JP2021021823A - 顕微鏡、顕微鏡で試料を撮像する方法、プログラム、および制御装置 - Google Patents

Abstract

【課題】光シート顕微鏡のイメージングスピードを向上させる。【解決手段】顕微鏡は、対物レンズの光軸方向に交差する方向から試料にシート状の光を照射する照射光学系と、試料と対物レンズとを光軸方向に相対的に移動する移動部と、対物レンズの像光を撮影する撮像部と、撮像部の露光中に移動部による光軸方向の移動を継続するよう制御する制御部と、を備える。移動部による移動の一回の露光時間あたりの距離は、シート状の光の光軸方向におけるガウシアン分布の半値幅に予め定められた値を掛けて得られる値以下であってもよい。【選択図】図７

Description

本発明は、顕微鏡、顕微鏡で試料を撮像する方法、プログラム、および制御装置に関する。

ステージ上に載置した試料の側方からシート状の光を照射して試料からの励起光を撮像することで試料の複数の断層像を取得し、試料の３次元立体像を生成することが行われている（例えば、特許文献１参照）。
［先行技術文献］
［特許文献］
［特許文献１］ 特開２０１８−０１７９７０号公報

しかしながら、試料の３次元立体像を生成するためにはステージを移動させて複数回撮像する必要があり、ステージを移動させている間は露光できなかったため、ステージの移動時間が律速となり、複数回撮像の全体の速度を上げることができなかった。

上記課題を解決するために、本発明の一態様においては、顕微鏡が提供される。顕微鏡は、対物レンズの光軸方向に交差する方向から試料にシート状の光を照射する照射光学系と、試料と対物レンズとを光軸方向に相対的に移動する移動部と、対物レンズの像光を撮影する撮像部と、撮像部の露光中に移動部による光軸方向の移動を継続するよう制御する制御部と、を備える。

本発明の一態様においては、顕微鏡で試料を撮像する方法が提供される。上記方法は、 対物レンズの光軸方向に交差する方向から試料にシート状の光を照射する照射ステップと、試料と対物レンズとを光軸方向に相対的に移動する移動ステップと、対物レンズの像光を撮影する撮像ステップと、撮像部の露光中に移動部による光軸方向の移動を継続するよう制御する制御ステップと、を備える。

本発明の一態様においては、プログラムが提供される。上記プログラムは、対物レンズの光軸方向に交差する方向から試料にシート状の光を照射する照射光学系と、試料と対物レンズとを光軸方向に相対的に移動する移動部と、対物レンズの像光を撮影する撮像部と、を備える顕微鏡を制御するコンピュータのプログラムであって、上記コンピュータに、撮像部の露光中に移動部による光軸方向の移動を継続するよう制御するステップを実行させる。

本発明の一態様においては、制御装置が提供される。上記制御装置は、対物レンズの光軸方向に交差する方向から試料にシート状の光を照射する照射光学系と、試料と対物レンズとを光軸方向に相対的に移動する移動部と、対物レンズの像光を撮影する撮像部と、を備える顕微鏡を制御する制御装置であって、撮像部の露光中に移動部による光軸方向の移動を継続するよう制御する。

なお、上記の発明の概要は、本発明の必要な特徴の全てを列挙したものではない。また、これらの特徴群のサブコンビネーションもまた、発明となりうる。

光シート顕微鏡１００の概略的な構成を示す図である。 移動部７０の概略的な構成を示す図である。 （ａ）から（ｃ）は、比較例１、実施例１、および実施例２における撮像の時系列を示す撮像サイクルを示す。 シート状の光の振動中心を更新する処理を示すフローチャートである。 （ａ）は、シート状の光の振動についての説明図であり、（ｂ）は、シート状の光の振動と、時間経過との関係を示す図である。 （ａ）から（ｄ）は、画像比較部１１による画像の合焦度の比較を説明するための図である。 （ａ）および（ｂ）は、シート状の光の振動中心２０２の更新を説明するための図である。 イメージングスピード（ｆｐｓ）を比較するための図である。 シート状の光の位置の、理想的な位置との乖離を説明するための図である。 シート状の光の位置と、ＤＣＴＳの関係について示す図である。 本実施形態において画像の比較に用いた各設定値を示す図である。 分割するブロックのサイズ（ピクセル）と、エラー（μｍ）との関係を示す図である。 分割するブロックのサイズ（ピクセル）と、イメージングスピード（ｍｓ／ｉｍａｇｅ）との関係を示す図である。 分割エリアの割合（％）と、エラー（μｍ）との関係を示す図である。 シート状の光の振動の振幅（μｍ）と、エラー（μｍ）との関係を示す図である。 振動制御部がシート状の光の振動中心を更新するための合焦評価値Ｅの閾値と、エラー（μｍ）との関係を示す図である。 ブロックセレクションディスタンスの種類と、エラー（μｍ）および外れ値との関係を示す図である。 ブロックセレクションオーダーと、エラー（μｍ）との関係を示す図である。 本発明の複数の態様が全体的又は部分的に具現化されうるコンピュータの例を示す図である。

以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。

図１は、本実施形態に係る光シート顕微鏡１００の概略的な構成を示す図である。光シート顕微鏡１００は、制御部１０と、撮像部２１，２２と、レーザ３０と、レンズ群３１と、フリップミラー３２と、ガルバノミラー群３３〜３８と、照明用対物レンズ４１，４２と、検出用対物レンズ５０と、ステージ６０と、移動部７０と、ダイクロイックミラー８０とを備える。なお、レーザ３０と、レンズ群３１と、フリップミラー３２と、ガルバノミラー群３３〜３８と、照明用対物レンズ４１，４２とが照射光学系を構成する。

光シート顕微鏡１００は、励起光であるシート状の光を検出用対物レンズ５０の光軸に直交する方向から試料１０１に向けて照射し、試料１０１の蛍光色素から励起された蛍光を撮影することで試料１０１の画像を取得する。光シート顕微鏡１００は、シート状の光を検出用対物レンズ５０の光軸に沿って試料１０１に対して相対的に移動させながら撮像することで、試料１０１の複数の断層像を取得し、試料１０１の３次元立体像を得る。試料１０１は、例えば、蛍光色素により標識された生体細胞である。

レーザ３０から出射したレーザ光は、レンズ群３１を通過して、フリップミラー３２により光路Ａと光路Ｂのふたつの光路に分けられる。光路Ａに進んだレーザ光は、複数のミラー群およびレンズ群により、ガルバノミラー群３３〜３５に導かれる。ガルバノミラー群３３〜３５は、それぞれ軸回転用モータに接続されており、各軸を中心として回転することが可能である。

ガルバノミラー３４は、高速で走査されることにより実質的にシート状の光を形成するために用いられる。ここで、シート状の光とはシート形状の照明領域を有する照明光のことである。シート状の光は、試料１０１内で検出用対物レンズ５０の光軸方向に薄く、光軸方向に直交する方向に厚い形状を有する。ガルバノミラー３３はシート状の光のｘｙ平面内においてレーザ光の向きを試料１０１を中心にｙ方向に高速で回旋させ、さまざまな方向から試料１０１に照明することで影の発生を抑えるために用いられる。ガルバノミラー３５はシート状の光のｚ方向における位置を調整するために用いられる。

光路Ａのガルバノミラー群３３〜３５によって形成されたシート状の光は、照明用対物レンズ４１に入射する。照明用対物レンズ４１は、検出用対物レンズ５０の光軸と略直交する方向である＋ｘ方向側から試料１０１にシート状の光を照射する。

光路Ｂに進んだレーザ光は、複数のミラー群およびレンズ群により、ガルバノミラー群３６〜３８に導かれる。ガルバノミラー群３６〜３８は、それぞれ軸回転用モータに接続されており、各軸を中心として回転することが可能である。

ガルバノミラー３６は、高速で走査されることにより実質的にシート状の光を形成するために用いられる。ガルバノミラー３７はシート状の光のｘｙ平面内においてレーザ光の向きを試料１０１を中心にｙ方向に高速で回旋させ、さまざまな方向から試料１０１に照明することで影の発生を抑えるために用いられる。ガルバノミラー３８はシート状の光のｚ方向における位置を調整するために用いられる。

光路Ｂのガルバノミラー群３６〜３８によって形成されたシート状の光は、照明用対物レンズ４２に入射する。照明用対物レンズ４２は、検出用対物レンズ５０の光軸と略直交する方向である−ｘ方向側から試料１０１にシート状の光を照射する。以上のように、シート状の光が、＋ｘ方向側および−ｘ方向側の双方から試料１０１に向けて照射されることにより、影のない画像を取得することができる。なお、シート状の光は＋ｘ方向側および−ｘ方向側の片側から試料１０１に向けて照射されてもよい。

ステージ６０上には、試料１０１が載置される。シート状の光が＋ｘ方向側および−ｘ方向側の双方から試料１０１に照射されることにより、試料１０１の蛍光色素からは励起された蛍光が出射する。検出用対物レンズ５０で試料１０１からの励起光を撮影することにより、試料１０１の画像を取得する。

ステージ６０は、ステージ６０を移動する移動部７０と接続されており、移動部７０によって移動される。移動部７０は、撮像部２１，２２による複数回の撮像における一の撮像から終わりの撮像までの撮像期間中にステージ６０を検出用対物レンズ５０の光軸方向に平行な方向である±ｚ方向に等速で移動させる。すなわち、撮像部２１，２２の露光中においてもステージ６０のｚ方向の移動を継続する。ステージ６０の移動速度は例えば、９０．９（μ ｍ／ｓ）である。移動部７０は、ステージ６０を検出用対物レンズ５０の光軸方向に垂直な方向であるｘ方向およびｙ方向に移動、または回転することも可能である。

ダイクロイックミラー８０は、試料１０１の蛍光色素が異なる波長の蛍光を出射する場合に、第１の波長の光を反射し、第２の波長の光を透過することで、第１の波長の光と第２の波長の光とを分離する。第１の波長の光は、ダイクロイックミラー８０により反射され、フィルタを介して撮像部２１に入射する。第２の波長の光は、ダイクロイックミラー８０を透過し、フィルタを介して撮像部２２に入射する。本実施形態では、２つの撮像部２１，２２を用いて２波長の同時イメージングを行う。

撮像部２１，２２は、シート状の光が照射された試料１０１の像を撮影し、画像を生成する。撮像部２１，２２は、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）イメージセンサなどの２次元イメージセンサを備えたデジタルカメラである。撮像部２１，２２は、検出用対物レンズ５０の前側焦点位置が受光面に一致するように配置されている。

制御部１０は、画像比較部１１および振動制御部１２を備える。画像比較部１１には、撮像部２１，２２により生成された試料１０１の複数の画像が入力される。画像比較部１１は、入力された試料１０１の複数の画像を比較して、比較結果を振動制御部１２に出力する。振動制御部１２は、画像比較部１１から受け取った比較結果に基づいて、ガルバノミラー群３３〜３８を制御し、シート状の光が照射されるｚ方向の位置を調整する。また、振動制御部１２は、ガルバノミラー群３３〜３８を制御することによって、シート状の光をｚ方向に微小に振動させる。

図２は、移動部７０の概略的な構成を示す図である。移動部７０は、ステージ６０をｘ方向に移動するためのｘ方向移動部７１と、ステージ６０をｙ方向に移動するためのｙ方向移動部７２と、ステージ６０をｚ方向に移動するためのｚ方向移動部７３と、ステージ６０を回転させるための回転ステージ７４とを備える。検出用対物レンズ５０は、ステージ６０上に載置された試料１０１の−ｚ方向側に設置される。照明用対物レンズ４１，４２は、試料１０１の＋ｘ方向側と−ｘ方向側に設置される。

ここで、撮像部２１，２２による露光中にステージ６０を移動することによって生じる画像の被写体ぶれを低減するため、ステージ６０のｚ方向への移動速度は所定速度以下であることが望ましい。具体的には、撮像部２１，２２による一回の露光時間あたりのステージ６０の移動距離は、シート状の光のｚ方向におけるガウシアン分布の半値幅に予め定められた値を掛けて得られる値以下であることが好ましい。予め定められた値は１．３であることが好ましく、０．６であることがより好ましい。

図３（ａ）から（ｃ）は、比較例１、実施例１、および実施例２における撮像の時系列を示す撮像サイクルを示す。図３（ａ）は、比較例１における撮像サイクルを示しており、図３（ｂ）および（ｃ）は、本実施形態における実施例１および実施例２における撮像サイクルを示している。なお、図３（ｃ）は、オートフォーカスオプションを使用する場合について示している。図３（ａ）から（ｃ）には、撮像サイクルの内の、１サイクルが示される。１サイクルとは、光シート顕微鏡１００が取得する試料１０１の複数の断層像のうち、ひとつの断層像を取得するためのサイクルのことをいい、言い換えれば、撮像部２１，２２による一の撮像の露光開始から次の撮像の露光開始までの時間のことをいう。

図３（ａ）に示すように、比較例１ではステージ６０の移動が完了してから撮像部２１，２２による露光を行っており、撮像部２１，２２の露光中にステージ６０の移動を行っていない。したがって、比較例１における撮像の１サイクルに要する時間は、撮像部２１，２２による露光時間の「５０（ｍｓ）」と、ステージ６０の移動時間の「１５０（ｍｓ）」とを合わせた、「２００（ｍｓ）」である。

これに対して、図３（ｂ）および（ｃ）に示す実施例１および実施例２における撮像サイクルでは、移動部７０は複数回の撮像期間中にステージ６０を等速で移動させており、撮像部２１，２２の露光中にもステージ６０の移動を行っている。図３（ｂ）に示すように、実施例１における撮像の１サイクルは露光時間の「５０（ｍｓ）」のみである。図３（ｃ）に示すように、実施例２における撮像の１サイクルは、露光時間の「５０（ｍｓ）」と、次の撮像に向けてシート状の光の位置を移動するための時間「５（ｍｓ）」とを合わせた、「５５（ｍｓ）」である。

図３（ａ）に示すように、比較例１において、撮像の１サイクルに占める一回の露光時間の割合は、２５％である。これに対して、図３（ｂ）および（ｃ）に示すように、実施例１における撮像の１サイクルに占める一回の露光時間の割合は１００％であり、実施例２における割合は９０％以上である。このように、本実施形態では、撮像部２１，２２の露光中にステージ６０の移動を行っているため、撮像の１サイクルに占める一回の露光時間の割合を増やすことにより、撮像の１サイクルに要する時間を大幅に短縮することができる。したがって、試料１０１の複数の断層像を取得するために必要な撮像時間を大幅に短縮することができる。

なお、撮像部２１，２２の露光中にステージ６０を移動させて撮像を行うことにより、試料１０１内部の構造の違いや、周囲のゲルやオイルとの微妙な屈折率の違いにより、シート状の光の位置と検出用対物レンズ５０の焦点位置がずれてしまい、取得した画像にピンボケした領域ができる場合がある。そこで、本実施形態では、肉眼では判別できないほど微小な距離だけシート状の光の位置を振動させながら複数の画像を撮像し続け、撮像と並行して取得した複数の画像についていずれがフォーカスのあった画像であるかの判別を行い、より良い焦点位置にシート状の光の位置を移動し、常時更新する制御を行う。これにより、ステージ６０を移動させながら撮像を行う場合であっても、常にフォーカスのあった画像を取得し続けることができる。以下、シート状の光の位置を移動させるための具体的な方法について説明する。

図４は、シート状の光の位置を更新する処理を示すフローチャートである。図４に示すように、振動制御部１２がシート状の光を検出用対物レンズ５０の光軸方向に予め定められた振幅で振動させ、シート状の光が振動の両端にある場合の画像を撮像部２１，２２によって取得する（Ｓ０１）。本実施形態において、予め定められた振幅は、１．４μｍである。なお、予め定められた振幅は上記値に限定されず、例えば、シート状の光のｚ方向におけるガウシアン分布の半値幅の５％以上、１００％以下であってよい。

図５（ａ）は、シート状の光の振動についての説明図である。図５（ａ）の横軸は、シート状の光のｚ方向における位置を示している。図５（ａ）に示すように、シート状の光を検出用対物レンズ５０の光軸方向であるｚ方向に予め定められた振幅で振動させた結果、振動の両端側に二つのシート状の光（Ｓｈｅｅｔ１およびＳｈｅｅｔ２）が照射される。

図５（ｂ）は、シート状の光の振動と、時間経過との関係を示す図である。図５（ｂ）の縦軸はｚ軸を示しており、横軸は時間（ｔ）を示している。図５（ｂ）における実線２０１はシート状の光の位置を示しており、一点鎖線２０２はシート状の光の振動中心を示しており、破線２０３は検出用対物レンズ５０の焦点位置を示している。なお、破線２０３は、シート状の光の理想的な位置であるともいえる。

図５（ｂ）に示すように、振動制御部１２がｚ方向にシート状の光を１．４μｍだけ振動させ、撮像部２１，２２は、シート状の光が振動の両端にある場合の時間的に連続した複数の画像を取得する。Ｉｍａｇｅ１は、シート状の光が振動の−ｚ方向側の端部（Ｓｈｅｅｔ１）にあるときに取得した画像であり、Ｉｍａｇｅ２は、シート状の光が振動の＋ｚ方向側の端部（Ｓｈｅｅｔ２）にあるときに取得した画像である。図５（ｂ）の例では、検出用対物レンズ５０の焦点位置を示す破線２０３がＩｍａｇｅ２寄りにあるため、Ｉｍａｇｅ１とＩｍａｇｅ２の合焦度を比較した場合、Ｉｍａｇｅ２の合焦度の方が高いことが分かる。

図４に戻り、画像比較部１１は、取得された画像のうち時間的に連続した２枚の画像の合焦度を比較する（Ｓ０２）。ここで、図５（ａ）および（ｂ）におけるＩｍａｇｅ１の合焦度を合焦度Ａとし、Ｉｍａｇｅ２の合焦度を合焦度Ｂとする。以下、画像比較部１１が行う画像の合焦度の比較の方法について説明する。

図６（ａ）から（ｄ）は、画像比較部１１による画像の合焦度の比較を説明するための図である。なお、図６（ａ）および（ｂ）は、図４のステップＳ０２に対応し、図６（ｃ）は、図４のステップＳ０３に対応し、図６（ｄ）は、図４のステップＳ０４およびＳ０５に対応する。

本実施形態において、画像比較部１１は離散コサイン変換を用いて時間的に連続した２枚の画像の合焦度を比較する。図６（ａ）の段階において、画像比較部１１は、Ｉｍａｇｅ１とＩｍａｇｅ２をそれぞれ複数のブロックに分割する。例えば、Ｉｍａｇｅ１およびＩｍａｇｅ２が２１６０×２５６０ピクセルの画像の場合、画像比較部１１は、１２８×１２８ピクセルのブロックに分割する。その結果、Ｉｍａｇｅ１およびＩｍａｇｅ２は、３２０個のブロックに分割される。

図６（ｂ）の段階において、画像比較部１１は、Ｉｍａｇｅ１およびＩｍａｇｅ２について、３２０個のブロックのノルムＬ２の値を演算し、ノルムＬ２の値が高いほうから予め定められた個数、例えば３２個のブロック（全体の９．５％の領域）を選択する。比較部は、離散コサイン変換を用いて選択したそれぞれのブロックのＤＣＴＳスコア（ｔｈｅ Ｓｈａｎｏｎ ｅｎｔｒｏｐｙ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｃｏｓｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｓｃｏｒｅ）を演算する。本実施形態では、離散コサイン変換したＤＣＴ画像に対してノルムＬ２を計算することにより、ＤＣＴ画像を正規化する。これにより、画像を比較する際に画像のインテンシティの違いによる影響を受けにくくすることができる。

図６（ｃ）の段階において、画像比較部１１は、Ｉｍａｇｅ１およびＩｍａｇｅ２について、選択した全てのブロックのＤＣＴＳスコアを合計してＤＣＴＳスコアの合計値を算出する。画像比較部１１は、Ｉｍａｇｅ１およびＩｍａｇｅ２のＤＣＴＳスコアの合計値を比較して、いずれの画像がよりフォーカスが合っている画像であるかを判定する。ＤＣＴＳスコアの合計値が高いほど、フォーカスが合っている画像であることを示す。

図６（ｄ）の段階において、画像比較部１１は、Ｉｍａｇｅ１およびＩｍａｇｅ２のＤＣＴＳスコアの合計値の比較の結果を、合焦評価値Ｅに反映する。本実施形態において、合焦評価値Ｅとは、シート状の光の振動中心２０２が理想的な位置２０３から乖離している度合いを示す値である。合焦評価値Ｅの絶対値が大きいほど、シート状の光の振動中心２０２が理想的な位置２０３から乖離していることを示す。合焦評価値Ｅは、始めはリセットされた状態にあり、０である。画像比較部１１は、Ｉｍａｇｅ２のＤＣＴＳスコアがＩｍａｇｅ１のＤＣＴＳスコアよりも高い場合、合焦評価値Ｅをカウントアップし、＋１とする。一方で、Ｉｍａｇｅ１のＤＣＴＳスコアがＩｍａｇｅ２のＤＣＴＳスコアよりも高い場合、合焦評価値Ｅをカウントダウンし、−１とする。

図６に示す例では、Ｉｍａｇｅ１のＤＣＴＳスコアは０．００３５３であり、Ｉｍａｇｅ２のＤＣＴＳスコアは０．００３５６であるため、Ｉｍａｇｅ２のＤＣＴＳスコアがＩｍａｇｅ１のＤＣＴＳスコアよりも高い。したがって、Ｉｍａｇｅ２の方がよりフォーカスが合っている画像であり、合焦度Ａ＜合焦度Ｂである。この結果に基づいて、画像比較部１１は、合焦評価値Ｅをカウントアップし、＋１とする。

図４に戻り、合焦度Ａ＜合焦度Ｂの場合（Ｓ０３：ＹＥＳ）、画像比較部１１は合焦評価値Ｅを「＋１」カウントアップする（Ｓ０４）。一方、合焦度Ａ＞合焦度Ｂの場合（Ｓ０３：ＮＯ）、画像比較部１１は合焦評価値Ｅを「−１」カウントダウンする（Ｓ０５）。上記二つの画像の内、合焦度が高い画像を３次元立体像の生成に使用する。振動制御部１２は、合焦評価値Ｅの絶対値が閾値以上となった場合（Ｓ０６：ＹＥＳ）、シート状の光の振動中心２０２を更新する（Ｓ０７）。振動制御部１２は、合焦評価値Ｅの絶対値が閾値以上でない場合（Ｓ０６：ＮＯ）、シート状の光の振動中心２０２を更新しない。本実施形態において、合焦評価値Ｅの閾値を「３」とするが、上記値に限定されず、任意に設定可能である。

図７（ａ）および（ｂ）は、シート状の光の振動中心２０２の更新を説明するための図である。図７（ａ）は、シート状の光の振動中心２０２の時間経過による変化を示す。図７（ａ）の横軸は時間（ｔ）の経過を示しており、縦軸はｚ軸を示している。図７（ａ）において、実線はシート状の光の位置２０１を示しており、一点鎖線はシート状の光の振動中心２０２を示しており、破線は理想的なシート状の光の位置２０３を示している。

図７（ｂ）は、合焦評価値Ｅの時間経過による変化を示す。図７（ｂ）の横軸は時間（ｔ）の経過を示しており、縦軸は合焦評価値Ｅを示している。時刻ｔ０において、合焦評価値Ｅはリセットされており、０である。

画像比較部１１は、時刻ｔ１において、Ｉｍａｇｅ０とＩｍａｇｅ１の合焦度を比較して、Ｉｍａｇｅ１の合焦度が高いとの判定結果が出たことから、合焦評価値Ｅをカウントダウンし、−１とする。画像比較部１１は、時刻ｔ２において、Ｉｍａｇｅ１とＩｍａｇｅ２の合焦度を比較して、Ｉｍａｇｅ２の合焦度が高いとの判定結果が出たことから、合焦評価値Ｅをカウントアップし、０とする。画像比較部１１は、時刻ｔ３において、Ｉｍａｇｅ２とＩｍａｇｅ３の合焦度を比較して、Ｉｍａｇｅ２の合焦度が高いとの判定結果が出たことから、合焦評価値Ｅをカウントアップし、＋１とする。

画像比較部１１は、時刻ｔ４において、Ｉｍａｇｅ３とＩｍａｇｅ４の合焦度を比較して、Ｉｍａｇｅ４の合焦度が高いとの判定結果が出たことから、合焦評価値Ｅをカウントアップし、＋２とする。画像比較部１１は、時刻ｔ５において、Ｉｍａｇｅ４とＩｍａｇｅ５の合焦度を比較して、Ｉｍａｇｅ４の合焦度が高いとの判定結果が出たことから、合焦評価値Ｅをカウントアップし、＋３とする。画像比較部１１による合焦度の判定結果および合焦評価値Ｅは、振動制御部１２に送られる。振動制御部１２は、時刻ｔ６において、合焦評価値Ｅの絶対値が閾値である「３」以上となったことから、シート状の光の振動中心を移動する。合焦評価値Ｅの絶対値が閾値以上となると、画像比較部１１は合焦評価値Ｅをリセットし、０とする。

なお、振動制御部１２によるシート状の光の振動中心２０２の移動は、よりフォーカスが合う方向（±ｚ方向）に行われる。図７（ａ）において、振動制御部１２は、合焦評価値Ｅが＋３となった場合にはシート状の光の振動中心２０２を＋ｚ方向に移動し、合焦評価値Ｅが−３となった場合にはシート状の光の振動中心２０２を−ｚ方向に移動する。本実施形態において、振動制御部１２が移動するシート状の光の振動中心２０２の距離は、振動の振幅と同じ距離である１．４μｍとする。しかしながら、振動制御部１２が移動するシート状の光の振動中心２０２の距離は、任意に設定可能であり、例えば、振動の振幅の整数倍であってよい。

図７（ａ）および（ｂ）において、画像比較部１１は、時刻ｔ６以降も同様の処理を行う。時刻ｔ７において、合焦評価値Ｅが−３となり、合焦評価値Ｅの絶対値が閾値以上となったことから、振動制御部１２は、今度はシート状の光の振動中心２０２を−ｚ方向に１．４μｍ移動し、合焦評価値Ｅをリセットする。図４におけるＳ０１からＳ０７までの処理は、試料１０１の撮像が終了するまで繰り返される（Ｓ０８）。

図８は、イメージングスピード（ｆｐｓ）を比較するための図である。なお、本実施形態においてイメージングスピードとは、試料１０１の複数の断層像を取得するための撮像の速度をいう。図８には、撮像部２１，２２による露光中にステージ６０を移動させない比較例２〜４におけるイメージングスピード（ｆｐｓ）と、撮像部２１，２２による露光中にステージ６０を等速で移動させる本実施形態におけるイメージングスピード（ｆｐｓ）が示される。図８における縦軸はイメージングスピード（ｆｐｓ）を示しており、横軸は１／露光時間（ｓ）を示している。

図８における破線２０４はオートフォーカスオプションを使用しない実施例１（図３（ｂ）参照）について示しており、実線２０５は、オートフォーカスオプションを使用する実施例２（図３（ｃ）参照）について示しており、一点鎖線２０６はステージ６０の移動時間が５０ｍｓである比較例２について示しており、二点鎖線２０７はステージ６０の移動時間が１００ｍｓである比較例３について示しており、一点二鎖線２０８はステージ６０の移動時間が１５０ｍｓである比較例１（図３（ａ）参照）について示している。

図８に示すように、露光時間にもよるが、本実施形態におけるイメージングスピード（ｆｐｓ）は、比較例１〜３におけるイメージングスピード（ｆｐｓ）のおよそ２倍から７倍に向上している。具体的には、露光時間が５０ｍｓの場合、マウス全脳の３次元イメージングに要する時間が従来の２４時間から５時間にまで短縮することが可能となった。また、明るい色素や蛍光タンパク質などを観察する場合は、露光時間を短縮できるため、さらに半分程度にまで時間を短縮することが可能である。

図９は、シート状の光の位置の、理想的な位置との乖離を説明するための図である。図９において、点線２０９は実施例２におけるシート状の光の位置を示しており、長二点鎖線２１０はステージ６０がｚ方向に１０００μｍ移動するごとにオートフォーカス処理を行った場合の比較例４について示しており、長鎖線２１１は５００μｍごとにオートフォーカス処理を行った場合の比較例５について示しており、一点鎖線２１２は２５０μｍごとにオートフォーカス処理を行った場合の比較例６について示しており、破線２１３は１００μｍごとにオートフォーカス処理を行った場合の比較例７について示しており、実線２１４は、シート状の光の理想的な位置について示している。

図９に示すように、オートフォーカスの頻度が少ない比較例４〜７は理想的な位置２１４から大きく外れることが多くなっているのに対して、実施例１ではシート状の光の位置２０９が理想的な位置２１４に概ね追従していることが分かる。したがって、本実施形態による調整方法を使用することで、ステージ６０を移動させながら撮像した場合であっても常にフォーカスの合った画像を取得することができる。

図１０（ａ）および（ｂ）は、シート状の光の位置と、ＤＣＴＳの関係について示す図である。図１０（ａ）および（ｂ）には、シート状の光が特定の位置（Ｌｉｇｈｔ−ｓｈｅｅｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）にあるときに得られた画像のＤＣＴＳ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ＤＣＴＳ）が、試料１０１のｚ方向における位置（Ｄｅｐｔｈ方向）ごとに示されている。図１０（ａ）は斜視図であり、図１０（ｂ）は上面図である。図１０（ａ）および（ｂ）に示すように、各z方向における位置ごとの画像の質（ＤＣＴＳ）は、最適位置を頂点とした１つの極大値をもつことが示されている。このように、各z方向における位置ごとの画像の質（ＤＣＴＳ）が単峰性となっていることから、各z方向における位置ごとに、どの２点間のＤＣＴＳの比較を行っても、最適位置のある方向を知ることができる。したがって、どのｚ方向の位置においても、任意の２か所のシート状の光によって得られる画像から、最適な合焦点位置を計算することができる。

図１１は、本実施形態において画像の比較に用いた各設定値を示す図である。（ａ）欄に示すように、本実施形態において、画像比較部１１は比較する画像をそれぞれ「１２８×１２８ピクセル」のブロックに分割した。（ｂ）欄に示すように、分割した複数のブロックの内、ノルムＬ２の値が高いほうから３２個のブロック（全体の「９．５％」の領域）を選択して画像を比較した。（ｃ）欄に示すように、振動制御部１２が移動するシート状の光の振動中心２０２の距離は、「１．４μｍ」とした。

（ｄ）欄に示すように、振動制御部１２がシート状の光の振動中心２０２の更新を行うための合焦評価値Ｅの閾値は、「３」とした。（ｅ）欄に示すように、ブロックセレクションメソッドは、「ノルムＬ２」とした。（ｆ）欄に示すように、ブロックセレクションオーダーはディセンディングとして、ノルムＬ２の値が高い方から選択した。なお、各設定値は上記値に限定されず、任意に変更することが可能である。以下、各設定値として上記値を用いることによる効果について説明する。

図１２は、分割するブロックのサイズ（ピクセル）と、エラー（μｍ）との関係を示す図である。図１２の縦軸で示されたエラー（μｍ）は、シート状の光の理想的なｚ方向における位置２０３と、実際のシート状の光のｚ方向における位置２０１との誤差を示す。図１２において、本実施形態で用いた数値（１２８ピクセル）についてはハッチングの四角で示している。図１２に示すように、ブロックサイズが５０〜１５０（ピクセル）程度であるとエラー（μｍ）が少なくなることが分かる。

図１３は、分割するブロックのサイズ（ピクセル）と、８０％以上の精度を出すために必要な最小計算時間（ｍｓ／ｉｍａｇｅ）との関係を示す図である。図１３において、本実施形態で用いた数値（１２８）についてはハッチングの四角で示している。図１３に示すように、ブロックサイズが１２８（ピクセル）であるときに、８０％以上の精度を出すために必要な最小計算時間が短縮していることが分かる。

図１４は、分割エリアの割合（％）と、エラー（μｍ）との関係を示す図である。図１４において、本実施形態で用いた数値（９．５％）についてはハッチングの四角で示している。図１４に示すように、分析エリアの割合が５〜２０％程度である場合に、エラー（μｍ）が少なくなることが分かる。

図１５は、シート状の光の振動の振幅（μｍ）と、エラー（μｍ）との関係を示す図である。図１５において、本実施形態で用いた数値（１．４μｍ）についてはハッチングの四角で示している。図１５に示すように、振動の振幅が１〜２μｍ程度である場合に、エラー（μｍ）が少なくなることが分かる。

図１６は、振動制御部１２がシート状の光の振動中心２０２を更新するための合焦評価値Ｅの閾値と、エラー（μｍ）との関係を示す図である。図１６において、本実施形態で用いた数値（３）についてはハッチングの四角で示している。図１６に示すように、閾値が３〜８である場合に、エラー（μｍ）が少なくなることが分かる。

図１７は、ブロックセレクションディスタンスの種類と、エラー（μｍ）および外れ値との関係を示す図である。図１７において、本実施形態で用いた種類（ノルムＬ２）についてはハッチングの四角で示している。なお、図１７において、ブロックセレクションオーダーはすべてディセンディング（値が高い方から選択）としている。図１７に示すように、ブロックセレクションディスタンスとしてノルムＬ２を用いた場合に、ノルムＬ１を用いた場合と比較してエラー（μｍ）が少なくなることが分かる。また、ノルムＬ２を用いた場合では、ＭＥＡＮを用いた場合と比較して外れ値が小さいことが分かる。

図１８は、ブロックセレクションオーダーと、エラー（μｍ）との関係を示す図である。図１８において、ブロックセレクションディスタンスはすべてノルムＬ２を用いている。図１８に示すように、ブロックセレクションオーダーをディセンディングオーダー（値が高い方から選択）とした方が、アセンディングオーダー（値が低い方から選択）とした場合と比較してエラー（μｍ）が少なくなることが分かる。

以上のように、本実施形態における光シート顕微鏡１００によれば、撮像部２１，２２の露光中にステージ６０の移動を行い、試料１０１を移動させながら撮像を行う。これにより、撮像の１サイクルに要する時間を大幅に短縮することができ、試料１０１の複数の断層像を取得するために必要な撮像時間を大幅に短縮することができる。

本実施形態における光シート顕微鏡１００によれば、撮像部２１，２２による一回の露光時間あたりのステージ６０の移動距離は、シート状の光のｚ方向におけるガウシアン分布の半値幅に予め定められた値を掛けて得られる値以下である。これにより、撮像部２１，２２による露光中にステージ６０を移動することによって生じる画像の被写体ぶれを低減することができる。

本実施形態における光シート顕微鏡１００によれば、シート状の光の位置を微小に振動させながら複数の画像を撮像し続け、撮像と並行して取得した複数の画像についていずれがフォーカスのあった画像であるかの判別を行い、より良い焦点位置にシート状の光の位置を移動する制御を行う。これにより、ステージ６０を移動させながら撮像を行う場合であっても、常にフォーカスのあった画像を取得し続けることができる。

［変形例１］
上記実施形態においては、振動制御部１２がガルバノミラー群３３〜３８を制御することによりシート状の光を振動させて複数の画像を取得し、複数の画像の合焦度を比較することによってシート状の光の位置を調整した。しかしながら、振動制御部１２が、検出用対物レンズ５０を振動させることによって、複数の画像を取得してもよい。この場合、振動制御部１２は検出用対物レンズ５０に接続されたピエゾステージを制御することによって、検出用対物レンズ５０を振動させてもよい。

［変形例２］
上記実施形態においては、撮像部２１，２２は、シート状の光が振動の両端にある場合の複数の画像を取得した。しかしながら、撮像部２１，２２は、シート状の光が振動の両端にある場合に限られず、振動内の予め定められた複数の位置にある場合の複数の画像を取得してもよい。

［変形例３］
上記実施形態においては、画像比較部１１は時間的に連続した２枚の画像を比較することによって画像の比較を行った。しかしながら、画像比較部１１は時間的に連続しない複数の画像を比較してもよい。例えば、画像比較部１１は図７（ａ）におけるＩｍａｇｅ１とＩｍａｇｅ４を比較してもよく、Ｉｍａｇｅ２とＩｍａｇｅ５を比較してもよい。

［変形例４］
上記実施形態においては、画像比較部１１は正規化離散コサイン変換のエントロピーを用いて画像の比較を行った。しかしながら、画像比較部１１による画像の比較は公知の方法を用いてよく、例えば、離散フーリエ変換、離散ウェーブレット変換、ベイズスペクトラルエントロピー、ソーベルフィルタ、およびキャニー法のいずれかを用いてよい。

［変形例５］
上記実施形態においては、ガルバノミラー３３，３６を走査することによりシート状の光を形成した。しかしながら、シート状の光は、例えば、シリンドリカルレンズによって形成してもよい。

［変形例６］
上記実施形態においては、移動部７０がステージ６０を撮像期間中に等速で移動させることとしたが、移動部７０によるステージ６０の移動は等速でなくてもよい。移動部７０による移動の速度は、例えば、段階的に変化させてもよい。また、移動部７０による移動の速度は、試料１０１の性質などによって試料１０１の種類ごとに設定することが可能である。

また、本発明の様々な実施形態は、フローチャートおよびブロック図を参照して記載されてよく、ここにおいてブロックは、（１）操作が実行されるプロセスの段階または（２）操作を実行する役割を持つ装置のセクションを表わしてよい。特定の段階およびセクションが、専用回路、コンピュータ可読媒体上に格納されるコンピュータ可読命令と共に供給されるプログラマブル回路、および／またはコンピュータ可読媒体上に格納されるコンピュータ可読命令と共に供給されるプロセッサによって実装されてよい。専用回路は、デジタルおよび／またはアナログハードウェア回路を含んでよく、集積回路（ＩＣ）および／またはディスクリート回路を含んでよい。プログラマブル回路は、論理ＡＮＤ、論理ＯＲ、論理ＸＯＲ、論理ＮＡＮＤ、論理ＮＯＲ、および他の論理操作、フリップフロップ、レジスタ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）等のようなメモリ要素等を含む、再構成可能なハードウェア回路を含んでよい。

コンピュータ可読媒体は、適切なデバイスによって実行される命令を格納可能な任意の有形なデバイスを含んでよく、その結果、そこに格納される命令を有するコンピュータ可読媒体は、フローチャートまたはブロック図で指定された操作を実行するための手段を作成すべく実行され得る命令を含む、製品を備えることになる。コンピュータ可読媒体の例としては、電子記憶媒体、磁気記憶媒体、光記憶媒体、電磁記憶媒体、半導体記憶媒体等が含まれてよい。コンピュータ可読媒体のより具体的な例としては、フロッピー（登録商標）ディスク、ディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリメモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブルリードオンリメモリ（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリ）、電気的消去可能プログラマブルリードオンリメモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、静的ランダムアクセスメモリ（ＳＲＡＭ）、コンパクトディスクリードオンリメモリ（ＣＤ-ＲＯＭ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイ（ＲＴＭ）ディスク、メモリスティック、集積回路カード等が含まれてよい。

コンピュータ可読命令は、アセンブラ命令、命令セットアーキテクチャ（ＩＳＡ）命令、マシン命令、マシン依存命令、マイクロコード、ファームウェア命令、状態設定データ、またはＳｍａｌｌｔａｌｋ、ＪＡＶＡ（登録商標）、Ｃ＋＋等のようなオブジェクト指向プログラミング言語、および「Ｃ」プログラミング言語または同様のプログラミング言語のような従来の手続型プログラミング言語を含む、１または複数のプログラミング言語の任意の組み合わせで記述されたソースコードまたはオブジェクトコードのいずれかを含んでよい。

コンピュータ可読命令は、汎用コンピュータ、特殊目的のコンピュータ、若しくは他のプログラム可能なデータ処理装置のプロセッサまたはプログラマブル回路に対し、ローカルにまたはローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、インターネット等のようなワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を介して提供され、フローチャートまたはブロック図で指定された操作を実行するための手段を作成すべく、コンピュータ可読命令を実行してよい。プロセッサの例としては、コンピュータプロセッサ、処理ユニット、マイクロプロセッサ、デジタル信号プロセッサ、コントローラ、マイクロコントローラ等を含む。

図１９は、本発明の複数の態様が全体的または部分的に具現化されてよいコンピュータ２２００の例を示す。コンピュータ２２００にインストールされたプログラムは、コンピュータ２２００に、本発明の実施形態に係る装置に関連付けられる操作または当該装置の１または複数のセクションとして機能させることができ、または当該操作または当該１または複数のセクションを実行させることができ、および／またはコンピュータ２２００に、本発明の実施形態に係るプロセスまたは当該プロセスの段階を実行させることができる。そのようなプログラムは、コンピュータ２２００に、本明細書に記載のフローチャートおよびブロック図のブロックのうちのいくつかまたはすべてに関連付けられた特定の操作を実行させるべく、ＣＰＵ２２１２によって実行されてよい。

本実施形態によるコンピュータ２２００は、ＣＰＵ２２１２、ＲＡＭ２２１４、グラフィックコントローラ２２１６、およびディスプレイデバイス２２１８を含み、それらはホストコントローラ２２１０によって相互に接続されている。コンピュータ２２００はまた、通信インタフェース２２２２、ハードディスクドライブ２２２４、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブ２２２６、およびＩＣカードドライブのような入／出力ユニットを含み、それらは入／出力コントローラ２２２０を介してホストコントローラ２２１０に接続されている。コンピュータはまた、ＲＯＭ２２３０およびキーボード２２４２のようなレガシの入／出力ユニットを含み、それらは入／出力チップ２２４０を介して入／出力コントローラ２２２０に接続されている。

ＣＰＵ２２１２は、ＲＯＭ２２３０およびＲＡＭ２２１４内に格納されたプログラムに従い動作し、それにより各ユニットを制御する。グラフィックコントローラ２２１６は、ＲＡＭ２２１４内に提供されるフレームバッファ等またはそれ自体の中にＣＰＵ２２１２によって生成されたイメージデータを取得し、イメージデータがディスプレイデバイス２２１８上に表示されるようにする。

通信インタフェース２２２２は、ネットワークを介して他の電子デバイスと通信する。ハードディスクドライブ２２２４は、コンピュータ２２００内のＣＰＵ２２１２によって使用されるプログラムおよびデータを格納する。ＤＶＤ−ＲＯＭドライブ２２２６は、プログラムまたはデータをＤＶＤ−ＲＯＭ２２０１から読み取り、ハードディスクドライブ２２２４にＲＡＭ２２１４を介してプログラムまたはデータを提供する。ＩＣカードドライブは、プログラムおよびデータをＩＣカードから読み取り、および／またはプログラムおよびデータをＩＣカードに書き込む。

ＲＯＭ２２３０はその中に、アクティブ化時にコンピュータ２２００によって実行されるブートプログラム等、および／またはコンピュータ２２００のハードウェアに依存するプログラムを格納する。入／出力チップ２２４０はまた、様々な入／出力ユニットをパラレルポート、シリアルポート、キーボードポート、マウスポート等を介して、入／出力コントローラ２２２０に接続してよい。

プログラムが、ＤＶＤ−ＲＯＭ２２０１またはＩＣカードのようなコンピュータ可読媒体によって提供される。プログラムは、コンピュータ可読媒体から読み取られ、コンピュータ可読媒体の例でもあるハードディスクドライブ２２２４、ＲＡＭ２２１４、またはＲＯＭ２２３０にインストールされ、ＣＰＵ２２１２によって実行される。これらのプログラム内に記述される情報処理は、コンピュータ２２００に読み取られ、プログラムと、上記様々なタイプのハードウェアリソースとの間の連携をもたらす。装置または方法が、コンピュータ２２００の使用に従い情報の操作または処理を実現することによって構成されてよい。

例えば、通信がコンピュータ２２００および外部デバイス間で実行される場合、ＣＰＵ２２１２は、ＲＡＭ２２１４にロードされた通信プログラムを実行し、通信プログラムに記述された処理に基づいて、通信インタフェース２２２２に対し、通信処理を命令してよい。通信インタフェース２２２２は、ＣＰＵ２２１２の制御下、ＲＡＭ２２１４、ハードディスクドライブ２２２４、ＤＶＤ−ＲＯＭ２２０１、またはＩＣカードのような記録媒体内に提供される送信バッファ処理領域に格納された送信データを読み取り、読み取られた送信データをネットワークに送信し、またはネットワークから受信された受信データを記録媒体上に提供される受信バッファ処理領域等に書き込む。

また、ＣＰＵ２２１２は、ハードディスクドライブ２２２４、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブ２２２６（ＤＶＤ−ＲＯＭ２２０１）、ＩＣカード等のような外部記録媒体に格納されたファイルまたはデータベースの全部または必要な部分がＲＡＭ２２１４に読み取られるようにし、ＲＡＭ２２１４上のデータに対し様々なタイプの処理を実行してよい。ＣＰＵ２２１２は次に、処理されたデータを外部記録媒体にライトバックする。

様々なタイプのプログラム、データ、テーブル、およびデータベースのような様々なタイプの情報が記録媒体に格納され、情報処理を受けてよい。ＣＰＵ２２１２は、ＲＡＭ２２１４から読み取られたデータに対し、本開示の随所に記載され、プログラムの命令シーケンスによって指定される様々なタイプの操作、情報処理、条件判断、条件分岐、無条件分岐、情報の検索／置換等を含む、様々なタイプの処理を実行してよく、結果をＲＡＭ２２１４に対しライトバックする。また、ＣＰＵ２２１２は、記録媒体内のファイル、データベース等における情報を検索してよい。例えば、各々が第２の属性の属性値に関連付けられた第１の属性の属性値を有する複数のエントリが記録媒体内に格納される場合、ＣＰＵ２２１２は、第１の属性の属性値が指定される、条件に一致するエントリを当該複数のエントリの中から検索し、当該エントリ内に格納された第２の属性の属性値を読み取り、それにより予め定められた条件を満たす第１の属性に関連付けられた第２の属性の属性値を取得してよい。

上で説明したプログラムまたはソフトウェアモジュールは、コンピュータ２２００上またはコンピュータ２２００近傍のコンピュータ可読媒体に格納されてよい。また、専用通信ネットワークまたはインターネットに接続されたサーバーシステム内に提供されるハードディスクまたはＲＡＭのような記録媒体が、コンピュータ可読媒体として使用可能であり、それによりプログラムを、ネットワークを介してコンピュータ２２００に提供する。

以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。

特許請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。特許請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。

１０ 制御部、１１ 画像比較部、１２ 振動制御部、２１，２２ 撮像部、３０ レーザ、３１ レンズ群、３２ フリップミラー、３３〜３８ ガルバノミラー群、４１，４２ 照明用対物レンズ、５０ 検出用対物レンズ、６０ ステージ、７０ 移動部、７１ ｘ方向移動部、７２ ｙ方向移動部、７３ ｚ方向移動部、７４ 回転ステージ、８０ ダイクロイックミラー、１００ 光シート顕微鏡、２２００ コンピュータ、２２０１ ＤＶＤ−ＲＯＭ、２２１０ ホストコントローラ、２２１２ ＣＰＵ、２２１４ ＲＡＭ、２２１６ グラフィックコントローラ、２２１８ ディスプレイデバイス、２２２０ 入／出力コントローラ、２２２２ 通信インタフェース、２２２４ ハードディスクドライブ、２２２６ ＤＶＤ−ＲＯＭドライブ、２２３０ ＲＯＭ、２２４０ 入／出力チップ、２２４２ キーボード

Claims (18)

1. 対物レンズの光軸方向に交差する方向から試料にシート状の光を照射する照射光学系と、
   前記試料と前記対物レンズとを前記光軸方向に相対的に移動する移動部と、
   前記対物レンズの像光を撮影する撮像部と、
   前記撮像部の露光中に前記移動部による前記光軸方向の移動を継続するよう制御する制御部と
   を備える顕微鏡。
2. 前記移動部による前記移動の一回の露光時間あたりの距離は、前記シート状の光の前記光軸方向におけるガウシアン分布の半値幅に予め定められた値を掛けて得られる値以下である、請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記予め定められた値は１．３である、請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記予め定められた値は０．６である、請求項２に記載の顕微鏡。
5. 前記移動部は、前記撮像部による複数回の撮像における一の撮像から終わりの撮像までの撮像期間中に等速で移動する、請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
6. 前記撮像部による一の撮像の露光開始から次の撮像の露光開始までの時間に占める前記露光時間の割合は、予め定められた割合以上である、請求項１から５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
7. 前記シート状の光を前記方向に予め定められた振幅で振動させる振動制御部をさらに備え、
   前記撮像部は、前記シート状の光が前記振動の予め定められた複数の位置にある場合の複数の画像を取得し、
   前記制御部は、前記撮像部が取得した前記複数の画像の合焦度を比較して、当該比較結果に基づいて前記シート状の光の振動中心を移動する、請求項１から６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
8. 前記予め定められた振幅は、前記シート状の光の前記光軸方向におけるガウシアン分布の半値幅の５％以上、１００％以下である、請求項７に記載の顕微鏡。
9. 前記制御部は、前記複数の画像のうち、時間的に連続した２枚の画像を比較する、請求項７又は８に記載の顕微鏡。
10. 前記撮像部は、前記シート状の光が前記振動の両端にある場合の時間的に連続した複数の画像を取得し、
    前記制御部は、前記複数の画像を比較した結果、前記振動の一端側で取得した画像が前記振動の他端側で取得した画像よりも焦点が合っている画像である場合には、合焦評価値をカウントアップし、前記振動の前記他端側で取得した画像が前記振幅の前記一端側で取得した画像よりも焦点が合っている画像である場合には、前記合焦評価値をカウントダウンする制御を行い、
    前記合焦評価値が予め定められた値を超えた場合に、前記シート状の光の前記振動中心を移動する、請求項７から９のいずれか１項に記載の顕微鏡。
11. 前記制御部は、前記複数の画像のそれぞれについて離散コサイン変換、離散フーリエ変換、離散ウェーブレット変換、ベイズスペクトラルエントロピー、ソーベルフィルタ、およびキャニー法のいずれか一つを用いて複数の画像を比較する、請求項７から１０のいずれか１項に記載の顕微鏡。
12. 前記制御部は、前記比較の対象である前記複数の画像のそれぞれを複数の領域に分割し、前記分割した前記複数の領域のそれぞれについてノルムを算出し、前記複数の領域のうち、前記算出されたノルムの値が高い複数の領域を用いて、前記複数の画像を比較する、請求項７から１０のいずれか１項に記載の顕微鏡。
13. 前記シート状の光を前記方向に予め定められた振幅で振動させる振動制御部をさらに備え、
    前記撮像部は、前記シート状の光が前記振動の予め定められた複数の位置にある場合の複数の画像を取得し、
    前記制御部は、前記撮像部が取得した前記複数の画像の合焦度を比較して、前記対物レンズの焦点位置を移動させる、請求項１から６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
14. 前記振動制御部は、ガルバノミラーを備える、請求項７から１３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
15. 前記対物レンズを前記方向に予め定められた振幅で振動させる第２の振動制御部をさらに備え、
    前記撮像部は、前記対物レンズが前記振動の予め定められた複数の位置にある場合の複数の画像を取得し、
    前記制御部は、前記撮像部が取得した前記複数の画像の合焦度を比較して、前記対物レンズの焦点位置を移動させる、請求項１から６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
16. 顕微鏡で試料を撮像する方法であって、
    対物レンズの光軸方向に交差する方向から前記試料にシート状の光を照射する照射ステップと、
    前記試料と前記対物レンズとを前記光軸方向に相対的に移動する移動ステップと、
    前記対物レンズの像光を撮影する撮像ステップと、
    前記撮像ステップの露光中に前記移動ステップによる前記光軸方向の移動を継続するよう制御する制御ステップと
    を備える方法。
17. 対物レンズの光軸方向に交差する方向から試料にシート状の光を照射する照射光学系と、
    前記試料と前記対物レンズとを前記光軸方向に相対的に移動する移動部と、
    前記対物レンズの像光を撮影する撮像部と、
    を備える顕微鏡を制御するコンピュータのプログラムであって、
    上記コンピュータに、前記撮像部の露光中に前記移動部による前記光軸方向の移動を継続するよう制御するステップを実行させる、プログラム。
18. 対物レンズの光軸方向に交差する方向から試料にシート状の光を照射する照射光学系と、
    前記試料と前記対物レンズとを前記光軸方向に相対的に移動する移動部と、
    前記対物レンズの像光を撮影する撮像部と、
    を備える顕微鏡を制御する制御装置であって、
    前記撮像部の露光中に前記移動部による前記光軸方向の移動を継続するよう制御する、制御装置。