JP2018004777A - 光シート顕微鏡、及び、光シート顕微鏡の制御方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることが可能な光シート顕微鏡の技術を提供する。【解決手段】光シート顕微鏡100は、対物レンズ7と、対物レンズ7の光軸方向とは異なる方向からサンプルSに光シートを照射するシート照明光学系4と、光シートLSが形成される光シート面と対物レンズ7との相対位置を対物レンズ7の光軸方向に調整する第1の調整手段であるZ駆動部8と、光シート面とサンプルSとの相対位置を対物レンズ7の光軸方向に調節する第2の調節手段であるステージ6と、ステージ6により光シート面とサンプルSとの相対位置を変化させたとき対物レンズ7を介して検出される光シート面からの光に基づいてZ駆動部8を制御する制御装置20と、を備える。【選択図】図1
Description
本発明の開示は、光シート顕微鏡、及び、光シート顕微鏡の制御方法に関する。
蛍光顕微鏡の分野では、対物レンズの光軸に直交する方向からサンプルにレーザ光を照射して、サンプル中に対物レンズの光軸と直交する光シートを形成する技術が知られている。この技術を用いた光シート顕微鏡は、例えば、特許文献1、特許文献2に記載されていて、蛍光の退色を抑えてサンプルの良好な三次元立体像を高速に生成することができるという大きなメリットを有している。
近年では、この技術の用途は、蛍光タンパクをターゲット分子に標識したゼブラフィッシュのような生物の立体像を得るといった用途に限られない。この技術は、スフェロイド、オルガノイドのような3次元培養細胞の3次元立体像を取得し、画像解析技術を利用して薬効の評価を行う、所謂、“創薬スクリーニング”への適用を目的とした技術としても注目される等、幅広いアプリケーションへの応用が期待されている。
光シート顕微鏡は通常、サンプルの3次元立体像を得るため、光シートとサンプルを観察光軸(対物レンズの光軸)に沿って相対的に移動させながら、複数の断層像を取得する。多くの場合、光シートが対物レンズの焦点面に形成されるように設定された後、光シートと対物レンズは固定され、サンプルを光軸方向に順次移動させることで、複数の断層像が取得される。
しかしながら、この方法でサンプルの観察場所(つまり、サンプル中の光シートが形成されている面、以降、光シート面と記す)を変更すると、対物レンズと光シート面との間の媒質の構成比率(例えば、空気と培養液とサンプル内部の比率)が変化する。これにより、対物レンズと光シート面の間の光路長が変化するため、対物レンズを動かしてないにも関わらず対物レンズの焦点面が光軸方向に移動し、対物レンズの焦点面が光シート面に一致しなくなってしまう。また、サンプル内部の屈折率分布によっても焦点面の移動量が変化してしまう。そして、このズレが及ぼす影響は、三次元立体像の光学的な分解能を上げようとすればするほど、つまり、光シートの厚さを薄くし、対物レンズの開口数を大きくすればするほど、焦点深度は浅くなるため大きくなる。
上述した特許文献1、特許文献2には、観察前に観察対象物を用いてキャリブレーションを行うことで、対物レンズの焦点面のズレを補正するデータを作成する技術が記載されている。この技術を用いることで、対物レンズの焦点面と光シート面のズレをある程度抑えることができる。
ただし、サンプルの屈折率が内部で急峻な変化を有する場合などには、十分な精度でズレを抑制することは難しい。キャリブレーションにおいてより多くの画像を取得することで補正精度を改善することは可能であるが、多くの画像を取得すると、キャリブレーションに時間がかかってしまう。また、キャリブレーションによってサンプルがダメージを受けてしまう虞がある。
以上のような実情を踏まえ、本発明の一側面は、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることが可能な光シート顕微鏡、及び、光シート顕微鏡の制御方法を提供することを目的とする。
本発明の一側面に係る光シート顕微鏡は、対物レンズと、前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射する照明光学系と、前記光シートが形成される光シート面と前記対物レンズとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整する第1の調整手段と、前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調節する第2の調節手段と、前記第2の調節手段により前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を変化させたとき前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記第1の調整手段を制御する制御装置と、を備える。
本発明の別の側面に係る対物レンズを備える光シート顕微鏡の制御方法は、前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射し、前記光シートが形成された光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整し、前記光シート面と前記サンプルとの相対位置が調整される度に前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記光シート面と前記対物レンズとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整し、前記光シートが照射された前記サンプルの画像を取得する。
本発明の一側面によれば、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることが可能な光シート顕微鏡、及び、光シート顕微鏡の制御方法を提供することができる。
[第1の実施形態]
図1は、本実施形態に係る光シート顕微鏡100の構成を例示した図である。光シート顕微鏡100は、培養液、透明化溶液などの媒質Mに浸されているサンプルSの断層像を取得する装置であり、サンプルSは、例えば、蛍光色素により標識されていた生体細胞である。サンプルSは、ステージ6に載置された、例えばキュベットなどのサンプル容器5に収容されている。
図1は、本実施形態に係る光シート顕微鏡100の構成を例示した図である。光シート顕微鏡100は、培養液、透明化溶液などの媒質Mに浸されているサンプルSの断層像を取得する装置であり、サンプルSは、例えば、蛍光色素により標識されていた生体細胞である。サンプルSは、ステージ6に載置された、例えばキュベットなどのサンプル容器5に収容されている。
光シート顕微鏡100は、レーザ1と、光ファイバー2と、シート照明光学系4と、ステージ6と、乾燥系の対物レンズ7と、Z駆動部8と、結像レンズ9と、ダイクロイックミラー10と、エミッションフィルタ11と、撮像装置12を備える。
シート照明光学系4は、例えば、コレクタレンズとシリンドリカルレンズを含み、対物レンズ7の光軸方向とは異なる方向からサンプルSに光シートを照射する。より具体的には、シート照明光学系4は、シート照明光学系4の出射光軸が対物レンズ7の光軸と略直交するように配置されていて、対物レンズ7の光軸と略直交する方向からサンプルSに光シートLSを照射するように構成されている。ここで、光シートとはシート形状の照明領域を形成する照明光のことである。光シートLSは、サンプルS内で対物レンズ7の光軸方向に薄いシート形状を有する。また、略直交とは、直交した状態から当業者が設定上又は製造上の誤差と認識し得るような範囲をいう。
ステージ6は、対物レンズ7の光軸方向へ移動する電動ステージであり、光シート面とサンプルSとの相対位置を対物レンズ7の光軸方向に調整する第2の調整手段である。ステージ6の移動は後述する制御装置20によって制御される。
Z駆動部8は、対物レンズ7を対物レンズ7の光軸方向に動かす電動部であり、光シートLSが形成される光シート面と対物レンズ7との相対位置を対物レンズ7の光軸方向に調整する第1の調整手段である。Z駆動部8を介した対物レンズ7の移動は後述する制御装置20によって制御される。
ダイクロイックミラー10は、レーザ光を反射することで、レーザ光と蛍光を分離する。エミッションフィルタ11は、レーザ光を遮断し蛍光を透過させる。ダイクロイックミラー10及びエミッションフィルタ11により、撮像装置12へのレーザ光の入射が制限される。
撮像装置12は、光シートLSが照射されたサンプルSの画像を、対物レンズ7を介して取得する。撮像装置12は、例えば、CCD(Charge Coupled Device)、CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)などの2次元イメージセンサを備えたデジタルカメラである。撮像装置12は、受光面S1を有し、対物レンズ7の前側焦点位置が受光面S1に投影されるように配置されている。図1に示す受光面S1上の位置P1は、対物レンズ7の前側焦点位置が投影される位置、即ち、対物レンズ7の前側焦点位置と光学的に共役な位置である。
光シート顕微鏡100は、さらに、ダイクロイックミラー10の反射光路(ダイクロイックミラー10により撮像装置12と対物レンズ7の間の光路から分岐した光路)上に、ビームスプリッタ13と、2つの遮光板(ピンホール板14、ピンホール板16)と、2つの光検出器(光検出器15、光検出器17)を備える。
ビームスプリッタ13は、ダイクロイックミラー10で反射したレーザ光を50:50の割合で分離する。ピンホール板14及び光検出器15は、ビームスプリッタ13で分岐した一方の光路上に配置され、ピンホール板16及び光検出器17は、ビームスプリッタ13で分岐した他方の光路上に配置されている。
ピンホール板14は、開口を有する第1の遮光板であり、対物レンズ7の前側焦点位置が投影される位置P2よりも後方に配置されている。一方、ピンホール板16は、開口を有する第2の遮光板であり、対物レンズ7の前側焦点位置が投影される位置P3よりも前方に配置されている。位置P2及び位置P3は、対物レンズ7の前側焦点位置と光学的に共役な位置であり、換言すると、撮像装置12の受光面S1(位置P1)に対応する位置である。以降では、位置P2及び位置P3のことを、それぞれ必要に応じて基準位置とも記す。ここで、前方とは光の進行方向を基準にして手前側のことであり、後方とは光の進行方向を基準にして奥側のことである。
光検出器15は、ピンホール板14を通過した光シート面からの光を検出する第1の光検出器であり、専らレーザ光を検出する。光検出器17は、ピンホール板16を通過した光シート面からの光を検出する第2の光検出器であり、専らレーザ光を検出する。光検出器15及び光検出器17は、例えば、光電子増倍管(PMT:Photomultiplier Tube)であり、検出光量に応じた信号を出力する。
光シート顕微鏡100は、さらに、制御装置20を備える。制御装置20は、サンプルSの複数の断層像を取得する断層像取得処理を実行するように構成されている。断層像取得処理の詳細については後述するが、その概要は次のとおりである。
断層像取得処理では、制御装置20は、光シートをサンプルSの異なる位置に照射して複数の断層像を取得するために、ステージ6を制御して光シート面とサンプルSとの相対位置を変化させる。このとき、光シート面と対物レンズ7の間の媒質(空気と媒質MとサンプルS内部を含む)の屈折率分布が変化するため、対物レンズ7を動かしてないにも関わらず対物レンズ7の焦点面が光軸方向に動いてしまう。従って、ステージ6を制御するだけでは、光シート面と対物レンズの焦点面にズレが生じてしまうため、制御装置20は、ステージ6を制御すると、さらに、対物レンズ7を介して検出される光シート面からの光に基づいて、Z駆動部8を制御し、光シート面と対物レンズ7の相対位置を調整する。より具体的には、対物レンズ7の焦点面を光シート面に近づけることで、これらの位置が合うようにZ駆動部8を制御する。これにより、対物レンズ7の焦点面と光シート面が高精度に合った状態で、複数の断層像を取得することができる。
図2は、制御装置20のハードウェアの構成を例示した図である。制御装置20は、例えば、標準的なコンピュータであり、プロセッサ21、メモリ22、入出力インターフェース23、ストレージ24、及び、可搬記録媒体26が挿入される可搬記録媒体駆動装置25を備え、これらがバス27によって相互に接続されている。なお、図2は、制御装置20のハードウェア構成の一例であり、制御装置20はこの構成に限定されるものではない。
プロセッサ21は、例えば、CPU(Central Processing Unit)、MPU(Micro Processing Unit)、DSP(Digital Signal Processor)などであり、プログラムを実行してプログラムされた処理、例えば、上述した断層像取得処理を行う。メモリ22は、例えば、RAM(Random Access Memory)であり、プログラムの実行の際に、ストレージ24または可搬記録媒体26に記録されているプログラムまたはデータを一時的に記憶する。
入出力インターフェース23は、制御装置20以外の装置(例えば、ステージ6、Z駆動部8、光検出器15、光検出器17など)と信号をやり取りする回路である。ストレージ24は、例えば、ハードディスク、フラッシュメモリであり、主に各種データやプログラムの記録に用いられる。可搬記録媒体駆動装置25は、光ディスクやコンパクトフラッシュ(登録商標)等の可搬記録媒体26を収容するものである。可搬記録媒体26は、ストレージ24を補助する役割を有する。
図3は、断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。以下、図3を参照しながら、光シート顕微鏡100で行われる断層像取得処理について具体的に説明する。
光シート顕微鏡100は、まず、断層像を取得する高さ範囲の指定を受け付ける(ステップS101)。ここでは、利用者が図示しない入力装置を用いて断層像を取得する高さ範囲を入力することで、制御装置20が高さ範囲の指定を受け付ける。制御装置20は、さらに、受け付けた高さ範囲に基づいて、断層像を取得する位置、つまり、サンプルS中における光シート面の位置を決定する。
次に、光シート顕微鏡100は、サンプルSに光シートLSを照射し(ステップS102)、サンプルSの画像を取得する(ステップS103)。ここでは、サンプルS中における光シート面の位置は特に限定されない。このため、光シートLSを任意の位置に照射し、サンプルSの画像、つまり、光シート面の画像を、撮像装置12で取得すればよい。
その後、光シート顕微鏡100は、取得した画像に基づいて、合焦判定を行う(ステップS104)。ここでは、対物レンズ7の焦点面が光シート面に合っているか否かを、例えば、制御装置20が画像のコントラストに基づいて判定する。また、制御装置20が判定する代わりに、人間が画像を目視することで判定し、その判定結果に従って制御装置20が合焦状態か否かを判定してもよい。
合焦状態に無いと判定されると(ステップS104NO)、光シート顕微鏡100は、光シート面と対物レンズ7の相対位置を対物レンズ7の光軸方向に調整する(ステップS105)。ここでは、制御装置20がZ駆動部8を制御して光シート面と対物レンズ7の相対位置を調整する。その後、再びサンプルSの画像を取得する(ステップS103)。そして、合焦状態にあると判定されるまで(ステップS104YES)、ステップS103からステップS105の処理を繰り返す。なお、この合焦判定処理は取得した画像全体に対して行う必要はない。撮像装置12の部分的な撮像素子で取得された画像の一部分に対して行っても良い。
合焦状態にあると判定されると、光シート顕微鏡100は、合焦評価値を算出する(ステップS106)。ここでは、制御装置20が光シート面で散乱したレーザ光を検出した光検出器15及び光検出器17からの出力信号に基づいて所定の演算を行うことで、合焦評価値を算出する。合焦評価値は、対物レンズ7の焦点面と光シート面の一致度合いに応じて変化する値である。合焦評価値は、光検出器15からの出力信号値をAとし、光検出器17からの出力信号値をBとすると、特にこれに限定されないが、例えば、(A−B)/(A+B)で算出される。
その後、光シート顕微鏡100は、ステップS106で算出した値を基準値として記録する(ステップS107)。ステップS106で算出した値は、合焦状態において算出される合焦評価値であり、合焦評価値がステップS106で算出した値に一致しているかによって合焦状態にあるか否かを判断することが可能である。このため、ステップS107では、ステップS106で算出した値を後述するステップで利用するために、基準値として記録する。
次に、光シート顕微鏡100は、光シート面が初期位置に移動するように、光シート面とサンプルSの相対位置を対物レンズ7の光軸方向に調整する(ステップS108)。ここでは、制御装置20は、ステージ6を制御して、ステップS101で決定した断層像を取得する位置のうちの一つである初期位置に光シート面を動かす。
その後、光シート顕微鏡100は、合焦評価値を算出し(ステップS109)、合焦評価値がステップS107で記録した基準値に実質的に一致しているか否かを判定する(ステップS110)。この処理は、ステップS108でのステージ6の移動により対物レンズ7の焦点面が移動している可能性があるために行われる。なお、ステップS110の処理は、合焦判定が行われる点はステップS104と同様であるが、光検出器15及び光検出器17からの出力信号に基づいて合焦判定を行う点が、撮像装置12で取得した画像に基づいて合焦判定を行うステップS104とは異なる。また、制御装置20は、合焦評価値が基準値を含む所定範囲内の値であれば、合焦評価値が基準値に実質的に一致していると判定してもよい。
ステップS110で合焦評価値が基準値に一致しないと判定されると(ステップS110NO)、光シート顕微鏡100は、光シート面と対物レンズの相対位置を対物レンズ7の光軸方向に調整する(ステップS111)。ここでは、制御装置20は、合焦評価値が基準値に近づくようにZ駆動部8を制御して、光シート面と対物レンズ7の相対位置を調整する。
光シート顕微鏡100は、その後、再び合焦評価値を算出する(ステップS109)。そして、合焦評価値が基準値に実質的に一致していると判定されるまで、即ち、合焦評価値が基準値を含む所定範囲内の値になるまで(ステップS110YES)、ステップS109からステップS111の処理を繰り返す。即ち、制御装置20は、ステップS109からステップS111において、光検出器15からの出力信号と光検出器17からの出力信号に基づいて、Z駆動部8を制御する。
そして、合焦評価値が基準値に実質的に一致していると判定されると(ステップS110YES)、光シート顕微鏡100は、サンプルSの断層像を取得する(ステップS112)。これにより、対物レンズ7の焦点面と光シート面が合った状態で断層像が取得される。
その後、光シート顕微鏡100は、光シート面が最終位置まで移動済みか否かを判定する(ステップS113)。ここでは、制御装置20は、ステップS101で決定した断層像を取得する位置のうちの一つである最終位置にまで光シート面が移動済みか否かを判定する。
最終位置まで移動していないと判定すると、光シート顕微鏡100は、光シート面とサンプルSの相対位置を対物レンズ7の光軸方向に調整する(ステップS114)。ここでは、制御装置20は、ステージ6を制御して、ステップS101で決定した断層像を取得する位置のうちの別の位置に光シート面を移動する。その後、光シート顕微鏡100は、ステップS109からステップS114の処理を繰り返し、ステップS113で光シート面が最終位置まで移動済みと判定されると、図3に示す断層像取得処理を終了する。
光シート顕微鏡100では、光シート面とサンプルSの相対位置を変更後に取得される光検出器からの出力信号に基づいて合焦状態が判定される。このため、人間が画像に基づいて合焦状態を判定する場合よりも、光シート面を対物レンズ7の焦点面に素早く合わせることができる。制御装置が画像に基づいて合焦状態を判定する場合と比較しても計算量が少ないため、光シート面を対物レンズ7の焦点面に素早く合わせることができる。
また、光シート顕微鏡100では、2つの検出器と2つのピンホール板の組み合わせによって、いわゆる、前ピン状態と後ピン状態とを判別することができる。これにより、対物レンズ7の焦点面と光シート面の間でズレが生じている方向を知ることが可能であり、光シート面と対物レンズの相対位置を調整する方向を特定することができる。この点も、光シート面を対物レンズ7の焦点面に素早く合わせることに寄与する。
さらに、光シート顕微鏡100では、光シート面とサンプルSの相対位置を変更する度に、その相対位置で実際に検出された信号に基づいて合焦処理が行われる。このため、キャリブレーションデータに基づいて合焦処理を行う場合よりも、光シート面を対物レンズ7の焦点面に高精度にあわせることができる。
以上のように、光シート顕微鏡100によれば、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。なお、本実施形態では、サンプルSを対物レンズ7の光軸の方向に動かしたときのみを説明したが、サンプルSが大きなときは、シート光を照明光軸の方向に動かして撮像する必要がある。この場合、サンプルSの位置によって屈折率が変化し対物レンズ7の焦点面がずれる可能性があるが、このときも本方法で光シート面に合焦させることが可能である。また、光シート顕微鏡100では、制御装置20がソフトウェア処理により合焦評価値を算出してZ駆動部8を制御する例を示したが、例えば、制御装置20の代わりにコンパレータなどの回路によって合焦評価値を評価して評価結果に応じた制御信号をZ駆動部8へ出力してもよい。この場合、ソフトウェア処理よりも更に高速に合焦処理を行うことができる。また、光シート顕微鏡100では、ピンホール板14及びピンホール板16を備える例を示したが、ピンホール板14及びピンホール板16のそれぞれの代わりに、例えば、図4に示すピンホールアレイ19を有する遮光板18を備えてもよい。遮光板18を用いることで、サンプルS中の多点からの光を検出することができる。これにより、サンプルS中の特異な点(散乱が少ない場所)が及ぼす影響を軽減することができるため、より信頼性の高い合焦判定結果を得ることができる。
[第2の実施形態]
図5は、本実施形態に係る光シート顕微鏡200の構成を例示した図である。光シート顕微鏡200は、シート照明光学系4の代わりに、シート照明光学系31、スキャンミラー32、リレー光学系33、ミラー34、及びスキャンレンズ35を備える点、ステージ6の代わりにステージ6aを備える点、制御装置20の代わりに制御装置30を備える点が、光シート顕微鏡100とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡100と同様である。
図5は、本実施形態に係る光シート顕微鏡200の構成を例示した図である。光シート顕微鏡200は、シート照明光学系4の代わりに、シート照明光学系31、スキャンミラー32、リレー光学系33、ミラー34、及びスキャンレンズ35を備える点、ステージ6の代わりにステージ6aを備える点、制御装置20の代わりに制御装置30を備える点が、光シート顕微鏡100とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡100と同様である。
光シート顕微鏡200では、シート照明光学系31が形成した光シートは、スキャンミラー32、リレー光学系33、ミラー34、及びスキャンレンズ35を介して、対物レンズ7の光軸と略直交する方向からサンプルSに照射される。また、スキャンミラー32の振り角を変更することで、サンプルSに照射される光シートLSは、対物レンズ7の光軸方向に移動する。従って、光シート顕微鏡200では、スキャンミラー32は、光シート面とサンプルSとの相対位置を対物レンズ7の光軸方向に調整する第2の調整手段である。スキャンミラー32の振り角は制御装置30によって制御される。このため、ステージ6aは、制御装置30によって制御可能な電動ステージでなくてもよい。
制御装置30は、ステージ6の代わりにスキャンミラー32に接続されている点が制御装置20と異なるが、制御装置30のハードウェア構成は、制御装置20のハードウェア構成と同様である。また、制御装置30は、サンプルSの複数の断層像を取得する図3に示す断層像取得処理を実行するように構成されている点も制御装置20と同様である。ただし、制御装置30は、制御装置20とは異なり、スキャンミラー32を制御することで光シート面とサンプルSとの相対位置を調整する(ステップS108、ステップS114)。
光シート顕微鏡200によっても、光シート顕微鏡100と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、光シート顕微鏡200によれば、サンプルSを移動することなく光シート面とサンプルSの相対位置を変更することができる。このため、サンプルSの移動によって生じる刺激(例えば、加速度変化など)を与えることなく、複数の断層像を取得して、三次元立体像を生成することができる。
[第3の実施形態]
図6は、本実施形態に係る光シート顕微鏡300の構成を例示した図である。光シート顕微鏡300は、レボルバ42に倍率の異なる複数の対物レンズ(対物レンズ7、対物レンズ41)が装着されている点、2つの遮光板(ピンホール板43、ピンホール板45)が基準位置(位置P2、位置P3)からの距離が変化する様に光路に沿って可動自在に設けられている点、2つの遮光板を光路に沿って動かす2つの駆動機構(駆動機構44、駆動機構46)を備える点、制御装置20の代わりに制御装置40を備える点が、光シート顕微鏡100とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡100と同様である。
図6は、本実施形態に係る光シート顕微鏡300の構成を例示した図である。光シート顕微鏡300は、レボルバ42に倍率の異なる複数の対物レンズ(対物レンズ7、対物レンズ41)が装着されている点、2つの遮光板(ピンホール板43、ピンホール板45)が基準位置(位置P2、位置P3)からの距離が変化する様に光路に沿って可動自在に設けられている点、2つの遮光板を光路に沿って動かす2つの駆動機構(駆動機構44、駆動機構46)を備える点、制御装置20の代わりに制御装置40を備える点が、光シート顕微鏡100とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡100と同様である。
駆動機構44及び駆動機構46は、ピンホール板43及びピンホール板45の位置を調整する第3の調整する手段であり、駆動機構44及び駆動機構46を介したピンホール板43及びピンホール板45の移動は、制御装置40によって制御される。
制御装置40は、駆動機構44及び駆動機構46に接続されている点が制御装置20と異なるが、制御装置40のハードウェア構成は、制御装置20のハードウェア構成と同様である。また、制御装置40は、図3に示す断層像取得処理の代わりに、図7に示す断層像取得処理を実行する。
図7は、断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。以下、図7を参照しながら、光シート顕微鏡300で行われる断層像取得処理について具体的に説明する。
光シート顕微鏡300は、まず、使用する対物レンズの指定を受け付ける(ステップS301)。ここでは、利用者が図示しない入力装置を用いて対物レンズを選択することで、制御装置40が対物レンズの指定を受け付ける。
その後、光シート顕微鏡300は、指定された対物レンズに切り替える(ステップS302)。ここでは、制御装置40がレボルバ42を制御することで、レボルバ42が光路上に配置される対物レンズを指定された対物レンズに切り替える。
対物レンズが切り替ると、光シート顕微鏡300は、対物レンズの倍率に応じて、2つのピンホール板(ピンホール板43、ピンホール板45)の基準位置からの距離を変更する(ステップS303)。ここでは、制御装置40が、対物レンズの倍率に応じて駆動機構44及び駆動機構46を制御することで、2つのピンホール板の位置を調整する。より具体的には、対物レンズの倍率が大きいほど2つのピンホール板が基準位置から離れるように、2つのピンホール板の位置が調整される。これは、光シート面が投影される位置(像位置)は光シート面の位置の変化量に対物レンズの倍率の2乗を乗じた大きさで変化するためである。
以降のステップS101からステップS114については、光シート顕微鏡100で行われる図3に示す断層像取得処理と同様である。
以降のステップS101からステップS114については、光シート顕微鏡100で行われる図3に示す断層像取得処理と同様である。
光シート顕微鏡300によっても、光シート顕微鏡100と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、対物レンズの倍率に応じて遮光板の位置が調整されるため、倍率によらず安定的に合焦判定を行うことができる。さらに、ピンホール径を可変可能に構成し、光路に入れる対物レンズに最適なピンホール径に設定することで、より精度の高い焦点合わせを行うこともできる。
[第4の実施形態]
図8は、本実施形態に係る光シート顕微鏡400の構成を例示した図である。光シート顕微鏡400は、乾燥系の対物レンズ7の代わりに液浸系の対物レンズ51を備える点、ビームスプリッタ13、ピンホール板16、及び光検出器17が省略されている点、ピンホール板14の代わりにピンホール板52を備える点、制御装置20の代わりに制御装置50を備える点が、光シート顕微鏡100とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡100と同様である。
図8は、本実施形態に係る光シート顕微鏡400の構成を例示した図である。光シート顕微鏡400は、乾燥系の対物レンズ7の代わりに液浸系の対物レンズ51を備える点、ビームスプリッタ13、ピンホール板16、及び光検出器17が省略されている点、ピンホール板14の代わりにピンホール板52を備える点、制御装置20の代わりに制御装置50を備える点が、光シート顕微鏡100とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡100と同様である。
ピンホール板52は、受光面S1に対応する基準位置P2に配置されている。制御装置50は、ピンホール板52を通過した光シート面からの光を検出した光検出器15からの出力信号に基づいてZ駆動部8を制御する点が制御装置20とは異なるが、そのハードウェア構成は、制御装置20のハードウェア構成と同様である。また、制御装置50は、図3に示す断層像取得処理の代わりに、図9に示す断層像取得処理を実行する。
図9は、断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。以下、図9を参照しながら、光シート顕微鏡400で行われる断層像取得処理について具体的に説明する。
光シート顕微鏡400は、まず、断層像を取得する高さ範囲の指定を受け付ける(ステップS401)。この処理は、図3のステップS101と同様である。ここでは、制御装置50は、受け付けた高さ範囲に基づいて、断層像を取得する位置、つまり、サンプルS中における光シート面の位置を決定する。
次に、光シート顕微鏡400は、光シート面が初期位置に移動するように、光シート面とサンプルSの相対位置を対物レンズ51の光軸方向に調整する(ステップS402)。ここでは、制御装置50は、ステージ6を制御して、ステップS401で決定した断層像を取得する位置のうちの一つである初期位置に光シート面を動かす。
さらに、光シート顕微鏡400は、サンプルSに光シートLSを照射し(ステップS403)。その後、光シート顕微鏡400は、検出光量が最大となるように光シート面と対物レンズ51の相対位置を対物レンズ51の光軸方向に調整する(ステップS404)。ここでは、制御装置50は、光検出器15からの出力信号が増加するようにZ駆動部8を制御する処理を繰り返すことで、光検出器15からの出力信号に基づいて検出光量が最大となる相対位置を特定する。
光シート面と対物レンズ51の相対位置の調整が終了すると、光シート顕微鏡400は、サンプルSの断層像を取得する(ステップS405)。これにより、対物レンズ51の焦点面と光シート面が合った状態で断層像が取得される。
その後、光シート顕微鏡400は、光シート面が最終位置まで移動済みか否かを判定する(ステップS406)。ここでは、制御装置50は、ステップS401で決定した断層像を取得する位置のうちの一つである最終位置にまで光シート面が移動済みか否かを判定する。
最終位置まで移動していないと判定すると、光シート顕微鏡400は、光シート面とサンプルSの相対位置を対物レンズ51の光軸方向に調整する(ステップS407)。ここでは、制御装置50は、ステージ6を制御して、ステップS401で決定した断層像を取得する位置のうちの別の位置に光シート面を移動する。その後、光シート顕微鏡400は、ステップS404からステップS407の処理を繰り返し、ステップS406で光シート面が最終位置まで移動済みと判定されると、図9に示す断層像取得処理を終了する。
光シート顕微鏡400によっても、各相対位置で実際に出力された光検出器からの出力信号に基づいて合焦状態が判定されるため、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、光シート顕微鏡100と比較して光学系の構成がシンプルであるため、安価に装置を構成することができる。さらに、本実施形態のように液浸系対物レンズの使用したときには、高解像で画像が取得でき、また、対物レンズとサンプルとの間に空気層が存在せず屈折率差による焦点面の変動が小さいので、対物レンズの移動範囲(補正範囲)が小さくて済む。従って、より高速に焦点合わせを行うことができる。また、上記実施形態では液浸系対物レンズが使用されているが、乾燥系の対物レンズが使用されてもよい。
[第5の実施形態]
図10は、本実施形態に係る光シート顕微鏡500の構成を例示した図である。図11は、光シート顕微鏡500に含まれる撮像装置71の画素の配列を例示した図である。光シート顕微鏡500は、撮像装置12の代わりに撮像装置71を備える点、ダイクロイックミラー10、ビームスプリッタ13、ピンホール板14、光検出器15、ピンホール板16、及び光検出器17が省略されている点、制御装置20の代わりに制御装置70を備える点が、光シート顕微鏡100とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡100と同様である。
図10は、本実施形態に係る光シート顕微鏡500の構成を例示した図である。図11は、光シート顕微鏡500に含まれる撮像装置71の画素の配列を例示した図である。光シート顕微鏡500は、撮像装置12の代わりに撮像装置71を備える点、ダイクロイックミラー10、ビームスプリッタ13、ピンホール板14、光検出器15、ピンホール板16、及び光検出器17が省略されている点、制御装置20の代わりに制御装置70を備える点が、光シート顕微鏡100とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡100と同様である。
撮像装置71は、像面位相差センサを備える撮像装置であり、図11に示すように、通常画素72に加えて、位相差評価用画素73を含む点が、撮像装置12とは異なる。位相差評価用画素73は、スリット73aが形成された遮光部材73bを有している。位相差評価用画素73には、画素中心に対するスリット73aの位置が異なる2種類が存在し、2種類の画素がペアとなって利用される。
制御装置70は、位相差評価用画素73からの出力信号に基づいてZ駆動部8を制御する点が制御装置20とは異なるが、そのハードウェア構成は、制御装置20のハードウェア構成と同様である。また、制御装置70は、サンプルSの複数の断層像を取得する図3に示す断層像取得処理を実行するように構成されている点も制御装置20と同様である。ただし、制御装置70は、制御装置20とは異なり、位相差評価用画素73からの出力信号に基づいて合焦評価値の算出及び合焦判定が行われる。
光シート顕微鏡500によっても、いわゆる前ピン状態と後ピン状態とを判別することができるため、光シート顕微鏡100と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、光シート顕微鏡100と比較して光学系の構成がシンプルであるため、安価に装置を構成することができる。
[第6の実施形態]
図12は、本実施形態に係る光シート顕微鏡600の構成を例示した図である。光シート顕微鏡600は、エミッションフィルタ11がフィルタターレット82に収容されていて、ガラス板81と切り替えて使用される点、制御装置70の代わりに制御装置80を備える点が、光シート顕微鏡500とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡500と同様である。
図12は、本実施形態に係る光シート顕微鏡600の構成を例示した図である。光シート顕微鏡600は、エミッションフィルタ11がフィルタターレット82に収容されていて、ガラス板81と切り替えて使用される点、制御装置70の代わりに制御装置80を備える点が、光シート顕微鏡500とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡500と同様である。
フィルタターレット82は、光路上に配置される光学素子をエミッションフィルタ11とガラス板81の間で切り替える装置であり、切り替え動作は制御装置80によって制御される。ガラス板81は、蛍光及びレーザ光を透過する平板であり、ガラス板81は、そのガラス板81内での光路長がエミッションフィルタ11内での光路長とおよそ一致するような厚さを有する。
制御装置80は、フィルタターレット82に接続されている点が制御装置70とは異なるが、そのハードウェア構成は、制御装置70のハードウェア構成と同様である。また、制御装置80は、図3に示す断層像取得処理の代わりに、図13に示す断層像取得処理を実行する。
図13は、断層像取得処理の手順を示すフローチャートである。以下、図13を参照しながら、光シート顕微鏡600で行われる断層像取得処理について具体的に説明する。
光シート顕微鏡600は、まず、エミッションフィルタ11を光路から取り除く(ステップS701)。ここでは、制御装置80が、フィルタターレット82の回転を制御して、エミッションフィルタ11を光路から除いて、代わりに、ガラス板81を光路に挿入する。
以降のステップS101からステップS111については、光シート顕微鏡100で行われる図3に示す断層像取得処理と同様である。
以降のステップS101からステップS111については、光シート顕微鏡100で行われる図3に示す断層像取得処理と同様である。
そして、合焦評価値が基準値に実質的に一致していると判定されると(ステップS110YES)、光シート顕微鏡600は、エミッションフィルタ11を光路へ挿入する(ステップS702)。ここでは、制御装置80が、フィルタターレット82の回転を制御して、ガラス板81を光路から除いて、代わりに、エミッションフィルタ11を光路へ挿入する。
その後、光シート顕微鏡600は、サンプルSの断層像を取得し(ステップS112)、さらに、光シート面が最終位置まで移動済みか否かを判定する(ステップS113)。
最終位置まで移動していないと判定すると、光シート顕微鏡600は、エミッションフィルタ11を光路から取り除き(ステップS703)、その後、光シート面とサンプルSの相対位置を対物レンズ7の光軸方向に調整する(ステップS114)。なお、ステップS703の処理は、ステップS701と同様である。最後に、光シート顕微鏡600は、ステップS109からステップS114の処理を繰り返し、ステップS113で光シート面が最終位置まで移動済みと判定されると、図13に示す断層像取得処理を終了する。
光シート顕微鏡600によっても、光シート顕微鏡100と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、光シート顕微鏡100と比較して光学系の構成がシンプルであるため、光シート顕微鏡500と同様に、安価に装置を構成することができる。さらに、レーザ光が撮像装置71に入射する状態で合焦判定処理が行われる。このため、レーザ光に比べて微弱で且つサンプルS中の位置等によって発生量が異なる蛍光のみが撮像装置71に入射する状態で合焦判定処理が行われる光シート顕微鏡500よりも、安定的に合焦判定を行うことができる。
なお、光シート顕微鏡600では、エミッションフィルタ11とガラス板81をフィルタターレット82で切り替える例を示したが、フィルタターレット82には複数の異なる仕様のエミッションフィルタが収容されていても良く、蛍光波長に応じてエミッションフィルタをフィルタターレット82を用いて切り替えても良い。また、光シート顕微鏡600では、ガラス板81を光路に挿入した状態で合焦判定を行う例を示したが、ガラス板81の代わりにレーザ光のみが透過するバンドパスフィルタを光路に挿入した状態で合焦判定を行ってもよい。
[第7の実施形態]
図14は、本実施形態に係る光シート顕微鏡700の構成を例示した図である。光シート顕微鏡700は、撮像装置71の代わりに撮像装置12を備える点、ダイクロイックミラー10と位相差オートフォーカス(以降、AFと記す)センサ91を備える点、制御装置70の代わりに制御装置90を備える点が、光シート顕微鏡500とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡500と同様である。
図14は、本実施形態に係る光シート顕微鏡700の構成を例示した図である。光シート顕微鏡700は、撮像装置71の代わりに撮像装置12を備える点、ダイクロイックミラー10と位相差オートフォーカス(以降、AFと記す)センサ91を備える点、制御装置70の代わりに制御装置90を備える点が、光シート顕微鏡500とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡500と同様である。
位相差AFセンサ91は、セパレータレンズ92とセンサ93を備える、位相差AF処理を実行するセンサユニットであり、光検出器12と対物レンズ7の間の光路から分岐した光路上に設けられている。位相差AFセンサ91は、実質的には、光シート顕微鏡500の撮像装置71内に設けられた像面位相差センサと同等に機能する。
制御装置90は、位相差AFセンサ91に接続されている点、及び、位相差AFセンサ91からの出力信号に基づいてZ駆動部8を制御する点が制御装置70とは異なるが、そのハードウェア構成は、制御装置70のハードウェア構成と同様である。また、制御装置90は、図2に示す断層像取得処理を実行するように構成されている点も制御装置70と同様である。ただし、制御装置90は、制御装置70とは異なり、位相差AFセンサ91からの出力信号に基づいて合焦評価値の算出及び合焦判定が行われる。
光シート顕微鏡700によっても、光シート顕微鏡500と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、ダイクロイックミラー10と位相差AFセンサ91との間に凸レンズを挿入し、位相差AFセンサ91に入射する光線のNAを大きくして合焦判定の精度を向上させることも考えられる。
[第8の実施形態]
図15は、本実施形態に係る光シート顕微鏡800の構成を例示した図である。光シート顕微鏡800は、ダイクロイックミラー10の代わりにミラー94を備える点が、光シート顕微鏡100とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡100と同様である。
図15は、本実施形態に係る光シート顕微鏡800の構成を例示した図である。光シート顕微鏡800は、ダイクロイックミラー10の代わりにミラー94を備える点が、光シート顕微鏡100とは異なる。その他の点は、光シート顕微鏡100と同様である。
ミラー94は、対物レンズ7と撮像装置12の間の光路上の対物レンズ7の光軸から逸れた位置に配置されている。より詳細には、撮像装置12で検出されるべき光束を遮らない位置に配置されている。なお、顕微鏡でよく利用される2/3インチCCDカメラは、顕微鏡が本来有する視野の半分程度しか使用していないのが通常である。
光シート顕微鏡800によっても、光シート顕微鏡100と同様に、対物レンズの焦点面を光シート面に高精度に素早く合わせることができる。また、ダイクロイックミラー10を介すことなく断層像が取得されるため、光シート顕微鏡100に比べて明るい断層像を取得することができる。
上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれらに限定されるものではない。光シート顕微鏡、及びその制御方法は、特許請求の範囲に記載された発明を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
1・・・レーザ、2・・・光ファイバー、4、31・・・シート照明光学系、5・・・サンプル容器、6、6a・・・ステージ、7、41、51・・・対物レンズ、8・・・Z駆動部、9・・・結像レンズ、10・・・ダイクロイックミラー、11・・・エミッションフィルタ、12、71・・・撮像装置、13・・・ビームスプリッタ、14、16、43、45、52・・・ピンホール板、15、17・・・光検出器、18・・・遮光板、19・・・ピンホールアレイ、20、30、40、50、70、80、90・・・制御装置、21・・・プロセッサ、22・・・メモリ、23・・・入出力インターフェース、24・・・記憶装置、25・・・可搬記録媒体駆動装置、26・・・可搬記録媒体、27・・・バス、32・・・スキャンミラー、33・・・リレー光学系、34、94・・・ミラー、35・・・スキャンレンズ、42・・・レボルバ、44、46・・・駆動機構、72・・・通常画素、73・・・位相差評価用画素、73a・・・スリット、73b・・・遮光部材、81・・・ガラス板、82・・・フィルタターレット、91・・・位相差AFセンサ、92・・・セパレータレンズ、93・・・センサ、100、200、300、400、500、600、700、800、900・・・光シート顕微鏡、S・・・試料、S1・・・受光面、LS・・・光シート、M・・・媒質、P1、P2、P3・・・位置
Claims (14)
- 対物レンズと、
前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射する照明光学系と、
前記光シートが形成される光シート面と前記対物レンズとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整する第1の調整手段と、
前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調節する第2の調節手段と、
前記第2の調節手段により前記光シート面と前記サンプルとの相対位置を変化させたとき前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記第1の調整手段を制御する制御装置と、を備える
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項1に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
受光面を有し、前記対物レンズを介して前記サンプルの画像を取得する撮像装置と、
前記撮像装置と前記対物レンズの間の光路から分岐した光路上の位置であって前記受光面に対応する位置より後方に配置される、開口を有する第1の遮光板と、
前記撮像装置と前記対物レンズの間の光路から分岐した光路上の位置であって前記受光面に対応する位置より前方に配置される、開口を有する第2の遮光板と、
前記第1の遮光板を通過した前記光シート面からの光を検出する第1の光検出器と、
前記第2の遮光板を通過した前記光シート面からの光を検出する第2の光検出器と、を備え、
前記制御装置は、前記第1の光検出器からの出力信号と前記第2の光検出器からの出力信号に基づいて、前記第1の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項2に記載の光シート顕微鏡において、
前記制御装置は、前記第1の光検出器からの出力信号と前記第2の光検出器からの出力信号から算出される評価値が所定値に近づくように、前記第1の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項2又は請求項3に記載の光シート顕微鏡において、
前記第1の遮光板と前記第2の遮光板は、前記基準位置からの距離が変化する様に前記光路に沿って可動自在に設けられている
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項4に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
前記第1の遮光板と前記第2の遮光板の位置を調整する第3の調整手段を備え、
前記制御装置は、前記対物レンズの倍率に応じて、前記第3の調整手段を制御する
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項1に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
受光面を有し、前記対物レンズを介して前記サンプルの画像を取得する撮像装置と、
前記撮像装置と前記対物レンズの間の光路から分岐した光路上の位置であって前記受光面に対応する位置に配置される、開口を有する遮光板と、
前記遮光板を通過した前記光シート面からの光を検出する光検出器と、を備え、
前記制御装置は、前記光検出器からの出力信号に基づいて、前記第1の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項6に記載の光シート顕微鏡において、
前記制御装置は、前記光検出器からの出力信号が増加するように、前記第1の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項2乃至請求項7のいずれか1項に記載の光シート顕微鏡において、
前記開口は、ピンホールアレイである
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項2乃至請求項8のいずれか1項に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
前記対物レンズと前記撮像装置の間の光路上にダイクロイックミラーを備える
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項2乃至請求項8のいずれか1項に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
前記対物レンズと前記撮像装置の間の光路上の前記対物レンズの光軸から逸れた位置に配置されたミラーを備える
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項1に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
位相差評価用画素を含む、前記対物レンズを介して前記サンプルの画像を取得する撮像装置を備え、
前記制御装置は、前記位相差評価用画素からの出力信号に基づいて、前記第1の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項1に記載の光シート顕微鏡において、さらに、
前記対物レンズを介して前記サンプルの画像を取得する撮像装置と、
前記撮像装置と前記対物レンズの間の光路から分岐した光路上に設けられた位相差AFセンサと、を備え、
前記制御装置は、前記位相差AFセンサからの出力信号に基づいて、前記第1の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 請求項1乃至請求項12のいずれか1項に記載の光シート顕微鏡において、
前記制御装置は、前記光シート面と前記サンプルとの相対位置毎に前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記第1の調整手段を制御するように構成される
ことを特徴とする光シート顕微鏡。 - 対物レンズを備える光シート顕微鏡の制御方法であって、
前記対物レンズの光軸方向とは異なる方向からサンプルに光シートを照射し、
前記光シートが形成された光シート面と前記サンプルとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整し、
前記光シート面と前記サンプルとの相対位置が調整される度に前記対物レンズを介して検出される前記光シート面からの光に基づいて、前記光シート面と前記対物レンズとの相対位置を前記対物レンズの光軸方向に調整し、
前記光シートが照射された前記サンプルの画像を取得する
ことを特徴とする光シート顕微鏡の制御方法。
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