JPWO2005114287A1 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

対物レンズ２１、及び試料Ｓの光像を分岐するビームスプリッタ２７ａ、２７ｂを含む導光光学系２０と、試料Ｓの画像を取得する光検出器３１と、ビームスプリッタ２７ａ、２７ｂで分岐される光路上に設置された焦点制御用の２つのＣＣＤカメラ３３、３４とを備えて顕微鏡装置を構成する。また、カメラ３３、３４を、ｚ軸方向に沿って互いに逆方向に導光光学系２０での光路長が変化するように、光路に対して傾いた状態でそれぞれ設置する。そして、これらのカメラ３３、３４によって取得された画像を焦点制御部３７で解析し、その解析結果に基づいて試料Ｓに対する撮像の焦点を制御する。これにより、試料の画像を取得する際の焦点制御を好適に行うことが可能な顕微鏡装置が実現される。

Description

本発明は、試料の画像の取得に用いられる顕微鏡装置に関するものである。

顕微鏡を用いて試料の画像を取得する場合、装置内の光学系、機構系の傾き、あるいは試料自体の傾き、凹凸形状などによる焦点ずれが問題となる。これに対して、従来、顕微鏡装置において、ＣＣＤカメラなどの撮像装置による撮像の焦点を制御する自動焦点（オートフォーカス）が行われている。このような焦点制御を行う装置としては、例えば、文献１：特許第３３９０１０６号公報、文献２：特開平９−２３０２５０号公報、文献３：特開平８−２１９６１号公報、文献４：特開平１１−２６４９３７号公報に記載された装置がある。
特許第３３９０１０６号公報 特開平９−２３０２５０号公報 特開平８−２１９６１号公報 特開平１１−２６４９３７号公報

上記文献のうち、文献１に記載された顕微鏡では、光軸に対して傾いた状態で設置されたラインセンサと、ラインセンサの前段に配置された回動する反射鏡とを用いる。そして、試料にレーザ光を照射して、反射鏡を介してラインセンサに入射される反射レーザ光の光量を参照して焦点を制御している。また、文献２に記載された顕微鏡では、光量を検出するフォトセンサと、フォトセンサの前段に配置された厚み変化ガラスとを用いる。そして、上記文献１と同様に試料にレーザ光を照射して、厚み変化ガラスを介してフォトセンサに入射される反射レーザ光の光量を参照して焦点を制御している。

しかしながら、これらの装置構成では、焦点を制御する際に、焦点計測用のレーザ光を試料に照射する必要がある。このため、焦点計測部分を含めた顕微鏡装置の全体として、その装置構成や撮像動作が複雑化するという問題がある。

一方、文献３に記載された顕微鏡の自動焦点装置では、試料の画像を取得するための撮像装置において、光軸に対して垂直になる垂直位置と、所定角度で傾いた傾斜位置とで取付け角度を変化させて焦点の制御を行っている。しかしながら、このような装置構成では、焦点制御の精度が充分に得られない場合がある。

また、文献４に記載された顕微鏡では、自動焦点調整部において、結像光学系から分岐された光像を検出するセンサ部を設けている。そして、このセンサ部を予定焦点面の前方及び後方にずらして、２つの光像のコントラストレベルの差分を検出して焦点調整を行っている。しかしながら、このような装置構成では、センサ部を移動させて２つの光像を取得しなくてはならないため、その装置構成や撮像動作が複雑化する。また、センサ部を移動させる際に、試料とセンサ部との間の光路長が固定されないうちに試料の光像を取り込むと光像がぼやけてしまうため、その光路長が固定されるまでの待ち時間が必要となる。このため、焦点調整及び試料の画像取得を短時間で行うことができないという問題がある。

本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、試料の画像を取得する際の焦点制御を好適に行うことが可能な顕微鏡装置を提供することを目的とする。

このような目的を達成するために、本発明による顕微鏡装置は、（１）試料の光像を焦点制御に用いられる焦点制御用光路へと導く導光光学系と、（２）焦点制御用光路上に設置され、焦点制御用光路へと導かれた光像による２次元の画像を取得する焦点制御用撮像手段と、（３）焦点制御用撮像手段によって取得された画像を解析し、その解析結果に基づいて、試料を撮像する際の焦点制御情報を取得する焦点制御手段とを備え、（４）焦点制御用撮像手段は、撮像面内において所定の変化方向に沿って導光光学系での光路長が変化するように構成された第１撮像手段と、撮像面内において変化方向に沿うとともに第１撮像手段とは異なる変化率で光路長が変化するように構成された第２撮像手段とを有することを特徴とする。

上記した顕微鏡装置においては、画像取得の対象となる試料に対して、焦点制御に用いられる撮像手段として、２次元の画像を取得可能な撮像手段を用いるとともに、光像が試料から導光される光路長が所定方向で変化する撮像条件となるように撮像手段を配置している。このような撮像手段を用いて取得された２次元の画像を解析して焦点制御を行う構成によれば、試料への焦点計測用のレーザ光の照射等が不要となる。したがって、焦点計測部分を含めた顕微鏡装置の全体として、その装置構成や撮像動作を簡単化することができる。

また、上記した装置では、所定の変化方向に沿って互いに異なる変化率で光路長が変化するように構成された第１撮像手段及び第２撮像手段によって焦点制御用撮像手段を構成している。これらの撮像手段によって取得された２種類の画像を用いて焦点計測を行うことにより、試料の画像を取得する際の焦点制御情報を精度良く求めることが可能となる。また、このようにして求められた焦点制御情報を用いれば、試料の画像を取得する際に焦点制御を好適に行うことが可能となる。また、焦点制御用撮像手段を構成する第１撮像手段及び第２撮像手段については、所定の変化方向に沿って互いに逆方向に光路長が変化するように構成することが好ましい。これにより、取得される焦点制御情報の精度を向上することができる。

ここで、上記した顕微鏡装置は、導光光学系が、試料の光像を焦点制御に用いられる焦点制御用光路、及び試料を撮像する際に用いられる画像取得用光路へと導くように構成され、画像取得用光路上に設置され、画像取得用光路へと導かれた光像による１次元または２次元の画像の取得に用いられる画像取得用撮像手段と、画像取得用撮像手段による画像の取得を制御する画像取得制御手段とを備えることが好ましい。これにより、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを好適に両立することができる。なお、画像取得制御手段は、さらに試料に対する撮像位置の設定を制御することとしても良い。

具体的な構成としては、導光光学系は、試料の光像を画像取得用光路及び焦点制御用光路へと分岐する光分岐手段を含み、画像取得用撮像手段は、焦点制御用撮像手段とは別個に構成されることとしても良い。これは、焦点制御用及び画像取得用の撮像手段として別個の撮像装置を用いる構成である。

あるいは、導光光学系は、焦点制御用光路と同一の光路を画像取得用光路として構成され、画像取得用撮像手段は、焦点制御用撮像手段に含まれる一の撮像装置を用いて構成されることとしても良い。これは、焦点制御用及び画像取得用の撮像手段として同一の撮像装置を用いる構成である。

焦点制御用の画像を取得するための焦点制御用撮像手段の具体的な構成については、第１撮像手段及び第２撮像手段のそれぞれは、変化方向に沿って光路長が変化するように撮像面が焦点制御用光路に対して所定角度で傾いた状態で設置された撮像装置を有する構成を用いることができる。このような構成によれば、焦点制御用の画像取得を好適に行うことができる。

あるいは、第１撮像手段及び第２撮像手段のそれぞれは、撮像装置と、撮像装置の撮像面に対して所定位置に、変化方向に沿って光路長が変化するように設置された光路長変更手段とを有する構成を用いることができる。このような構成によっても、焦点制御用の画像取得を好適に行うことができる。このような光路長変更手段としては、例えば、所定勾配のウエッジ形状に形成され光を透過する光路長変更部材がある。

あるいは、焦点制御用撮像手段は、単一の撮像装置を有し、第１撮像手段は、撮像装置の撮像面の第１撮像領域に対して所定位置に、変化方向に沿って光路長が変化するように設置された第１光路長変更手段を用いて構成され、第２撮像手段は、撮像装置の撮像面の第２撮像領域に対して所定位置に、変化方向に沿うとともに第１光路長変更手段とは異なる変化率で光路長が変化するように設置された第２光路長変更手段を用いて構成されていることとしても良い。このような構成では、焦点制御用撮像手段が単一の撮像装置から構成されるため、その装置構成を簡単化することができる。

この場合、第１光路長変更手段及び第２光路長変更手段を、撮像装置の撮像面に対して焦点制御用光路上にある位置、及び焦点制御用光路から外れた位置の間で駆動する駆動手段を備える構成を用いることができる。

あるいは、撮像装置は、その撮像面が、第１撮像領域及び第２撮像領域を含んで焦点制御用撮像手段として機能する焦点計測領域と、試料を撮像する際に用いられる画像取得用撮像手段として機能する画像取得領域とを有する構成を用いることができる。これらの構成では、焦点制御用及び画像取得用の撮像手段を単一の撮像装置から構成することが可能となる。

また、上記構成において、第１光路長変更手段と第２光路長変更手段とは、変化方向に沿うとともに互いに逆方向に光路長が変化するように設置されていることが好ましい。これにより、取得される焦点制御情報の精度を向上することができる。

焦点制御用撮像手段によって取得された画像を用いた焦点制御情報の取得については、焦点制御手段は、焦点制御用撮像手段によって取得された画像における変化方向についての画像のコントラスト変化を解析し、その解析結果に基づいて焦点制御情報を取得することが好ましい。これにより、試料の光像による２次元の画像を用いた撮像の焦点制御を精度良く実現することができる。

この場合、具体的には、焦点制御手段は、焦点制御用撮像手段によって取得された画像から変化方向に沿った所定幅の計測対象画像を切り出し、計測対象画像、及び計測対象画像を変化方向と垂直方向にシフトさせたシフト画像の差分絶対値画像によって画像のコントラスト変化を解析する構成を用いることが好ましい。

さらに、焦点制御手段は、焦点制御用撮像手段によって取得された画像が焦点制御情報の取得に適用可能な画像であるかどうかを判断し、適用可能と判断した場合に画像を解析し、その解析結果に基づいて焦点制御情報を取得することが好ましい。これにより、不適当な画像を用いて焦点制御が行われることを防止して、撮像の焦点制御を好適に行うことができる。

本発明の顕微鏡装置によれば、所定の変化方向に沿って互いに異なる変化率で光路長が変化するように構成され、２次元の画像を取得可能な第１撮像手段及び第２撮像手段を有する焦点制御用撮像手段を設け、これらの撮像手段によって取得された２種類の画像を用いて焦点計測を行うことにより、試料の画像を取得する際の焦点制御情報を精度良く求めて、焦点制御を好適に行うことが可能となる。

図１は、顕微鏡装置の第１実施形態の構成を示すブロック図である。 図２は、焦点制御部の構成の一例を示すブロック図である。 図３は、単一の撮像装置を用いた場合の焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。 図４は、図３に示した焦点制御方法について示す模式図である。 図５は、２つの撮像装置を用いた場合の焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。 図６は、単一の撮像装置を用いた場合の焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。 図７は、単一の撮像装置を用いた場合の焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。 図８は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。 図９は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。 図１０は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。 図１１は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。 図１２は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。 図１３は、図８〜図１２に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。 図１４は、図８〜図１２に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。 図１５は、顕微鏡装置の第２実施形態の構成を示すブロック図である。 図１６は、光路長変更部材の構成の例を示す斜視図である。 図１７は、顕微鏡装置の第３実施形態の構成を示すブロック図である。 図１８は、焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。 図１９は、顕微鏡装置の第４実施形態の構成を示すブロック図である。 図２０は、顕微鏡装置の第５実施形態の構成を示すブロック図である。 図２１は、撮像装置及び光路長変更部材の構成の例を示す斜視図である。 図２２は、焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。 図２３は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。 図２４は、顕微鏡装置の第６実施形態の構成を示すブロック図である。 図２５は、焦点制御用の撮像装置に対する光分岐光学系について示す図である。

符号の説明

１０…照射光源、１１…集光レンズ、１５…試料ステージ（ＸＹステージ）、１６…ＸＹステージ駆動部、２０…導光光学系、２１…対物レンズ、２２…ピエゾアクチュエータ、２３…ピエゾ駆動部、２７ａ、２７ｂ…ビームスプリッタ、２８、２９ａ、２９ｂ…結像レンズ、２９ｃ…駆動モータ、３１、４１…光検出器、３３、３４、４３、４４、５１…ＣＣＤカメラ、４３ａ、４４ａ、５１ａ、５１ｂ、５３ａ、５３ｂ…光路長変更部材、５３ｃ…光路長調整部材、５２…駆動モータ、３６、４６、５６…画像取得制御部、３７、４７、５７…焦点制御部、３７ａ…Ａ／Ｄ変換器、３７ｂ…画像メモリ、３７ｃ…データ処理部、３７ｄ…データ記憶部、８０…照射光源、８１…レンズ、８５…照射光学系、８６…ダイクロイックミラー、８７…励起フィルタ、８８…カットフィルタ。

以下、図面とともに本発明による顕微鏡装置の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。

図１は、本発明による顕微鏡装置の第１実施形態の構成を示すブロック図である。この顕微鏡装置は、試料Ｓの画像の取得に用いられる透過型の顕微鏡として構成されている。画像取得の対象となる試料Ｓは、例えば生物サンプルであり、試料ステージ１５上に載置されている。

試料ステージ１５は、ｘ方向及びｙ方向（水平方向）に可動なＸＹステージからなり、このＸＹステージ１５をｘｙ面内で駆動することにより、試料Ｓに対する撮像位置が設定または変更される。また、試料ステージ１５は、ＸＹステージ駆動部１６によって駆動制御されている。試料ステージ１５の下方には、撮像対象となる光像を生成するための光を試料Ｓへと照射する照射光源１０、及び照射光源１０からの光を試料Ｓで設定されている撮像位置へと集光する集光レンズ１１が設置されている。

照射光源１０からの光が照射される試料ステージ１５上の試料Ｓに対し、試料ステージ１５の上方に、試料Ｓの光像を導光するための導光光学系２０が設けられている。本実施形態においては、導光光学系２０は、試料Ｓからの光が入射する対物レンズ２１と、対物レンズ２１の後段に配置されたビームスプリッタ２７ａ、２７ｂとを有している。このうち、ビームスプリッタ２７ａ、２７ｂは、試料Ｓの光像を画像取得用光路及び焦点制御用光路へと分岐する光分岐手段である。

図１においては、対物レンズ２１からの光がビームスプリッタ２７ａ、２７ｂを通過する光路が、試料Ｓを撮像する際に用いられる画像取得用光路となっている。また、対物レンズ２１からの光がビームスプリッタ２７ａで反射される光路、及びビームスプリッタ２７ｂで反射される光路が、それぞれ試料Ｓを撮像する際の焦点制御情報の取得に用いられる焦点制御用光路となっている。

前段のビームスプリッタ２７ａ、及び後段のビームスプリッタ２７ｂは、それぞれ画像取得用光路に対して約４５°の角度で配置されており、ビームスプリッタ２７ａ、２７ｂからの焦点制御用光路のそれぞれは、画像取得用光路に対して略直交している。ここで、説明の便宜のため、照射光源１０及び対物レンズ２１を含む顕微鏡光学系の光軸方向であり、画像取得用光路に沿う方向をｚ軸方向、画像取得用光路に直交する焦点制御用光路に沿う方向をｙ軸方向、ｙ軸及びｚ軸に直交する方向をｘ軸方向とする。

また、対物レンズ２１に対して、ピエゾアクチュエータ２２が設けられている。ピエゾアクチュエータ２２は、対物レンズ２１をｚ軸方向（垂直方向、光軸方向）に駆動する対物レンズ駆動手段である。また、ピエゾアクチュエータ２２は、ピエゾ駆動部２３によって駆動制御されている。本顕微鏡装置では、このピエゾアクチュエータ２２を用いて対物レンズ２１のｚ軸方向の位置を変えることにより、試料Ｓの画像取得における撮像の焦点が調整可能になっている。

画像取得用光路上には、ビームスプリッタ２７ａ、２７ｂを通過した試料Ｓの光像の結像面に対応する位置に、光検出器３１が設置されている。光検出器３１は、ビームスプリッタ２７ａ、２７ｂで画像取得用光路へと分岐された光像による画像の取得に用いられる画像取得用撮像手段である。この光検出器３１としては、具体的には、試料Ｓの１次元の画像を取得可能なリニアセンサ、または２次元の画像を取得可能なイメージセンサが用いられる。

一方、前段の焦点制御用光路上には、ビームスプリッタ２７ａで反射された試料Ｓの光像の結像面に対応する位置に、撮像装置３３が設置されている。また、後段の焦点制御用光路上には、ビームスプリッタ２７ｂで反射された試料Ｓの光像の結像面に対応する位置に、撮像装置３４が設置されている。撮像装置３３、３４は、それぞれ２次元の画像を取得可能なＣＣＤカメラからなる。

ＣＣＤカメラ３３、３４は、ビームスプリッタ２７ａ、２７ｂで分岐された光像による画像を取得する第１、第２撮像手段であり、これらのカメラ３３、３４によって、本実施形態における焦点制御用撮像手段が構成されている。すなわち、図１に示した顕微鏡装置では、これらのＣＣＤカメラ３３、３４によって取得される試料Ｓの２次元の画像を用いて、試料Ｓを光検出器３１によって撮像する際の焦点制御情報の取得、及び得られた焦点制御情報に基づく焦点制御が行われる。

具体的には、焦点制御用撮像手段の第１撮像手段であるＣＣＤカメラ３３は、その撮像面が光路に直交するｘｚ面と略一致するとともに、ｚ軸方向を傾き方向として角度θで光路に対して傾いた状態で設置されている。このとき、ＣＣＤカメラ３３の撮像面内において、ｚ軸方向を変化方向として、試料ＳからＣＣＤカメラ３３へと光が導かれる導光光学系２０での光路長がｚ軸方向に沿って変化するようになっている。

また、焦点制御用撮像手段の第２撮像手段であるＣＣＤカメラ３４は、その撮像面が光路に直交するｘｚ面と略一致するとともに、ｚ軸方向を傾き方向として角度θで光路に対してカメラ３３とは逆方向に傾いた状態で設置されている。このとき、ＣＣＤカメラ３４の撮像面内において、ｚ軸方向を変化方向として、試料ＳからＣＣＤカメラ３４へと光が導かれる導光光学系２０での光路長がｚ軸方向に沿うとともにカメラ３３とは逆方向に変化するようになっている。

これらの試料ステージ１５、導光光学系２０、光検出器３１、及びＣＣＤカメラ３３、３４に対し、画像取得制御部３６、及び焦点制御部３７が設けられている。画像取得制御部３６は、試料Ｓの画像の取得、及び試料Ｓに対する撮像位置の設定を制御することによって、試料Ｓの画像取得動作を制御する制御手段である。具体的には、画像取得制御部３６は、光検出器３１による画像の取得を制御する。また、制御部３６は、ＸＹステージ駆動部１６を介して試料ステージ１５を駆動制御することにより、試料ステージ１５上に載置された試料Ｓで顕微鏡光学系の光軸上にある撮像位置を設定または変更する。

焦点制御部３７は、ＣＣＤカメラ３３、３４によって取得された画像について所定の解析方法で解析を行う。そして、その解析結果に基づいて、光検出器３１によって試料Ｓを撮像する際の焦点制御情報を取得する。あるいはさらに、焦点制御部３７は、取得された焦点制御情報に基づいて、光検出器３１による撮像の焦点を制御する。本実施形態においては、焦点制御部３７は、ピエゾ駆動部２３を介してピエゾアクチュエータ２２を駆動制御して対物レンズ２１のｚ軸方向の位置を調整することにより、撮像の焦点制御を行う。

ここで、焦点制御用撮像手段であるカメラ３３、３４は、上記したようにそれぞれ焦点制御用光路の光軸に対して傾いて配置されている。このため、ＣＣＤカメラ３３、３４によって取得される２次元の画像は、それぞれｚ軸方向に沿って焦点位置からのずれが変化する画像となる。このような所定の変化方向に沿って焦点位置からのずれが変化する画像を、焦点制御部３７において解析することにより、撮像の焦点のずれ、焦点調整の必要性の有無、焦点を合わせるために必要な補正量などについての焦点制御情報が得られる。さらに、カメラ３３、３４によって取得される画像は、焦点位置からのずれが変化する方向が互いに逆方向となる。このような２種類の画像を用いることにより、焦点制御情報を精度良く求めることが可能となる。

図２は、焦点制御部３７の具体的な構成の一例を示すブロック図である。本構成例においては、焦点制御部３７は、Ａ／Ｄ変換器３７ａ、画像メモリ３７ｂ、データ処理部３７ｃ、及びデータ記憶部３７ｄから構成されている。ＣＣＤカメラ３３、３４によって取得された画像のデータ信号は、Ａ／Ｄ変換器３７ａでＡ／Ｄ変換された後、焦点制御用の画像データとして画像メモリ３７ｂに格納される。データ処理部３７ｃは、画像メモリ３７ｂから必要な画像データを読み出し、その解析を行うとともに、解析結果に基づいて、試料Ｓを光検出器３１によって撮像する際の焦点制御情報を取得して、データ記憶部３７ｄに情報を記憶する。また、実際に光検出器３１によって試料Ｓの画像の取得を行う場合には、データ処理部３７ｃは、取得された焦点制御情報を参照してピエゾ駆動部２３を制御し、撮像の焦点制御を行う。

本実施形態による顕微鏡装置の効果について説明する。

図１に示した顕微鏡装置においては、画像取得の対象となる試料Ｓに対して、焦点制御に用いられる撮像手段として、２次元の画像を取得可能なＣＣＤカメラ３３、３４を用いるとともに、光像が試料Ｓから導光される光路長が所定方向で変化する撮像条件となるようにそれぞれのカメラ３３、３４を配置している。このようなカメラ３３、３４を用いて取得された２次元の画像を解析して焦点制御を行う構成によれば、試料への焦点計測用のレーザ光の照射等が不要となる。したがって、焦点計測部分を含めた顕微鏡装置の全体として、その装置構成や撮像動作を簡単化することができる。

また、上記した装置では、所定の変化方向に沿って互いに逆方向に光路長が変化するように構成された第１撮像手段であるＣＣＤカメラ３３、及び第２撮像手段であるＣＣＤカメラ３４によって焦点制御用撮像手段を構成している。このような撮像手段によって取得された２種類の画像を用いて焦点計測を行うことにより、試料Ｓの画像を画像取得用撮像手段である光検出器３１によって取得する際の焦点制御情報を精度良く求めることが可能となる。また、このようにして求められた焦点制御情報を用いれば、試料Ｓの画像を取得する際に焦点制御を好適に行うことが可能となる。

具体的には、上記構成では、ｚ軸方向を傾き方向として互いに逆方向に傾いた状態で設置された２つのＣＣＤカメラ３３、３４を、焦点制御情報の取得に用いている。このように、逆方向に傾いた２つの撮像装置を用いて焦点計測を行うことにより、試料Ｓ自体のコントラストパターンが不均一な場合においても、その影響を低減して好適に焦点制御を行うことができる。また、このような構成では、２つのカメラ３３、３４を光軸に対して傾きが対称となるように配置することが好ましい。

なお、焦点制御部３７による焦点制御情報の取得の実行と、実際の焦点制御の実行とについては、光検出器３１による画像取得をカメラ３３、３４による焦点計測と並行して同時に行うことが可能である。この場合には、カメラ３３、３４で取得された画像から焦点制御部３７において焦点制御情報を求めると同時に、その情報を用いて撮像の焦点をフィードバック制御することができる。

このように、光検出器３１による試料Ｓの画像の取得を行いつつ、ＣＣＤカメラ３３、３４によって取得される試料Ｓの２次元の画像を用いた焦点制御をリアルタイムで行うリアルタイムフォーカス技術は、試料Ｓの画像取得作業を高速化する上で有効である。例えば、近年、生物サンプルの全体を画像データとして電子化するバーチャルスライドの開発がすすめられているが、このようなサンプルの電子化を高速で行うためには、リアルタイムでの焦点制御が非常に重要となる。

あるいは、光検出器３１による画像取得と、カメラ３３、３４による焦点計測とを別々に行うこととしても良い。例えば、あらかじめ試料Ｓでの撮像位置をスキャンしつつカメラ３３、３４による焦点計測を行って、試料Ｓに対する焦点制御情報のマップを作成することも可能である。この場合、焦点制御情報のマップを作成した後に、そのマップを参照して焦点制御を実行して、試料Ｓでの撮像位置をスキャンしつつ光検出器３１による画像取得を行えば良い。このように、焦点制御情報のマップの作成を行う際には、画像取得用の光検出器３１は不要である。また、焦点計測においては、導光光学系２０は、試料Ｓの光像が焦点制御用光路へと導かれるように構成されていれば良い。この場合、ビームスプリッタなどの光分岐手段は、不要であれば設けなくても良い。

なお、焦点制御情報のマップの作成においては、必ずしも試料Ｓのすべての撮像領域に対して焦点計測及び焦点制御情報の取得を実行しなくても良い。例えば、試料Ｓ上において適宜選択された複数の撮像領域に対して焦点計測を行って焦点制御情報を取得する。そして、得られた複数の焦点制御情報を利用し、焦点計測を未実行の撮像領域について焦点制御情報を補間処理することによって、撮像領域全体についての焦点制御情報のマップを作成することが可能である。このような方法では、焦点制御情報のマップの作成に要する時間が短縮される。

また、本実施形態においては、焦点制御用撮像手段を構成するＣＣＤカメラ３３、３４について、上記したように所定の変化方向に沿って互いに逆方向に光路長が変化するように構成している。これにより、取得される焦点制御情報の精度を向上することができる。この焦点制御用撮像手段の第１撮像手段及び第２撮像手段については、一般には、所定の変化方向に沿って互いに異なる変化率で光路長が変化するように構成すれば良い。そのような構成としては、例えば、同方向であるが互いに異なる変化量で光路長が変化する構成がある。

また、上記実施形態では、試料Ｓから光検出器３１への焦点制御を、ピエゾアクチュエータ２２を駆動制御して対物レンズ２１のｚ軸方向の位置を調整することによって行っている。これにより、ＣＣＤカメラ３３、３４で取得された画像を用いた焦点のフィードバック制御を高速で確実に実行することができる。ただし、このような焦点制御には、対物レンズ２１を駆動する構成に限らず、例えば試料Ｓが載置される試料ステージ１５をｚ軸方向に駆動する構成を用いても良い。また、対物レンズ２１や試料ステージ１５を駆動する駆動機構としては、ピエゾアクチュエータ以外にも、例えばステッピングモータなどを用いることができる。

また、焦点制御に用いられる試料Ｓの２次元の画像を取得するための撮像装置については、ＣＣＤカメラ以外にも、例えばＣＭＯＳ型の撮像装置など、２次元の画像を取得可能な他の撮像装置を用いても良い。

図１に示した顕微鏡装置における焦点制御方法について説明する。

まず、焦点制御用撮像手段として単一のＣＣＤカメラ３３のみを用いた場合の焦点制御方法について説明しておく。図３は、焦点制御方法の具体的な一例を示すフローチャートである。また、図４は、図３に示した焦点制御方法について示す模式図である。なお、以下に説明する焦点制御は、図１に示した構成において焦点制御部３７によって行われる。

この制御方法では、まず、図４に示すように、ＣＣＤカメラ３３により、その撮像面の傾き方向であるｚ軸方向にａ画素、傾きと垂直方向であるｘ軸方向にｂ画素で、ａ×ｂ画素からなる試料Ｓの２次元の画像Ｘを取得する（ステップＳ１０１）。そして、この画像Ｘから、傾き方向の全幅（ａ画素）、傾きと垂直方向の一定の幅（ｂ’画素）からなる、傾き方向に沿った計測対象画像Ｘ’を切り出す（Ｓ１０２）。

次に、切り出した計測対象画像Ｘ’について、傾きと垂直方向に一定画素（ｓ画素）だけシフトさせたシフト画像Ｘ”を作成する（Ｓ１０３）。また、画像Ｘ”と画像Ｘ’との間で差分（Ｘ’−Ｘ”）をとり、さらに、その絶対値｜Ｘ’−Ｘ”｜の計算を行って、差分絶対値画像Ｙを作成する（Ｓ１０４）。この差分画像Ｙは、計測対象画像Ｘ’をシフトさせた画素分が無効画素となるため、ａ×（ｂ’−ｓ）画素の画像となる。ここで、計測対象画像Ｘ’をシフトさせる画素数ｓについては、光学的な倍率及び対物レンズの開口数ＮＡを考慮して適当な画素数を選択することが好ましい。

続いて、差分絶対値画像Ｙについて、傾きと垂直方向のｂ’−ｓ画素分で平均値を求めて、傾き方向のａ画素のデータ列Ｚを作成する（Ｓ１０５）。この差分絶対値画像Ｙ、及び傾きと垂直方向について平均したデータ列Ｚは、傾き方向に沿った計測対象画像Ｘ’の各位置での画像成分の微分の絶対値を求めたものに相当する。

一方、画像取得の対象となる試料Ｓのコントラストパターンが均一な場合、カメラ３３で取得される画像では、焦点が合っているほど画像のコントラストが大きくなる。また、画像のコントラストが大きいと、対応する画像成分の微分の絶対値が大きくなる。したがって、データ列Ｚにおいて、傾き方向についての画像のコントラスト変化に相当するデータ値の変化を求める解析を行うことにより、焦点制御についての情報が得られる。また、その解析結果を参照することにより、撮像の焦点制御を好適に実行することができる。

図３においては、具体的には、図４に示すように、データ列Ｚの各データについて、その傾き方向に沿った中心位置のアドレスを０、前方に傾いているｚ軸の正の方向にある各位置のアドレスを−、後方に傾いているｚ軸の負の方向にある各位置のアドレスを＋として、それぞれの位置のデータにアドレスを割り振る。そして、そのデータ列Ｚでのアドレスとデータとの積をとり、それらの総和Ｔを計算する（Ｓ１０６）。

このようにして求められる総和Ｔにおいて、総和Ｔが負の値の場合、現在の焦点位置は正しい焦点位置よりも近い位置にあり、また、その絶対値が大きいほど正しい焦点位置からのずれが大きい。一方、総和Ｔが正の値の場合、現在の焦点位置は正しい焦点位置よりも遠い位置にあり、また、その絶対値が大きいほど正しい焦点位置からのずれが大きい。したがって、このような総和Ｔの値を参照して焦点制御を行えば、実際の焦点位置を正しい焦点位置に近付けることができる。

この場合の具体的な制御方法としては、例えば、総和Ｔに対して負の側の閾値ｍ、及び正の側の閾値ｎを設定しておき、総和Ｔがこれらの閾値ｍ〜ｎの範囲外になったときに焦点位置を調整する方法がある。この方法では、図３に示すように、総和Ｔが負の閾値ｍよりも小さい（Ｔ＜閾値ｍ）かどうかを判定する（Ｓ１０７）。そして、閾値ｍよりも小さい場合に、焦点位置を上げるように焦点制御を行う（Ｓ１０８）。また、総和Ｔが正の閾値ｎよりも大きい（Ｔ＞閾値ｎ）かどうかを判定する（Ｓ１０９）。そして、閾値ｎよりも大きい場合に、焦点位置を下げるように焦点制御を行う（Ｓ１１０）。

以上のステップＳ１０１〜Ｓ１１０の焦点制御動作を、試料Ｓでの撮像位置をスキャンしつつ繰返し行うことにより、試料Ｓの画像を良好な画質で高速に取得することが可能となる。

なお、上記した焦点制御方法では、データ列Ｚの作成を画素毎に行っているが、データ列Ｚの具体的な作成方法は上記方法に限定されない。例えば、複数画素毎にサンプリングによる間引き処理を行ってデータ列Ｚを作成しても良い。このような方法では、焦点制御をさらに高速化することができる。

次に、焦点制御用撮像手段として上記したＣＣＤカメラ３３、３４の２つのカメラを用いた場合の焦点制御方法について説明する。図５は、焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。なお、以下に説明する焦点制御は、図１に示した構成において焦点制御部３７によって行われる。また、画像の具体的な解析方法については、図３及び図４に示した焦点制御方法と同様である。

この制御方法では、まず、ＣＣＤカメラ３３、３４により、試料Ｓの２つの２次元の画像Ｘ_１，Ｘ_２を取得する（ステップＳ５０１）。そして、これらの画像Ｘ_１，Ｘ_２から、それぞれ傾き方向に沿った計測対象画像Ｘ_１’，Ｘ_２’を切り出す（Ｓ５０２）。これらの計測対象画像Ｘ_１’，Ｘ_２’は、上記したように、ｚ軸方向について逆方向に傾いた画像である。

次に、切り出した計測対象画像Ｘ_１’，Ｘ_２’について、傾きと垂直方向に一定画素だけシフトさせたシフト画像Ｘ_１”，Ｘ_２”を作成する（Ｓ５０３）。また、カメラ３３で取得された画像Ｘ_１について、画像Ｘ_１”と画像Ｘ_１’との間で差分（Ｘ_１’−Ｘ_１”）をとり、さらに、その絶対値｜Ｘ_１’−Ｘ_１”｜の計算を行って、差分絶対値画像Ｙ_１を作成する。また、カメラ３４で取得された画像Ｘ_２について、画像Ｘ_２”と画像Ｘ_２’との間で差分（Ｘ_２’−Ｘ_２”）をとり、さらに、その絶対値｜Ｘ_２’−Ｘ_２”｜の計算を行って、差分絶対値画像Ｙ_２を作成する（Ｓ５０４）。

続いて、差分絶対値画像Ｙ_１，Ｙ_２について、傾きと垂直方向で平均値を求めて、傾き方向のデータ列Ｚ_１，Ｚ_２を作成する（Ｓ５０５）。また、データ列Ｚ_１，Ｚ_２の各データについて、中心位置のアドレスを０として、それぞれの位置のデータにアドレスを割り振る。そして、そのデータ列Ｚ_１，Ｚ_２でのアドレスとデータとの積をとり、それらの総和Ｔ_１，Ｔ_２を計算する（Ｓ５０６）。なお、データ列Ｚ_１，Ｚ_２に対するアドレスの割り振りは、撮像面の傾き方向であるｚ軸方向について同方向に行う。

図５に示す焦点制御方法においては、さらに、これらのカメラ３３、３４で取得された２画像Ｘ_１，Ｘ_２に対して求められた総和Ｔ_１，Ｔ_２について、その差分Ｔ＝Ｔ_１−Ｔ_２を計算する（Ｓ５１１）。そして、この総和の差分Ｔを参照して、閾値ｍ，ｎを用いた焦点制御を行う（Ｓ５０７〜Ｓ５１０）。

以上のステップＳ５０１〜Ｓ５１１の焦点制御動作を、試料Ｓでの撮像位置をスキャンしつつ繰返し行うことにより、試料Ｓの画像を良好な画質で高速に取得することが可能となる。特に、本実施形態においては、互いに逆方向に傾いたＣＣＤカメラ３３、３４によって取得された画像Ｘ_１，Ｘ_２を用い、それぞれについて求められた総和Ｔ_１，Ｔ_２の差分Ｔをとって焦点制御を行うことにより、試料Ｓ自体のコントラストパターンの影響を低減することができる。なお、上記した焦点制御方法において、焦点制御情報のマップの作成など、焦点制御情報の取得のみを行う場合には、得られた焦点制御についての情報をデータ記憶部に記憶しておき、必要に応じて焦点制御に用いれば良い。

なお、上記した焦点制御方法では、データ列Ｚ_１，Ｚ_２の作成を画素毎に行っているが、データ列Ｚ_１，Ｚ_２の具体的な作成方法は上記方法に限定されない。例えば、複数画素毎にサンプリングによる間引き処理を行ってデータ列Ｚ_１，Ｚ_２を作成しても良い。このような方法では、焦点制御をさらに高速化することができる。

また、具体的な焦点の制御方法については、上記した方法以外にも、以下の図６、図７に示すように、様々な方法を用いることができる。なお、図６、図７に示すフローチャートは、それぞれ単一のＣＣＤカメラを用いる場合の図３に対応するものであるが、２つのＣＣＤカメラを用いる場合の図５の焦点制御方法に対しても、同様に適用可能である。

図６は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。この制御方法において、ステップＳ２０１〜Ｓ２１０については、図３の制御方法におけるステップＳ１０１〜Ｓ１１０と同様である。

この制御方法では、差分絶対値画像Ｙを作成するステップＳ２０４と、傾き方向のデータ列Ｚを作成するステップＳ２０５との間に、ノイズ除去を行うステップＳ２１１を設けている。ここでは、差分絶対値画像Ｙにおける画像のノイズなどの焦点制御への影響を取り去るために、各画素のデータ値に対してノイズレベルｐを設定している。

そして、差分絶対値画像Ｙの各画素のうち、そのデータ値がノイズレベルｐよりも小さければ、ノイズデータであるとしてその画素のデータ値を０とし、ノイズ除去がなされた差分絶対値画像Ｙ’を作成する（Ｓ２１１）。傾き方向のデータ列Ｚは、このノイズ除去画像Ｙ’を用いて作成される。これにより、導光光学系２０やＣＣＤカメラ３３に起因するノイズなどが焦点制御に与える影響を抑制することができる。

図７は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。この制御方法において、ステップＳ３０１〜Ｓ３１０については、図３の制御方法におけるステップＳ１０１〜Ｓ１１０と同様である。

この制御方法では、焦点制御部３７は、ＣＣＤカメラ３３によって取得された画像が撮像の焦点の制御に適用可能な画像であるかどうかを判断する。そして、適用可能であると判断した場合に画像を解析し、その解析結果に基づいて撮像の焦点を制御することとしている。

具体的には、まず、計測対象画像Ｘ’を切り出すステップＳ３０２と、シフト画像Ｘ”を作成するステップＳ３０３との間に、ステップＳ３１１〜Ｓ３１３を追加している。ここでは、計測対象画像Ｘ’について、画像Ｘ’をブロックに分割し、それぞれのブロックの標準偏差を計算して、標準偏差データ列ＳＤを作成する。また、この標準偏差データ列ＳＤから、その標準偏差Ｓｄ_ＳＤ及び平均値Ａｖ_ＳＤを計算し（Ｓ３１１）、標準偏差と平均値との比Ｓｄ_ＳＤ／Ａｖ_ＳＤが閾値ｐよりも大きい（Ｓｄ_ＳＤ／Ａｖ_ＳＤ＞閾値ｐ）かどうかを判断する（Ｓ３１２）。そして、閾値ｐよりも大きい場合に、試料Ｓ自体のコントラストが不均一であり、したがって、焦点位置の判断不可（Ｓ３１３）であるとして焦点制御を行わないこととする。

また、傾き方向のデータ列Ｚを作成するステップＳ３０５と、データ列Ｚのアドレスとデータとの積の総和Ｔを計算するステップＳ３０６との間に、ステップＳ３２１、Ｓ３２２を追加している。ここでは、計測対象画像Ｘ’について、傾きと垂直方向のｂ’画素分で平均値を求めて、傾き方向のａ画素のデータ列Ａを作成するとともに、データ列Ｚの平均値／データ列Ａの平均値（変化量／明るさ、すなわちコントラストに相当）が閾値ｒよりも小さい（Ｚの平均値／Ａの平均値＜閾値ｒ）かどうかを判定する（Ｓ３２１）。そして、閾値ｒよりも小さい場合に、撮像位置に試料Ｓが存在しないか、または焦点が大きくずれており、したがって、焦点位置の判断不可（Ｓ３２２）であるとして焦点制御を行わないこととする。

このように、ＣＣＤカメラによって取得された画像について焦点制御に適当な画像かどうかを判断した上で画像の解析及び焦点制御を行うことにより、不適当な画像を用いて焦点制御が行われることを防止して、撮像の焦点制御を好適に行うことができる。

なお、上記した各焦点制御方法では、焦点制御用の画像のコントラスト変化の解析を、撮像面の傾き方向に沿って所定幅で切り出した計測対象画像と、そのシフト画像との差分絶対値画像を用いて行っている。このような方法を用いることにより、画像のコントラスト変化を簡易な方法で確実に解析することができる。ただし、コントラストの具体的な解析方法については、上記以外の方法を用いても良い。

また、上記した焦点制御方法では、データ列Ａ及びＺの作成を画素毎に行っているが、これらのデータ列の具体的な作成方法は上記方法に限定されない。例えば、複数画素毎にサンプリングによる間引き処理を行って各データ列を作成しても良い。このような方法では、焦点制御をさらに高速化することができる。

また、図７に示した方法では、ステップＳ３１１及びＳ３１２において画像Ｘ’を分割するブロックは、２次元マトリクス状の分割に限らず、一方向のブロック分割としても良い。また、ブロックのサイズについては、光学的な倍率、ＣＣＤカメラのサイズ、画素数等を考慮して適当なサイズに設定することが好ましい。

また、上記方法では、ステップＳ３１３及びＳ３２２において、対象画像が均一なコントラストパターンでない場合、あるいは画像の一部にのみ試料Ｓが存在して充分なコントラストレベルが得られない場合等に、焦点位置が判断不可であるとして焦点制御を行わないこととしている。これに対して、ステージ１５を駆動させて試料Ｓの画像を順次取得する際には、焦点位置が判断不可の撮像位置に関する焦点制御情報は、他の撮像位置についての焦点制御情報を参照して設定しても良い。この場合、例えば、焦点位置が判断不可の撮像位置に関する焦点制御情報を、一連の焦点計測で取得されてデータ記憶部３７ｄに記憶された任意の焦点制御情報、もしくは直近（最新）の焦点制御情報と同一とみなして焦点制御を実行する方法を用いることができる。

また、ＣＣＤカメラ３３、３４によって取得された画像を用いた焦点制御については、画像のコントラスト変化を解析する方法を用いることにより、撮像の焦点制御を精度良く実現することができる。ただし、このような焦点制御方法については、コントラスト変化を用いる以外の方法を用いても良い。

上記した顕微鏡装置を用いた焦点制御方法の具体的な一実施例について説明する。ここで、以下においては、焦点制御用撮像手段を構成する２つのＣＣＤカメラ３３、３４について、前段のＣＣＤカメラ３３をカメラ１、後段のＣＣＤカメラ３４をカメラ２とする。

本実施例では、試料Ｓとして口腔肉腫瘤の病理サンプルを用いる。この病理サンプルを顕微鏡（ＮＩＫＯＮＴＭＤ，２０×，ＮＡ０．７５）にセットし、ＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ，浜松ホトニクス製）を配置する。本実施例では、傾き方向が逆方向の２つの画像を用いることによる効果の確認を目的とするため、単一のＣＣＤカメラを用い、その配置角度をθ＝±２５°で変えて２度の焦点計測を行う。このとき、ＣＣＤの撮像面の傾き方向の両端は、光軸方向に約３．７ｍｍの深さを持つ。これは、試料Ｓ上での光軸方向の変化は撮像面上では倍率の自乗となることから、サンプル上での深さに換算すると約９μｍとなる。

また、２つのＣＣＤカメラのそれぞれで取得される焦点制御用の画像において、計測対象画像Ｘ_１’，Ｘ_２’のサイズをａ×ｂ’＝１０２４画素×１９０画素とし、焦点位置の正しい焦点位置からのずれが−４μｍ、−２μｍ、０μｍ、２μｍ、４μｍの５点について焦点計測を行った。

図８〜図１２は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。ここで、図８の画像（ａ）、（ｂ）は、焦点位置のずれが−４μｍの場合について取得された（ａ）カメラ１の計測対象画像Ｘ_１’、及び（ｂ）カメラ２の計測対象画像Ｘ_２’を示している。また、図９の画像（ａ）、（ｂ）は、焦点位置のずれが−２μｍの場合について取得された（ａ）カメラ１の計測対象画像Ｘ_１’、及び（ｂ）カメラ２の計測対象画像Ｘ_２’を示している。

また、図１０の画像（ａ）、（ｂ）は、焦点位置のずれが０μｍの場合について取得された（ａ）カメラ１の計測対象画像Ｘ_１’、及び（ｂ）カメラ２の計測対象画像Ｘ_２’を示している。また、図１１の画像（ａ）、（ｂ）は、焦点位置のずれが２μｍの場合について取得された（ａ）カメラ１の計測対象画像Ｘ_１’、及び（ｂ）カメラ２の計測対象画像Ｘ_２’を示している。また、図１２の画像（ａ）、（ｂ）は、焦点位置のずれが４μｍの場合について取得された（ａ）カメラ１の計測対象画像Ｘ_１’、及び（ｂ）カメラ２の計測対象画像Ｘ_２’を示している。

このような２種類の計測対象画像Ｘ_１’，Ｘ_２’に対し、４画素のシフトでシフト画像Ｘ_１”，Ｘ_２”を作成し、画像Ｘ’、Ｘ”から差分絶対値画像Ｙ_１，Ｙ_２、及びデータ列Ｚ_１，Ｚ_２を求める。そして、データ列Ｚ_１，Ｚ_２でのアドレスとデータとの積の総和Ｔ_１，Ｔ_２である焦点重心のデータＦ１，Ｆ２を求める。また、この焦点重心のデータＦ１，Ｆ２の差分Ｆ＝Ｆ１−Ｆ２（総和Ｔ_１，Ｔ_２の差分Ｔ＝Ｔ_１−Ｔ_２）を求めて、焦点制御に用いる。

図１３は、図８〜図１２の画像（ａ）に示したカメラ１の計測対象画像Ｘ_１でのコントラスト変化を示す図である。図１３のグラフ（ａ）〜（ｅ）において、横軸は傾き方向の画素位置を示し、縦軸は各位置でのコントラストに対応するデータ列Ｚ_１を示している。また、図１３のグラフ（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ図８の画像（ａ）、図９の画像（ａ）、図１０の画像（ａ）、図１１の画像（ａ）、図１２の画像（ａ）に対応している。

これらのデータ列Ｚ_１から、各焦点位置に対する焦点重心Ｆ１（総和Ｔ_１）は、（ａ）焦点位置−４μｍに対してＦ１＝５．４、（ｂ）焦点位置−２μｍに対してＦ１＝４９．０、（ｃ）焦点位置０μｍに対してＦ１＝７５．２、（ｄ）焦点位置２μｍに対してＦ１＝９４．１、（ｅ）焦点位置４μｍに対してＦ１＝１２０．８とそれぞれ求められる。この結果では、焦点位置のずれに対してデータ列Ｚ_１から求められる焦点重心Ｆ１の値の変化において、Ｆ１のすべてが正の値であって負の値から正の値へと移行する点が存在しない。このような焦点重心Ｆ１の値の変化は、試料Ｓ自体のコントラストパターンの変化に起因するものである。

一方、図１４は、図８〜図１２の画像（ｂ）に示したカメラ２の計測対象画像Ｘ_２でのコントラスト変化を示す図である。図１４のグラフ（ａ）〜（ｅ）において、横軸は傾き方向の画素位置を示し、縦軸は各位置でのコントラストに対応するデータ列Ｚ_２を示している。また、図１４のグラフ（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ図８の画像（ｂ）、図９の画像（ｂ）、図１０の画像（ｂ）、図１１の画像（ｂ）、図１２の画像（ｂ）に対応している。

これらのデータ列Ｚ_２から、各焦点位置に対する焦点重心Ｆ２（総和Ｔ_２）は、（ａ）焦点位置−４μｍに対してＦ２＝８９．２、（ｂ）焦点位置−２μｍに対してＦ２＝５５．８、（ｃ）焦点位置０μｍに対してＦ２＝１２．０、（ｄ）焦点位置２μｍに対してＦ２＝−１３．４、（ｅ）焦点位置４μｍに対してＦ２＝−６１．６とそれぞれ求められる。

また、これらの焦点重心Ｆ１、Ｆ２から焦点重心の差分Ｆ（総和の差分Ｔ）は、（ａ）焦点位置−４μｍに対してＦ＝−８３．８、（ｂ）焦点位置−２μｍに対してＦ＝−６．８、（ｃ）焦点位置０μｍに対してＦ＝６３．２、（ｄ）焦点位置２μｍに対してＦ＝１０７．５、（ｅ）焦点位置４μｍに対してＦ＝１８２．４とそれぞれ求められる。この結果より、上記のように光軸に対して逆方向に傾いた２つのカメラによって取得される画像を解析して得られる解析結果では、試料Ｓ自体が有するコントラストパターンにかかわらず、焦点位置のずれと、データ列Ｚ_１，Ｚ_２から求められる焦点重心の差分Ｆの値の変化とが、良く対応していることがわかる。したがって、このような解析結果を参照することで、撮像の焦点制御情報を好適に取得することができる。

本発明による顕微鏡装置について、さらに説明する。

図１５は、本発明による顕微鏡装置の第２実施形態の構成を示すブロック図である。本実施形態において、照射光源１０、集光レンズ１１、試料ステージ１５、ＸＹステージ駆動部１６、導光光学系２０、ピエゾアクチュエータ２２、及びピエゾ駆動部２３については、図１に示した実施形態と同様である。

画像取得用光路上には、ビームスプリッタ２７ａ、２７ｂを通過した試料Ｓの光像の結像面に対応する位置に、光検出器４１が設置されている。光検出器４１は、ビームスプリッタ２７ａ、２７ｂで画像取得用光路へと分岐された光像による画像の取得に用いられる画像取得用撮像手段である。この光検出器４１としては、具体的には、試料Ｓの１次元の画像を取得可能なリニアセンサ、または２次元の画像を取得可能なイメージセンサが用いられる。

一方、前段の焦点制御用光路上には、ビームスプリッタ２７ａで反射された試料Ｓの光像の結像面に対応する位置に、撮像装置４３が設置されている。また、後段の焦点制御用光路上には、ビームスプリッタ２７ｂで反射された試料Ｓの光像の結像面に対応する位置に、撮像装置４４が設置されている。撮像装置４３、４４は、それぞれ２次元の画像を取得可能なＣＣＤカメラからなる。

ＣＣＤカメラ４３、４４は、ビームスプリッタ２７ａ、２７ｂで分岐された光像による画像を取得する第１、第２撮像手段であり、これらのカメラ４３、４４によって、本実施形態における焦点制御用撮像手段が構成されている。すなわち、図１５に示した顕微鏡装置では、これらのＣＣＤカメラ４３、４４によって取得される試料Ｓの２次元の画像を用いて、試料Ｓを光検出器４１によって撮像する際の焦点制御情報の取得、及び得られた焦点制御情報に基づく焦点制御が行われる。

具体的には、焦点制御用撮像手段の第１撮像手段であるＣＣＤカメラ４３は、その撮像面が光路に直交するｘｚ面と略一致するように配置されている。また、ビームスプリッタ２７ａとカメラ４３との間で撮像面に対して所定位置に、光路長変更部材４３ａが設置されている。光路長変更部材４３ａは、試料Ｓからの光を透過する光透過材料により、ｚ軸方向に沿って厚さが変化していくウエッジ形状に形成されている。このとき、ＣＣＤカメラ４３の撮像面内において、ｚ軸方向を変化方向として、試料Ｓからカメラ４３へと光が導かれる導光光学系２０での光路長がｚ軸方向に沿って変化するようになっている。

また、焦点制御用撮像手段の第２撮像手段であるＣＣＤカメラ４４は、その撮像面が光路に直交するｘｚ面と略一致するように配置されている。また、ビームスプリッタ２７ｂとカメラ４４との間で撮像面に対して所定位置に、光路長変更部材４４ａが設置されている。光路長変更部材４４ａは、試料Ｓからの光を透過する光透過材料により、ｚ軸方向に沿うとともに光路長変更部材４３ａとは逆方向に厚さが変化していくウエッジ形状に形成されている。このとき、ＣＣＤカメラ４４の撮像面内において、ｚ軸方向を変化方向として、試料Ｓからカメラ４４へと光が導かれる導光光学系２０での光路長がｚ軸方向に沿うとともにカメラ４３とは逆方向に変化するようになっている。

これらの試料ステージ１５、導光光学系２０、光検出器４１、及びＣＣＤカメラ４３、４４に対し、画像取得制御部４６、及び焦点制御部４７が設けられている。画像取得制御部４６は、試料Ｓの画像の取得、及び試料Ｓに対する撮像位置の設定を制御することによって、試料Ｓの画像取得動作を制御する制御手段である。具体的には、画像取得制御部４６は、光検出器４１による画像の取得を制御する。また、制御部４６は、ＸＹステージ駆動部１６を介して試料ステージ１５を駆動制御することにより、試料ステージ１５上に載置された試料Ｓで顕微鏡光学系の光軸上にある撮像位置を設定または変更する。

焦点制御部４７は、ＣＣＤカメラ４３、４４によって取得された画像について所定の解析方法で解析を行う。そして、その解析結果に基づいて、光検出器４１によって試料Ｓを撮像する際の焦点制御情報を取得する。あるいはさらに、焦点制御部４７は、取得された焦点制御情報に基づいて、光検出器４１による撮像の焦点を制御する。本実施形態においては、焦点制御部４７は、ピエゾ駆動部２３を介してピエゾアクチュエータ２２を駆動制御して対物レンズ２１のｚ軸方向の位置を調整することにより、撮像の焦点制御を行う。

ここで、焦点制御用撮像手段であるカメラ４３、４４では、上記したようにそれぞれ焦点制御用光路の光軸に対して前方側にウエッジ形状の光路長変更部材４３ａ、４４ａが配置されている。このため、ＣＣＤカメラ４３、４４によって取得される２次元の画像は、ＣＣＤカメラ３３、３４を傾けて配置する図１に示した構成と同様に、それぞれｚ軸方向に沿って焦点位置からのずれが変化する画像となる。このような所定の変化方向に沿って焦点位置からのずれが変化する画像を、焦点制御部４７において解析することにより、撮像の焦点のずれ、焦点調整の必要性の有無、焦点を合わせるために必要な補正量などについての焦点制御情報が得られる。さらに、カメラ４３、４４によって取得される画像は、焦点位置からのずれが変化する方向が互いに逆方向となる。このような２種類の画像を用いることにより、焦点制御情報を精度良く求めることが可能となる。

本実施形態による顕微鏡装置の効果について説明する。

図１５に示した顕微鏡装置においては、画像取得の対象となる試料Ｓに対して、焦点制御に用いられる撮像手段として、２次元の画像を取得可能なＣＣＤカメラ４３、４４を用いるとともに、光像が試料Ｓから導光される光路長が所定方向で変化する撮像条件となるようにそれぞれのカメラ４３、４４を配置している。このようなカメラ４３、４４を用いて取得された２次元の画像を解析して焦点制御を行う構成によれば、試料への焦点計測用のレーザ光の照射等が不要となる。したがって、焦点計測部分を含めた顕微鏡装置の全体として、その装置構成や撮像動作を簡単化することができる。

また、上記した装置では、所定の変化方向に沿って互いに逆方向に光路長が変化するように構成された第１撮像手段であるＣＣＤカメラ４３、及び第２撮像手段であるＣＣＤカメラ４４によって焦点制御用撮像手段を構成している。このような撮像手段によって取得された２種類の画像を用いて焦点計測を行うことにより、試料Ｓの画像を画像取得用撮像手段である光検出器４１によって取得する際の焦点制御情報を精度良く求めることが可能となる。また、このようにして求められた焦点制御情報を用いれば、試料Ｓの画像を取得する際に焦点制御を好適に行うことが可能となる。

具体的には、上記構成では、ｚ軸方向を変化方向として互いに逆方向に光路長が変化するように光路長変更部材４３ａ、４４ａが設置された２つのＣＣＤカメラ４３、４４を、焦点制御情報の取得に用いている。このように、逆方向に光路長が変化する２つの撮像装置を用いて焦点計測を行うことにより、試料Ｓ自体のコントラストパターンが不均一な場合においても、その影響を低減して好適に焦点制御を行うことができる。

また、焦点制御に用いられる撮像装置を光軸に対して傾いた状態で設置する図１の構成に対し、本構成では、撮像装置と光路長変更部材とを組み合わせて用いることによって焦点計測を行っている。このような構成によっても、撮像の焦点制御を好適に実現することが可能である。一般には、焦点制御用撮像手段を構成する第１、第２撮像手段は、それぞれの光路上に、その撮像面内において所定の変化方向に沿って導光光学系での光路長が変化するように構成、配置されていれば良い。

特に、光路長変更部材を用いる構成では、撮像装置を傾けて配置する必要がなく顕微鏡へのマウントが簡単になるという利点がある。また、ＣＣＤカメラの撮像面に対して斜めに光が入射したときに、画素の不均一性に起因する固定パターンノイズが顕著となる場合があるが、光軸に対して垂直に撮像装置を配置する上記構成では、そのようなノイズの問題は発生しない。

また、試料Ｓ上での光軸方向の変化は撮像面上では倍率の自乗となるため、撮像装置を傾ける構成では制御可能な焦点位置の範囲に限界がある。これに対して、光路長変更部材を用いる構成では、制御しようとする焦点位置の範囲に合わせて光路長変更部材の形状を選択することが可能である。なお、このように光路長変更部材を用いた場合の光路長（光学距離）の差Δｘは、変更部材のガラスなどの厚みｄ、及び屈折率ｎからΔｘ＝ｄ（ｎ−１）／ｎと求められる。

また、本実施形態においては、焦点制御用撮像手段を構成するＣＣＤカメラ４３、４４について、上記したように所定の変化方向に沿って互いに逆方向に光路長が変化するように構成している。これにより、取得される焦点制御情報の精度を向上することができる。この焦点制御用撮像手段の第１撮像手段及び第２撮像手段については、一般には、所定の変化方向に沿って互いに異なる変化率で光路長が変化するように構成すれば良い。そのような構成としては、例えば、同方向であるが互いに異なる変化量で光路長が変化する構成がある。

焦点制御用の撮像装置の前方側に設置される光路長変更部材については、図１６の構成例（ａ）〜（ｆ）に示すように、具体的には様々な形状のものを用いて良い。これらの図１６に示す光路長変更部材のうち、図１６の構成例（ａ）は、図１５に関して上述した光路長の変化方向に沿って厚さが連続的に変化するウエッジ形状のものである。また、図１６の構成例（ｂ）は、厚さが階段状に変化するステップウエッジ形状のものである。また、図１６の構成例（ｃ）では、焦点距離が異なる複数のマイクロレンズを変化方向に沿って配列したレンズアレイを、光路長変更部材としている。

また、図１６の構成例（ｄ）〜（ｆ）では、厚さが変化する変化量や変化していく方向（厚さの変化率）が異なる複数のウエッジ形状の光路長変更部材を組み合わせて用いる構成を示している。このように複数種類の部材を用いることにより、様々な条件での焦点計測が可能となる。例えば、図１６の構成例（ｅ）に示すように、厚さの変化率に相当するウエッジの勾配が小さいウエッジ部材と大きいウエッジ部材とを組み合わせて使用する構成では、ウエッジの勾配に応じて焦点計測の計測範囲及び分解能を選択して、精度良く焦点制御を行うことができる。

この場合、例えば、次のような焦点制御方法が可能である。最初に勾配が大きいウエッジ部材を用いて焦点位置を計測して、低精度で焦点位置を調整する。次に、勾配が小さいウエッジ部材を用いて高精度で焦点位置を調整する。このような制御方法では、画像取得の開始時などにおいて、焦点位置の設定を高速かつ簡単に行うことができる。

あるいは、画像取得中に勾配が小さいウエッジ部材を用いて焦点位置の調整を行う。そして、焦点位置が計測されない場合に、勾配が大きいウエッジ部材を用いて焦点位置を計測して、低精度で焦点位置を調整する。さらに、再び勾配が小さいウエッジ部材を用いて高精度で焦点位置を調整する。このような制御方法では、画像取得の対象となる試料が厚さの変化の大きい試料である場合にも好適に焦点制御を実現することができる。

また、顕微鏡が複数の倍率に設定可能な構成である場合には、複数の倍率のそれぞれに対応した勾配のウエッジ部材を設けておくことが好ましい。これにより、顕微鏡の倍率を変更する場合にも焦点計測部分の光学的、機構的な変更が不要な構成の顕微鏡装置とすることができる。

なお、光路長変更部材を用いる構成では、変更部材は、撮像装置に密着させて直接取り付けるか、または多少の距離をあけて配置しても良い。また、光路長変更手段としては、光を透過する光路長変更部材以外の光学素子を用いても良い。また、図１５に示した顕微鏡装置においても、その具体的な焦点制御方法については、図１に示した顕微鏡装置に関して上述したものと同様である。

また、撮像装置の前方側に光路長変更部材を配置することによって光路長を変化させる構成では、２つの撮像装置を用いる図１５の構成に限らず、例えば図１６の構成例（ｄ）に示したように、厚さの変化方向が逆方向となる２種類の光路長変更部材を１つの撮像装置に対して設ける構成を用いることが可能である。この場合、焦点制御用撮像手段を単一の撮像装置を用いて構成して、顕微鏡装置の構成を簡単化することができる。

すなわち、焦点制御用撮像手段を構成する第１撮像手段を、撮像装置の撮像面の第１撮像領域に対して所定位置に、所定の変化方向に沿って光路長が変化するように設置された第１光路長変更手段を用いて構成する。また、焦点制御用撮像手段を構成する第２撮像手段を、撮像装置の撮像面の第２撮像領域に対して所定位置に、上記変化方向に沿うとともに第１光路長変更手段とは異なる変化率、好ましくは逆方向に光路長が変化するように設置された第２光路長変更手段を用いて構成する。このように顕微鏡装置を構成することにより、図１５に示した構成と同様の焦点制御を実行することができる。

また、上記した各実施形態では、導光光学系２０に光分岐手段であるビームスプリッタを配置し、ビームスプリッタによって分岐された画像取得用光路、焦点制御用光路に対してそれぞれ画像取得用撮像手段、焦点制御用撮像手段を設置している。これに対して、導光光学系２０に光分岐手段を配置せず、同一の光路を画像取得用光路及び焦点制御用光路として用いる構成とすることも可能である。

この場合、同一の撮像装置を画像取得用撮像手段及び焦点制御用撮像手段として用いる構成とすることができる。一般には、画像取得用撮像手段を、焦点制御用撮像手段に含まれる一の撮像装置によって構成すれば良い。

図１７は、本発明による顕微鏡装置の第３実施形態の構成を示すブロック図である。本実施形態において、照射光源１０、集光レンズ１１、試料ステージ１５、及びＸＹステージ駆動部１６については、図１に示した構成と同様である。

試料Ｓに対し、試料ステージ１５の上方に導光光学系２０が設けられている。本実施形態においては、導光光学系２０は、対物レンズ２１と、対物レンズ２１の後段に配置された結像レンズ２８とを有している。図１７においては、対物レンズ２１からの光が結像レンズ２８を通過して結像される光路が、試料Ｓの画像取得に用いられる画像取得用光路、及び試料Ｓを撮像する際の焦点制御に用いられる焦点制御用光路に共用されている。

対物レンズ２１に対して、対物レンズ２１をｚ軸方向に駆動するピエゾアクチュエータ２２が設けられている。また、ピエゾアクチュエータ２２は、ピエゾ駆動部２３によって駆動制御されている。本顕微鏡装置では、このピエゾアクチュエータ２２を用いて対物レンズ２１のｚ軸方向の位置を変えることにより、試料Ｓの画像取得における撮像の焦点が調整可能になっている。

画像取得用光路及び焦点制御用光路として共用される光路上には、結像レンズ２８を通過した試料Ｓの光像の結像面に対応する位置に、撮像装置５１が設置されている。撮像装置５１は、２次元の画像を取得可能なＣＣＤカメラからなる。本実施形態においては、このカメラ５１により、試料Ｓの画像の取得に用いられる画像取得用撮像手段、及び焦点制御に用いられる焦点制御用撮像手段が構成されている。すなわち、図１７に示した顕微鏡装置では、このカメラ５１によって取得される試料Ｓの２次元の画像を用いて、試料Ｓを撮像する際の焦点制御情報の取得、及び得られた焦点制御情報に基づく焦点制御が行われる。

具体的には、ＣＣＤカメラ５１は、撮像面が光路に直交するｘｙ面と略一致するように配置されている。また、その撮像面には、ｘ軸方向について第１撮像領域及び第２撮像領域の２つの撮像領域が設定されている。そして、その第１撮像領域に対して所定位置に、ｙ軸方向に沿って厚さが変化していくウエッジ形状の第１光路長変更部材５１ａが設置されることにより、焦点制御用撮像手段の第１撮像手段が構成されている。このとき、カメラ５１の撮像面の第１撮像領域内において、ｙ軸方向を変化方向として、試料Ｓからカメラ５１へと光が導かれる導光光学系２０での光路長がｙ軸方向に沿って変化するようになっている。

また、カメラ５１の第２撮像領域に対して所定位置に、ｙ軸方向に沿うとともに第１光路長変更部材５１ａとは逆方向に厚さが変化していくウエッジ形状の第２光路長変更部材５１ｂが設置されることにより、焦点制御用撮像手段の第２撮像手段が構成されている。このとき、カメラ５１の撮像面の第２撮像領域内において、ｙ軸方向を変化方向として、試料Ｓからカメラ５１へと光が導かれる導光光学系２０での光路長がｙ軸方向に沿うとともに第１撮像領域とは逆方向に変化するようになっている。

また、ＣＣＤカメラ５１の前方側に設置された上記した光路長変更部材５１ａ、５１ｂに対し、駆動モータ５２が設けられている。この駆動モータ５２は、光路長変更部材５１ａ、５１ｂを、カメラ５１の撮像面に対して光路上にある位置、及び光路から外れた位置の間で駆動する駆動手段である。駆動モータ５２により光路長変更部材５１ａ、５１ｂを光路上に配置した状態では、カメラ５１は焦点制御用撮像手段として機能する。一方、駆動モータ５２により光路長変更部材５１ａ、５１ｂを光路外に配置した状態では、カメラ５１は画像取得用撮像手段として機能する。なお、図１７においては、光路長変更部材５１ａ、５１ｂが光路上に配置された状態を示している。

これらの試料ステージ１５、導光光学系２０、ＣＣＤカメラ５１、及び駆動モータ５２に対し、画像取得制御部５６、及び焦点制御部５７が設けられている。画像取得制御部５６は、試料Ｓの画像の取得、試料Ｓに対する撮像位置の設定を制御する。また、本実施形態においては、画像取得制御部５６は、駆動モータ５２による光路長変更部材５１ａ、５１ｂの駆動を制御する。これにより、光路長変更部材５１ａ、５１ｂが光路上に配置された焦点計測モード、及び光路外に配置された画像取得モードが切り換えられる。

焦点制御部５７は、変更部材５１ａ、５１ｂが光路上に配置された状態でＣＣＤカメラ５１によって取得された画像について所定の解析方法で解析を行う。そして、その解析結果に基づいて、変更部材５１ａ、５１ｂが光路外に配置された状態でカメラ５１によって試料Ｓを撮像する際の焦点制御情報を取得する。あるいはさらに、焦点制御部５７は、取得された焦点制御情報に基づいて、カメラ５１による撮像の焦点を制御する。

ここで、カメラ５１の第１、第２撮像領域では、上記したようにそれぞれウエッジ形状の光路長変更部材５１ａ、５１ｂが配置されている。このため、カメラ５１の第１、第２撮像領域でそれぞれ取得される２次元の画像は、図１及び図１５に示した構成と同様に、ｙ軸方向に沿って焦点位置からのずれが変化する画像となる。このような所定の変化方向に沿って焦点位置からのずれが変化する画像を、焦点制御部５７において解析することにより、撮像の焦点のずれ、焦点調整の必要性の有無、焦点を合わせるために必要な補正量などについての焦点制御情報が得られる。さらに、カメラ５１の第１、第２撮像領域で取得される画像は、焦点位置からのずれが変化する方向が互いに逆方向となる。このような２種類の画像を用いることにより、焦点制御情報を精度良く求めることが可能となる。

本実施形態による顕微鏡装置の効果について説明する。

図１７に示した顕微鏡装置においては、画像取得の対象となる試料Ｓに対して、焦点制御に用いられる撮像手段として、２次元の画像を取得可能なカメラ５１の第１、第２撮像領域を用いるとともに、光像が試料Ｓから導光される光路長が所定方向で変化する撮像条件となるようにそれぞれの撮像領域に対して光路長変更部材５１ａ、５１ｂを設置している。このようなカメラ５１を用いて取得された２次元の画像を解析して焦点制御を行う構成によれば、試料への焦点計測用のレーザ光の照射等が不要となる。したがって、焦点計測部分を含めた顕微鏡装置の全体として、その装置構成や撮像動作を簡単化することができる。

また、上記した装置では、第１、第２撮像領域の２つの撮像領域が設定されたＣＣＤカメラ５１によって焦点制御用撮像手段を構成している。このような撮像領域で取得された２種類の画像を用いて焦点計測を行うことにより、試料Ｓの画像を取得する際の焦点制御情報を精度良く求めることが可能となる。また、このようにして求められた焦点制御情報を用いれば、試料Ｓの画像を取得する際に焦点制御を好適に行うことが可能となる。

また、上記構成では、単一のＣＣＤカメラ５１を、画像取得用撮像手段及び焦点制御用撮像手段として共用している。このような構成によれば、別個に撮像装置を設ける構成と比べて、顕微鏡装置の構成を簡単化することができる。

図１７に示した顕微鏡装置における焦点制御方法について説明する。図１８は、焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。なお、以下に説明する焦点制御、光路長変更部材の駆動、及び試料の画像取得は、図１７に示した構成において画像取得制御部５６及び焦点制御部５７によって行われる。また、焦点制御における画像の具体的な解析方法については、図３〜図５に示した焦点制御方法と同様である。

まず、ＣＣＤカメラ５１に対して駆動モータ５２によって光路長変更部材５１ａ、５１ｂを駆動し、変更部材５１ａ、５１ｂを光路上の位置に挿入して、焦点制御情報取得のための焦点計測モードの状態とする。また、ＸＹステージ駆動部１６によって試料ステージ１５を駆動し、照射光源１０及び対物レンズ２１による顕微鏡光学系の光軸上となる計測位置が最初の計測位置となるように試料Ｓを移動する（ステップＳ６０１）。

次に、設定された計測位置について、カメラ５１によって取得された画像を解析して焦点位置を計測し、取得された焦点制御情報を記憶する（Ｓ６０２）。制御情報取得を終了したら、光軸上の計測位置が次の計測位置となるように試料Ｓを移動する（Ｓ６０３）。そして、すべての計測位置について焦点計測を完了したかどうかを判断し（Ｓ６０４）、完了していなければ、焦点計測のステップＳ６０２、Ｓ６０３を繰り返す。一方、焦点計測を完了していれば、焦点計測作業を終了する。

続いて、駆動モータ５２によって光路長変更部材５１ａ、５１ｂを駆動し、変更部材５１ａ、５１ｂを光路上の位置から外して、試料Ｓの画像取得のための画像取得モードの状態とする。また、ＸＹステージ駆動部１６によって試料ステージ１５を駆動して、光軸上の計測位置が最初の撮像位置となるように試料Ｓを移動する（Ｓ６０５）。

次に、設定された撮像位置について、先に取得されている焦点制御情報を参照して焦点制御を行うとともに、カメラ５１によって試料Ｓの画像を取得、記憶する（Ｓ６０６）。画像取得を終了したら、光軸上の撮像位置が次の撮像位置となるように試料Ｓを移動する（Ｓ６０７）。そして、すべての撮像位置について試料Ｓの画像取得を完了したかどうかを判断し（Ｓ６０８）、完了していなければ、画像取得のステップＳ６０６、Ｓ６０７を繰り返す。一方、画像取得を完了していれば、画像取得作業を終了する。

以上のような焦点制御方法により、図１７に示した構成の顕微鏡装置において、試料Ｓの画像取得と、撮像の焦点制御とを好適に実行することができる。なお、上記した方法において、画像取得時に設定される試料Ｓの撮像位置は、焦点制御情報の適用のため、焦点計測時の計測位置と同一の位置とすることが好ましい。また、上記した方法では、試料Ｓの全体で焦点計測を完了した後に画像取得を行っているが、試料Ｓを複数の領域に分け、領域毎に焦点計測、及び画像取得を交互に行っても良い。あるいは、試料Ｓ上において適宜選択された複数の撮像領域に対して焦点計測を行うとともに、得られた複数の焦点制御情報を利用し、焦点計測を未実行の撮像領域について焦点制御情報を補間処理することによって、撮像領域全体についての焦点制御情報のマップを作成しても良い。

図１９は、本発明による顕微鏡装置の第４実施形態の構成を示すブロック図である。本実施形態において、照射光源１０、集光レンズ１１、試料ステージ１５、ＸＹステージ駆動部１６、ピエゾアクチュエータ２２、ピエゾ駆動部２３、ＣＣＤカメラ５１、光路長変更部材５１ａ、５１ｂ、駆動モータ５２、画像取得制御部５６、及び焦点制御部５７については、図１７に示した構成と同様である。

試料Ｓに対し、試料ステージ１５の上方に導光光学系２０が設けられている。本実施形態においては、導光光学系は、対物レンズ２１と、対物レンズ２１の後段に配置された結像レンズ２９ａ、２９ｂとを有している。また、これらの結像レンズ２９ａ、２９ｂは、光軸に垂直な方向に連結されるとともに、駆動モータ２９ｃによって光路上にあるレンズを切り換え可能に構成されている。また、駆動モータ２９ｃによるレンズ２９ａ、２９ｂの駆動は、画像取得制御部５６によって制御されている。

ここで、試料Ｓ上での光軸方向の変化は撮像面上では倍率の自乗となるため、画像取得に必要な結像レンズが高い倍率の場合、焦点計測に必要な光路長変更部材でのウエッジが厚くなり、製造上の問題または変更部材での全反射の問題などを生じる場合がある。これに対して、上記構成のように倍率の異なる結像レンズ２９ａ、２９ｂを切り換え可能な構成とし、焦点計測時には低い倍率のレンズを用いることにより、画像取得時の倍率に影響されることなく好適に焦点計測を行うことができる。

図２０は、本発明による顕微鏡装置の第５実施形態の構成を示すブロック図である。本実施形態において、照射光源１０、集光レンズ１１、試料ステージ１５、ＸＹステージ駆動部１６、導光光学系２０、ピエゾアクチュエータ２２、ピエゾ駆動部２３、ＣＣＤカメラ５１、画像取得制御部５６、及び焦点制御部５７については、図１７に示した構成と同様である。

本実施形態においては、ＣＣＤカメラ５１は、その撮像面において、ｘ軸方向について画像取得に用いられる画像取得領域、及び焦点計測に用いられる焦点計測領域の２つの撮像領域が設定されている。また、上記した２つの撮像領域のうちの焦点計測領域には、さらに、ｘ軸方向について第１撮像領域及び第２撮像領域の２つの撮像領域が設定されている。また、焦点計測領域の第１、第２撮像領域に対し、図１７に示した光路長変更部材５１ａ、５１ｂと同様の光路長変更部材５３ａ、５３ｂが設置されている。

このような構成において、ＣＣＤカメラ５１の画像取得領域は、画像取得用撮像手段として機能する。また、光路長変更部材５３ａ、５３ｂが設けられた焦点計測領域は、焦点制御用撮像手段として機能する。このような構成では、光路長変更部材５３ａ、５３ｂを駆動するための駆動モータは不要である。また、カメラ５１の画像取得領域及び焦点計測領域を利用することにより、試料Ｓの画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことも可能である。

図２１は、ＣＣＤカメラ及び光路長変更部材の構成の例を示す図である。図２１の構成例（ａ）に示す構成では、カメラ５１の画像取得領域５１１及び焦点計測領域５１２のうち、焦点計測領域５１２に対して、ウエッジ形状の上記した光路長変更部材５３ａ、５３ｂが設置されている。

また、図２１の構成例（ｂ）に示す構成では、カメラ５１の画像取得領域５１１及び焦点計測領域５１２のうち、焦点計測領域５１２に対して、ウエッジ形状の上記した光路長変更部材５３ａ、５３ｂが設置されている。また、画像取得領域５１１に対して、光路長調整用の板状のガラス部材５３ｃが設置されている。図２１の構成例（ａ）では、光路長変更部材５３ａ、５３ｂの中心位置での厚さによる光路長（光学距離）の増加分について、画像取得において光路長を補正する必要がある。これに対して、構成例（ｂ）では、光路長調整部材５３ｃを設けていることにより、このような補正が不要となる。

図２０に示した顕微鏡装置における焦点制御方法について説明する。図２２は、焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。ここでは、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを別個に行う場合の制御方法を示している。

まず、ＸＹステージ駆動部１６によって試料ステージ１５を駆動し、照射光源１０及び対物レンズ２１による顕微鏡光学系の光軸上となる計測位置が最初の計測位置となるように試料Ｓを移動する（ステップＳ７０１）。

次に、設定された計測位置について、光路長変更部材５３ａ、５３ｂが設置されたカメラ５１の焦点計測領域を用いて取得された画像を解析して焦点位置を計測し、取得された焦点制御情報を記憶する（Ｓ７０２）。制御情報取得を終了したら、光軸上の計測位置が次の計測位置となるように試料Ｓを移動する（Ｓ７０３）。そして、すべての計測位置について焦点計測を完了したかどうかを判断し（Ｓ７０４）、完了していなければ、焦点計測のステップＳ７０２、Ｓ７０３を繰り返す。一方、焦点計測を完了していれば、焦点計測作業を終了する。

続いて、ＸＹステージ駆動部１６によって試料ステージ１５を駆動して、光軸上の計測位置が最初の撮像位置となるように試料Ｓを移動する（Ｓ７０５）。

次に、設定された撮像位置について、先に取得されている焦点制御情報を参照して焦点制御を行うとともに、カメラ５１の画像取得領域を用いて試料Ｓの画像を取得、記憶する（Ｓ７０６）。画像取得を終了したら、光軸上の撮像位置が次の撮像位置となるように試料Ｓを移動する（Ｓ７０７）。そして、すべての撮像位置について試料Ｓの画像取得を完了したかどうかを判断し（Ｓ７０８）、完了していなければ、画像取得のステップＳ７０６、Ｓ７０７を繰り返す。一方、画像取得を完了していれば、画像取得作業を終了する。

図２３は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。ここでは、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行う場合の制御方法を示している。

まず、ＸＹステージ駆動部１６によって試料ステージ１５を駆動し、照射光源１０及び対物レンズ２１による顕微鏡光学系の光軸上となる撮像位置が最初の撮像位置となるように試料Ｓを移動する（ステップＳ８０１）。この例では、画像取得及び焦点制御を同時に行うため、この撮像位置が焦点計測の計測位置となる。

次に設定された撮像位置について、光路長変更部材５３ａ、５３ｂが設置されたカメラ５１の焦点計測領域を用いて取得された画像を解析して焦点位置を計測し、焦点制御情報を取得する（Ｓ８０２）。さらに、取得された焦点制御情報を参照して焦点制御を行うとともに、カメラ５１の画像取得領域を用いて試料Ｓの画像を取得する（Ｓ８０３）。画像取得を終了したら、光軸上の撮像位置が次の撮像位置となるように試料Ｓを移動する（Ｓ８０４）。そして、すべての撮像位置について試料Ｓの画像取得を完了したかどうかを判断し（Ｓ８０５）、完了していなければ、画像取得のステップＳ８０２〜Ｓ８０４を繰り返す。一方、画像取得を完了していれば、画像取得作業を終了する。

以上のような焦点制御方法により、図２０に示した構成の顕微鏡装置において、試料Ｓの画像取得と、撮像の焦点制御とを好適に実行することができる。また、このような構成では、上記したように画像取得及び焦点制御を別個に、または同時に実行することが可能である。

本発明による顕微鏡装置は、上記した実施形態及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、上記した各実施形態では、顕微鏡装置を透過型の顕微鏡として構成しているが、反射型の顕微鏡、または蛍光顕微鏡に対しても同様に焦点制御を行うことが可能である。

図２４は、本発明による顕微鏡装置の第６実施形態の構成を示すブロック図である。本顕微鏡装置は、図１に示した顕微鏡装置の変形例である。具体的には、試料ステージ１５の下方に照射光源１０及び集光レンズ１１を設置した図１に示した透過型の構成に対し、図２４に示す顕微鏡装置は、照射光源１０及び集光レンズ１１に代えて照射光源８０、レンズ８１、及び照射光学系８５を設置した蛍光顕微鏡の構成となっている。

すなわち、図２４においては、導光光学系２０において、前段のビームスプリッタ２７ａと、対物レンズ２１との間に、ダイクロイックミラー８６が配置されている。ダイクロイックミラー８６は、照射光源８０からレンズ８１を介して入射される光を反射して励起光として試料Ｓへと照射するとともに、試料Ｓで発生した蛍光をビームスプリッタ２７ａへと通過させる。また、ダイクロイックミラー８６と照射光源８０との間、ダイクロイックミラー８６と対物レンズ２１との間には、それぞれ励起フィルタ８７、カットフィルタ８８が配置され、これらのダイクロイックミラー８６、励起フィルタ８７、及びカットフィルタ８８によって照射光学系８５（Fluorescence filter cube）が構成されている。

このような構成の蛍光顕微鏡においても、上記した透過型の顕微鏡の場合と同様に焦点制御を行うことができる。また、顕微鏡を反射型の構成とする場合には、図２４の構成において、ダイクロイックミラー８６をハーフミラーに置き換え、フィルタ８７、８８を取り除けば良い。

なお、撮像装置の前方側に光路長変更部材を配置することによって光路長を変化させる構成では、上記したように、例えば図１６の構成例（ｄ）に示したように、厚さの変化方向が逆方向となる２種類の光路長変更部材を１つの撮像装置に対して設ける構成を用いることが可能である。この場合、撮像装置の撮像面の第１撮像領域に対して、所定の変化方向に沿って光路長が変化する第１光路長変更部材を配置し、撮像面の第２撮像領域に対して、上記変化方向に沿うとともに異なる変化率、好ましくは逆方向に光路長が変化する第２光路長変更部材を配置する構成とする。

このような構成では、通常、第１撮像領域、及び第２撮像領域に入射する光像が異なるものとなる。これに対して、焦点制御用の画像を取得するための光像を、第１光路長変更部材及び撮像装置の撮像面の第１撮像領域への第１光路、及び第２光路長変更部材及び撮像装置の撮像面の第２撮像領域への第２光路へと分岐する光分岐光学系を備えることが好ましい。

図２５は、焦点制御用の撮像装置に対する光分岐光学系について示す図である。図２５の構成（ａ）では、焦点制御用の画像を取得するための撮像装置１００の第１撮像領域１０１に対して第１光路長変更部材１１１を配置し、第２撮像領域１０２に対して第１光路長変更部材１１１とは逆方向に光路長が変化する第２光路長変更部材１１２を配置している。この場合、上記したように、撮像装置１００の２つの撮像領域１０１、１０２に入射する光像が異なるものとなる。

一方、図２５の構成（ｂ）では、光像を第１撮像領域１０１へと反射する５０％反射ミラー１２１、及び光像を第２撮像領域１０２へと反射する１００％反射ミラー１２２を有する光分岐光学系１２０を設けている。これにより、光分岐光学系１２０で分岐された同一の光像が撮像領域１０１、１０２に入射することとなり、焦点制御の精度を向上することができる。

なお、この構成（ｂ）では、光分岐光学系１２０の前段に１００％反射ミラー１２５を配置している。このような反射ミラー１２５を設けることにより、撮像装置１００へと入射される光像の視野を絞って、撮像領域１０１、１０２間での光像の重畳等を防止することができる。ただし、このような反射ミラー１２５については、不要であれば設けなくても良い。また、この構成（ｂ）では、反射ミラー１２２と第２撮像領域１０２との間に光路長調整部材１２６を設置して、光路長の補正を行っている。また、光分岐光学系としては、図２５の構成（ｃ）に示す光分岐プリズム１３０等を用いても良い。

また、上記した構成では、撮像領域１０１、１０２で取得された２つの計測対象画像Ｘ_１’，Ｘ_２’に対して求められた総和Ｔ_１，Ｔ_２について、それらの輝度差を補正するため、Ｔ_１をＴ_１×（Ｘ_２’の平均／Ｘ_１’の平均）に置き換えることが好ましい（図５のフローチャート参照）。

本発明による顕微鏡装置は、試料の画像を取得する際の焦点制御を好適に行うことが可能な顕微鏡装置として利用可能である。すなわち、本発明の顕微鏡装置によれば、所定の変化方向に沿って互いに異なる変化率で光路長が変化するように構成され、２次元の画像を取得可能な第１撮像手段及び第２撮像手段を有する焦点制御用撮像手段を設け、これらの撮像手段によって取得された２種類の画像を用いて焦点計測を行うことにより、試料の画像を取得する際の焦点制御情報を精度良く求めて、焦点制御を好適に行うことが可能となる。

Claims (14)

1. 試料の光像を焦点制御に用いられる焦点制御用光路へと導く導光光学系と、
   前記焦点制御用光路上に設置され、前記焦点制御用光路へと導かれた前記光像による２次元の画像を取得する焦点制御用撮像手段と、
   前記焦点制御用撮像手段によって取得された画像を解析し、その解析結果に基づいて、前記試料を撮像する際の焦点制御情報を取得する焦点制御手段とを備え、
   前記焦点制御用撮像手段は、
   撮像面内において所定の変化方向に沿って前記導光光学系での光路長が変化するように構成された第１撮像手段と、
   撮像面内において前記変化方向に沿うとともに前記第１撮像手段とは異なる変化率で前記光路長が変化するように構成された第２撮像手段と
   を有することを特徴とする顕微鏡装置。
2. 前記導光光学系は、前記試料の光像を焦点制御に用いられる前記焦点制御用光路、及び前記試料を撮像する際に用いられる画像取得用光路へと導くように構成され、
   前記画像取得用光路上に設置され、前記画像取得用光路へと導かれた前記光像による１次元または２次元の画像の取得に用いられる画像取得用撮像手段と、
   前記画像取得用撮像手段による画像の取得を制御する画像取得制御手段と
   を備えることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
3. 前記導光光学系は、前記試料の光像を前記画像取得用光路及び前記焦点制御用光路へと分岐する光分岐手段を含み、
   前記画像取得用撮像手段は、前記焦点制御用撮像手段とは別個に構成されることを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
4. 前記導光光学系は、前記焦点制御用光路と同一の光路を前記画像取得用光路として構成され、
   前記画像取得用撮像手段は、前記焦点制御用撮像手段に含まれる一の撮像装置を用いて構成されることを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
5. 前記第１撮像手段及び前記第２撮像手段のそれぞれは、
   前記変化方向に沿って前記光路長が変化するように撮像面が前記焦点制御用光路に対して所定角度で傾いた状態で設置された撮像装置
   を有することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
6. 前記第１撮像手段及び前記第２撮像手段のそれぞれは、
   撮像装置と、
   前記撮像装置の撮像面に対して所定位置に、前記変化方向に沿って前記光路長が変化するように設置された光路長変更手段と
   を有することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
7. 前記焦点制御用撮像手段は、単一の撮像装置を有し、
   前記第１撮像手段は、前記撮像装置の撮像面の第１撮像領域に対して所定位置に、前記変化方向に沿って前記光路長が変化するように設置された第１光路長変更手段を用いて構成され、
   前記第２撮像手段は、前記撮像装置の撮像面の第２撮像領域に対して所定位置に、前記変化方向に沿うとともに前記第１光路長変更手段とは異なる変化率で前記光路長が変化するように設置された第２光路長変更手段を用いて構成されている
   ことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
8. 焦点制御用の画像を取得するための前記光像を、前記第１光路長変更手段及び前記撮像装置の撮像面の前記第１撮像領域への第１光路、及び前記第２光路長変更手段及び前記撮像装置の撮像面の前記第２撮像領域への第２光路へと分岐する光分岐光学系を備えることを特徴とする請求項７記載の顕微鏡装置。
9. 前記第１光路長変更手段及び前記第２光路長変更手段を、前記撮像装置の撮像面に対して前記焦点制御用光路上にある位置、及び前記焦点制御用光路から外れた位置の間で駆動する駆動手段を備えることを特徴とする請求項７記載の顕微鏡装置。
10. 前記撮像装置は、その撮像面が、前記第１撮像領域及び前記第２撮像領域を含んで前記焦点制御用撮像手段として機能する焦点計測領域と、前記試料を撮像する際に用いられる画像取得用撮像手段として機能する画像取得領域とを有することを特徴とする請求項７記載の顕微鏡装置。
11. 前記第１光路長変更手段と前記第２光路長変更手段とは、前記変化方向に沿うとともに互いに逆方向に前記光路長が変化するように設置されていることを特徴とする請求項７記載の顕微鏡装置。
12. 前記焦点制御手段は、前記焦点制御用撮像手段によって取得された画像における前記変化方向についての画像のコントラスト変化を解析し、その解析結果に基づいて前記焦点制御情報を取得することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
13. 前記焦点制御手段は、前記焦点制御用撮像手段によって取得された画像から前記変化方向に沿った所定幅の計測対象画像を切り出し、前記計測対象画像、及び前記計測対象画像を前記変化方向と垂直方向にシフトさせたシフト画像の差分絶対値画像によって前記画像のコントラスト変化を解析することを特徴とする請求項１２記載の顕微鏡装置。
14. 前記焦点制御手段は、前記焦点制御用撮像手段によって取得された画像が前記焦点制御情報の取得に適用可能な画像であるかどうかを判断し、適用可能と判断した場合に前記画像を解析し、その解析結果に基づいて前記焦点制御情報を取得することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。

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