孔的作用相同，可将其称作虚拟共焦针孔。虚拟共焦针孔是由计算机生成的，它的大小、位置也可以用计算机根据实际实用情况进行调整，非常方便。

Claims (5)

1. 一种采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统，使用准直透镜、分光镜、显微物镜、扫描系统、收集透镜、电荷耦合器件、计算机；

其特征在于它由三部分组成：

第1部分：在中心光轴依次排列点光源(1)、准直透镜(2)、分光镜(3)和显微物镜(4)构成该系统的照明光路；

第2部分：依次排列所述显微物镜(4)、所述分光镜(3)、收集透镜(6)、电荷耦合器件CCD(7)构成系统的探测光路；

第3部分：计算机(8)控制扫描系统(5)以及电荷耦合器件(7)，构成数据采集、处理和图像重建部分。

2. 根据权利要求1所述的采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统，其特征在于：CCD的光敏面直接位于收集透镜的焦平面位置。

3. 根据权利要求1所述的采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统，其特征在于：所述光源是激光光源或普通光源。

4. 根据权利要求1所述的采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统，其特征在于：所述分光镜是普通型分光镜或二向色性分光镜。

5. 根据权利要求1所述的采用虚拟共焦针孔的共焦显微成像系统的成像方法，其特征在于它包括下述步骤：

1)在垂直于光轴的方向上进行两维调节使得信号光被收集透镜汇聚到电荷耦合器件的光敏面上，然后进行纵向调节使得CCD的光敏面位于收集透镜的焦平面位置；

2)光斑在CCD采集到的二维图像上的位置，对应于收集透镜焦点在CCD光敏面的位置，计算机在二维数字图像上的对应位置处设置虚拟共焦针孔，只将针孔内像元上的信号值累加起来作为当前扫描点的信号强度；

3)扫描系统驱动载物台作三维平动，对置于其上的被测样品进行三维扫描，可以得到不同扫描点的信号强度，计算机根据这些采集到的信号最终重构出被测样品的层析图像。

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