CN107621356B - 一种显微镜焦点偏移测量设备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种显微镜焦点偏移测量设备。包括激光器，发射光束；空间滤波模块，由两块中心轴重合布置的透镜以及位于两块透镜之间的一针孔构成，对光束进行滤波处理；可调小孔，调整视场光阑；缩束模块，缩小光束的直径；分束镜，分成透射与反射两束光；图像传感器，获取光斑在图像传感器上的位移。光束由激光器发出，依次经过空间滤波模块、可调小孔、缩束模块、分束镜和显微镜的物镜，经物镜汇聚后经过盖玻片的上下表面的反射行成两条光束，两条光束依次经过物镜、分束镜的透射成像在图像传感器上。图像传感器采用线阵CCD。采用此发明排除盖玻片下表面反射光斑的干扰，提高光斑定位的精度，提高设备稳定性和响应速度。

Description

一种显微镜焦点偏移测量设备

技术领域

本发明涉及光学显微镜自动对焦领域，具体涉及一种显微镜焦点偏移测量设备。

背景技术

焦点偏移会影响图像清晰度，甚至导致整个观测实验失败。在长时间的活细胞观测实验及样品三维层切成像期间，显微镜焦点偏移现象会变得极其显著。自动对焦技术能够有效解决这个问题。

自动对焦技术分为被动式和主动式两类。典型的被动式对焦方法是基于图像处理技术的，通过采集到的图像的某些特征来判断样品是否实现对焦。现存的被动式对焦方法对焦精度不稳定、对焦速度慢、实时性较差，且对于有一定厚度的样品会失效。主动式对焦是通过增加辅助设备实现距离的直接或间接探测来实现对焦，其关键在于焦点偏移量的测量。现存的被动式对焦方法在工业上的应用效果较好，但在对典型的实验室用的显微成像样品进行自动对焦时，则会出现一定的问题。实验室用的显微成像样品通常包含三个部分，即盖玻片、载玻片以及细胞或组织切片本身。盖玻片通常是具有一定厚度的玻璃，辅助的探测光路中不可避免地会出现多反射表面的问题，即光束在抵达盖玻片上下表面后会分别产生一次反射，又因标准的盖玻片厚度较小，故探测的传感器上会形成两个相距很近的光斑。若自动对焦系统使用的探测器为非成像器件，系统无法辨别盖玻片的两个表面，因而无法正常工作；若自动对焦系统使用的探测器为成像器件，但进行数据处理时使用传统的图像处理方法，则会产生较大的误差，使得对焦精度不稳定，对焦误差大。

发明内容

本发明要解决的问题在于提供一种显微镜焦点偏移测量设备，排除盖玻片下表面反射光斑的干扰，提高光斑定位的精度，提高设备稳定性和响应速度。

为解决上述问题，本发明提供一种显微镜焦点偏移测量设备，为达到上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种显微镜焦点偏移测量设备，包括：激光器，发射光束；空间滤波模块，对光束进行滤波处理；可调小孔，调整视场光阑；缩束模块，缩小光束的直径；分束镜，分成透射与反射两束光；图像传感器，获取光斑在图像传感器上的位移；光束由激光器发出，依次经过空间滤波模块、可调小孔、缩束模块、分束镜和显微镜的物镜，经物镜汇聚后经过盖玻片的上下表面的反射形成两条光束，两条光束依次经过物镜、分束镜的透射成像在图像传感器上。

采用上述技术方案的有益效果是：针对现存的自动对焦技术在对典型的实验室用的显微成像样品进行自动对焦存在较大误差的现象，本发明提供了一种基于图像传感器的多表面焦点偏移测量方案，并在此基础上利用基于加权质心法的改进算法。基于加权质心法的改进算法能够有效地捕捉到盖玻片的上表面反射光斑，排除盖玻片下表面反射光斑的干扰，在光斑定位精度上有极大的提高。整个测量方法具有精度高、稳定性好、响应速度快。

作为本发明的进一步改进，图像传感器采用线阵CCD。

采用上述技术方案的有益效果是：相较于常用的面阵CCD，线阵CCD具有成像速度快、数据处理简单、成本低廉等优势。

作为本发明的更进一步改进，空间滤波模块由两块中心轴重合布置的透镜以及位于两块透镜之间的一针孔构成。

采用上述技术方案的有益效果是：结构简洁，针孔也进一步起到空间滤波作用，不允许其他空间频率的光通过，空间滤波是一种采用滤波处理的影像增强方法。其理论基础是空间卷积和空间相关，可以改善影像质量，可以增大光束的直径。

作为本发明的又进一步改进，缩束模块为两块中心轴重合布置的透镜构成。

采用上述技术方案的有益效果是：缩束模块结构简单，可以得到极细的高质量光束。

作为本发明的又进一步改进，图像传感器与分束镜之间设置有聚焦透镜。

采用上述技术方案的有益效果是：聚焦透镜有成像作用，在图像传感器上形成光斑。

作为本发明的又进一步改进，空间滤波模块与缩束模块之间设有第一反射镜，分束镜与物镜之间设有第二反射镜。

采用上述技术方案的有益效果是：反射镜可以改变光束的路径方向，以适应设备、显微镜的结构。

作为本发明的又进一步改进，第一反射镜与分束镜的镜面设置角度平行。

采用上述技术方案的有益效果是：第一反射镜、第二反射镜、分束镜的搭配使用，可以实现光束路径的垂直转变。

作为本发明的又进一步改进，可调小孔具备沿空间滤波模块与第一反射镜间连线方向的平移机构。

采用上述技术方案的有益效果是：使得可调小孔可以调节其离空间滤波模块与第一反射镜的远近，从而达到现场所需的空间位置。

作为本发明的又进一步改进，线阵CCD连接有数据存储模块和处理模块。

采用上述技术方案的有益效果是：数据储存模块能将线阵CCD所获取的光斑位置信息进行存储，利于显微镜焦点偏移测量设备反复进行作业，记录大量的信息。

作为本发明的又进一步改进，数据存储模块连接有统计模块。

采用上述技术方案的有益效果是：对数据存储模块大量作业记录的信息进行统计制表，直观得展现光斑位移的集中点、趋势等。

作为本发明的又进一步改进，在粗略定位聚焦时，数据存储和处理模块首先获取线阵CCD整体采集的图像，根据多个表面反射光斑来判断显微镜焦点在样品空间的位置。

采用上述技术方案的有益效果是：得到中间信息，便于后续测算。

作为本发明的又进一步改进，在精确定位聚焦时，通过对线阵CCD区域的图像获取所需要表面发射光斑的光强分布，对区域内的光强使用加权平均算法来实现焦点漂移测量。

采用上述技术方案的有益效果是：先粗略定位，后精确定位，光强的分布便于测量测算。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一种实施方式的结构示意图；

图2是本发明一种实施方式的局部结构示意图；

图3是本发明一种实施方式的局部结构示意图；

图4是本发明一种实施方式的单反射面光路示意图；

图5是本发明一种实施方式的多反射面光路示意图；

图6是本发明另一种实施方式的结构示意图；

图7是本发明一种实施方式的单反射面光斑分布图；

图8是本发明一种实施方式的多反射面光斑分布图；

图9是本发明一种实施方式的干燥状态下不同离焦量的激光光斑图；

图10是本发明一种实施方式的湿润状态下不同离焦量的激光光斑图。

1-激光器；2-空间滤波模块；3-第一透镜；4-针孔；5-第二透镜；6-可调小孔；7-缩束模块；8-第三透镜；9-第四透镜；10-分束镜；11-聚焦透镜；12-图像传感器；13-物镜；14-盖玻片；15-第一反射镜；16-第二反射镜；17-第一反射面；18-第二反射面；19-第三反射面；20-离焦反射面；21-在焦反射面；22-第二分束镜；23-第二聚焦透镜；24-面阵CCD。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明的内容做进一步的详细说明：

为了达到本发明的目的，图1示出了本发明一种实施方式的结构示意图。一种显微镜焦点偏移测量设备，包括：发射光束的激光器1；空间滤波模块2对光束进行滤波处理；可调小孔6调整视场光阑；缩束模块7缩小光束的直径；分束镜10分成透射与反射两束光；图像传感器12获取光斑在图像传感器12上的位移；光束由激光器1发出，依次经过空间滤波模块2、可调小孔6、缩束模块7、分束镜10和显微镜的物镜13，经物镜13汇聚后经过盖玻片14的上下表面的反射形成两条光束，两条光束依次经过物镜13、分束镜10的透射成像在图像传感器12上。

采用上述技术方案的有益效果是：针对现存的自动对焦技术在对典型的实验室用的显微成像样品进行自动对焦存在较大误差的现象，本发明提供了一种基于图像传感器的多表面焦点偏移测量方案，并在此基础上利用基于加权质心法的改进算法。基于加权质心法的改进算法能够有效地捕捉到盖玻片的上表面反射光斑，排除盖玻片下表面反射光斑的干扰，在光斑定位精度上有极大的提高。整个测量方法具有精度高、稳定性好、响应速度快。

在本发明的另一些实施方式中，图像传感器12采用线阵CCD。

采用上述技术方案的有益效果是：相较于常用的面阵CCD，线阵CCD具有成像速度快、数据处理简单、成本低廉等优势。

在本发明的另一些实施方式中，空间滤波模块2由中心轴重合布置的第一透镜3和第二透镜5构成，且第一透镜3和第二透镜5之间具备针孔4。

采用上述技术方案的有益效果是：结构简洁，针孔也进一步起到空间滤波作用，不允许其他空间频率的光通过，空间滤波是一种采用滤波处理的影像增强方法。其理论基础是空间卷积和空间相关，可以改善影像质量，可以增大光束的直径。

在本发明的另一些实施方式中，缩束模块7为中心轴重合布置的第三透镜8和第四透镜9构成。

采用上述技术方案的有益效果是：缩束模块结构简单，可以得到极细的高质量光束。

在本发明的另一些实施方式中，图像传感器12与分束镜10之间设置有聚焦透镜11。

采用上述技术方案的有益效果是：聚焦透镜有成像作用，在图像传感器上形成光斑。

在本发明的另一些实施方式中，空间滤波模块2与缩束模块7之间设有第一反射镜15，分束镜10与物镜13之间设有第二反射镜16。

采用上述技术方案的有益效果是：反射镜可以改变光束的路径方向，以适应设备、显微镜的结构。

在本发明的另一些实施方式中，第一反射镜15与分束镜10的镜面设置角度平行。

采用上述技术方案的有益效果是：第一反射镜、第二反射镜、分束镜的搭配使用，可以实现光束路径的垂直转变。

作为本发明的又进一步改进，可调小孔6具备沿空间滤波模块2与第一反射镜15间连线方向的平移机构。

采用上述技术方案的有益效果是：使得可调小孔可以调节其离空间滤波模块与第一反射镜的远近，从而达到现场所需的空间位置。

作为本发明的又进一步改进，线阵CCD连接有数据存储模块和处理模块。

采用上述技术方案的有益效果是：数据储存模块能将线阵CCD所获取的光斑位置信息进行存储，利于显微镜焦点偏移测量设备反复进行作业，记录大量的信息。

作为本发明的又进一步改进，数据存储模块连接有统计模块。

采用上述技术方案的有益效果是：对数据存储模块大量作业记录的信息进行统计制表，直观得展现光斑位移的集中点、趋势等。

作为本发明的又进一步改进，图像传感器12可以为线阵CCD，在粗略定位聚焦时，数据存储和处理模块首先获取线阵CCD整体采集的图像，根据多个表面反射光斑来判断显微镜焦点在样品空间的位置。

采用上述技术方案的有益效果是：得到中间信息，便于后续测算。

作为本发明的又进一步改进，在精确定位聚焦时，通过对线阵CCD特定区域的图像获取所需要表面发射光斑的光强分布，对区域内的光强使用加权平均算法来实现焦点漂移测量。

采用上述技术方案的有益效果是：先粗略定位，后精确定位，光强的分布便于测量测算。

作为本发明的又进一步改进，如图6所示，在分束镜10沿光束前进方向后设置有第二分束镜22，一束光束继续沿先前的方向通过第二分束镜22再一次到达聚焦透镜11和图像传感器12。另一束光束经过第二聚焦透镜23到达面阵CCD24。经第二分束镜22分束的两束光束互成垂直。

采用上述技术方案的有益效果是：用来进行实验对照，验证线阵CCD焦点偏移测量结果的准确性。如图4所示，表现的仅有单反射面的情况下光束的境况，第三反射面19的反射光依次经过物镜13、聚焦透镜11到达图像传感器12。如图5所示，表现的有双反射面的情况下光束的境况，第一反射面17和第二反射面18的反射光依次经过物镜13、聚焦透镜11到达图像传感器12。第一反射面17即可代表盖玻片14的上表面，第二反射面18即可代表盖玻片14的下表面。

测量光路图如图2所示。粗实线代表样品在焦状态下的经在焦反射面21的反射光线，粗虚线代表样品离焦状态下经离焦反射面20的反射光线。激光器1出射的光束经分束镜10反射到物镜13，经物镜13边缘入射后汇聚到盖玻片14，后经盖玻片14表面反射和分束镜10透射，最后通过聚焦透镜11汇聚到图像传感器12的感光面上。

在图2、图3中，假定f1为物镜13的焦距，f2为聚焦透镜11的焦距，δ为激光光束偏离光轴的偏心距，Δh为样品的离焦量，Δx为光斑在图像传感器12上移动的距离，由图可推导出如下关系：

样品离焦时的反射光线相对于样品在焦时的反射光线有一个偏移：

经物镜13出射的光线与光轴的夹角β可表示为：

而光斑中心在图像传感器12上移动的距离为：

综合(1)(2)(3)式可得到光斑在图像传感器12上的位移Δx与系统离焦量Δh之间的关系可表述为：

因此，在系统各参数不变的情况下，只要获取光斑在图像传感器12上的位移，就可以求得系统的离焦量。

传统的光斑处理算法针对这种图像会产生很大的误差。

针对多反射表面的特殊性和样品漂移通常极其细微的特性，本发明提出了一种基于加权质心法的改进算法，其处理过程具体如下：

(1)针对在焦图像，获取其盖玻片14上表面对应光斑的中心位置x₀；

(2)计算在±10μm的焦点偏移过程中，上表面光斑中心的移动量Δx；

(3)考虑到光斑并不是一个像素点，而是具有一定大小的圆形斑点，因此根据实际情况确定一个窗口尺寸系数β；

(4)构建计算所用的窗口[x_a，x_b]，其中

(5)针对窗口内的光斑，使用平方加权质心法计算光斑中心位置，并将该光斑中心位置作为盖玻片14上表面对应的光斑中心的实际位置；

窗口质心法的计算公式如下：

其中i＝a,a+1,a+2,...b。X为光斑质心的坐标值，x_i为第i个像素的位置，f(x_i)为第i个像素的灰度值大小。

图4、图5分别代表的是单反射表面和双反射表面的焦点偏移测量示意图。图4与图7中的光斑对应，图5与图8中的光斑对应。

在样品干燥和样品湿润的情况下，使用20X物镜13观测到的伺服电机从-10μm开始移动到10μm时线阵CCD记录的光斑数据分别如图9、图10所示。

在样品湿润的情况下，盖玻片上表面反射比迅速降低，有效信号大幅度衰减，系统信噪比很低。即图10比图9区别明显的波形图段，这种情况下传统的算法效果较差，而本发明中利用的算法能够有效地避免这种噪声的干扰。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种显微镜焦点偏移测量设备，其特征在于，包括：

激光器，发射光束；

空间滤波模块，对光束进行滤波处理；

可调小孔，调整视场光阑；

缩束模块，缩小光束的直径；

分束镜，分成透射与反射两束光；

图像传感器，获取光斑在图像传感器上的位移；

所述光束由激光器发出，依次经过空间滤波模块、可调小孔、缩束模块、分束镜和显微镜的物镜，经物镜汇聚后经过盖玻片的上下表面的反射形成两条光束，两条光束依次经过物镜、分束镜的透射成像在图像传感器上；其中，

所述显微镜焦点偏移测量设备利用基于加权质心法的改进算法来有效地捕捉到盖玻片的上表面反射光斑，排除盖玻片下表面反射光斑的干扰，基于加权质心法的改进算法包括：

(1)针对在焦图像，获取其盖玻片上表面对应光斑的中心位置x₀；

(2)计算在±10μm的焦点偏移过程中，上表面光斑中心的移动量Δx；

(3)考虑到光斑并不是一个像素点，而是具有一定大小的圆形斑点，根据实际情况确定一个窗口尺寸系数β；

(4)构建计算所用的窗口[x_a,x_b]，其中

(5)针对窗口内的光斑，使用平方加权质心法计算光斑中心位置，并将该光斑中心位置作为盖玻片上表面对应的光斑中心的实际位置；

窗口质心法的计算公式如下：

其中i＝a,a+1,a+2,...b，X为光斑质心的坐标值，x_i为第i个像素的位置，f(x_i)为第i个像素的灰度值大小。

2.根据权利要求1所述的一种显微镜焦点偏移测量设备，其特征在于：所述图像传感器采用线阵CCD。

3.根据权利要求1所述的一种显微镜焦点偏移测量设备，其特征在于：所述空间滤波模块由两块中心轴重合布置的透镜以及位于两块透镜之间的一针孔构成。

4.根据权利要求1所述的一种显微镜焦点偏移测量设备，其特征在于：所述缩束模块为两块中心轴重合布置的透镜构成。

5.根据权利要求1所述的一种显微镜焦点偏移测量设备，其特征在于：所述图像传感器与分束镜之间设置有聚焦透镜。

6.根据权利要求1所述的一种显微镜焦点偏移测量设备，其特征在于：所述空间滤波模块与缩束模块之间设有第一反射镜，所述分束镜与物镜之间设有第二反射镜

7.根据权利要求6所述的一种显微镜焦点偏移测量设备，其特征在于：所述可调小孔具备沿空间滤波模块与第一反射镜间连线方向的平移机构。

8.根据权利要求2所述的一种显微镜焦点偏移测量设备，其特征在于：所述线阵CCD连接有数据存储和处理模块。

9.根据权利要求8所述的一种显微镜焦点偏移测量设备，其特征在于：在粗略定位聚焦时，数据存储和处理模块首先获取线阵CCD整体采集的图像，根据多个表面反射光斑来判断显微镜焦点在样品空间的位置。

10.根据权利要求9所述的一种显微镜焦点偏移测量设备，其特征在于：在精确定位聚焦时，通过对线阵CCD区域的图像获取所需要表面发射光斑的光强分布，对区域内的光强使用基于加权质心法的改进算法来实现焦点漂移测量。