CN201047885Y - 在线细胞显微观察仪 - Google Patents

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王绍娟
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贺莉清
张恂
张明
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Abstract

本实用新型涉及一种用于生化反应器的在线细胞显微观察仪，包括观察仪主体，物镜，观察入射窗，取样装置，外部光源系统；其特点是：外部光源系统与物镜之间设置反射棱镜，物镜后面，观察入射窗前设有反射镜，反射棱镜前面放置环形光阑片，反射棱镜侧面上部置有CCD或面阵图像传感器；取样装置由取样块，弹性元件，移动装置构成，其中，取样块与移动装置的驱动轴之间连接弹性元件，取样块前端面与观察入射窗之间的间隙构成采样池。本实用新型的外部光源系统通过替换不同滤色片、能很方便地更换波长；同时暗视场照明能提高观察仪对于细胞所成图像的对比度以及分辨率；并且具有结构简单，使用方便，制造成本低等特点。

Description

在线细胞显微观察仪
技术领域
本实用新型涉及一种在线细胞显微观察仪，特别是一种应用于生化反应罐的在线细胞显微形态观察仪。
背景技术
生物反应过程中以活细胞培养进行产品生产时，细胞生长与形态变化是极重要的监测参数，长期来以从罐中取样的方法，通过离线显微镜观察获得。近年来随着电子技术的进步，可以把图象转化为数字信号，进行计算机处理，由此得到量化的生长与形态变化信息。但是，以上方法只是离线间隔采样，缺乏动态观察，特别如动物细胞大规模培养过程，抗杂菌污染是过程操作的首要问题，因此不可能频繁取样，由此带来观察动态性差，过程分析困难的问题。
根据以上使用情况，插入到发酵罐的在线细胞显微观察仪必须符合以下基本要求：1)显微观察仪的分辨率和视野能清晰区分细菌、真菌和动物细胞，死细胞与活细胞，并作相应的形态分析；2)由于培养过程细胞浓度变化，显微观察仪必须有相应的最大浓度界限；3)必须克服显微探头长期插入发酵罐后形成的镜头表面菌体生长或吸附；4)显微观察仪结构有利于生物反应器的灭菌和无菌操作；5)显微观察仪必须具有符合反应器要求的实时数字图象信号转化与处理能力。
德国Dr Christoph Bittner于1994年在博士学位论文中描述了一种荧光激发法的在线显微装置(原位显微镜：培养过程中生物量在线测定的新过程，Dr Christoph Bittner，Hannover，1994)。其主要工作原理如图1所示，激光发出的单色紫外光经透镜L1、小孔空间滤波后再经透镜组L2、L3由双色镜片反射至物镜，然后由物镜投射至反应罐腔内的细胞表面，由于荧光效应，细胞产生的荧光经物镜汇聚，双色镜片以及反射镜，再经滤波片后成像于同步摄像机上。由于反应罐内的细胞高速旋转，因此要求同步摄像机的曝光时间很短，一般不超过2ms(根据放大倍数的不同可能需要调整)。此方法的优点为不需要复杂的机械取样装置。但该方案采用亮视场照明方式，对于透明细胞所成图像的对比度以及分辨率不好；又由于采用高速摄影，单波长荧光激发的方式，在使用中更换激发光波长成本较高。
在2004年美国有专利介绍了一种基于在线采样的显微观察仪(US 6,809,862)。如图2所示，采样窗口4来回移动，当采样窗口4移动到显微镜16以及照明灯源所在位置时，反应罐10内的细胞溶液就流入观察腔12；当采样窗口4移动至其他位置时，观察腔12内的细胞溶写相对稳定，以便于显微观察。为了更换显微镜头方便，如图3所示专门设计了一个清洗腔。拉动拉杆2，使得显微镜头以及采样窗口4到达清洗腔位置，清洗腔腔壁有孔8，可用于引入蒸汽或消毒液进行消毒或清洗。同时在此位置，可以方便地更换显微镜镜头。但该方案采用亮视场照明方式，对于透明细胞所成图像的对比度以及分辨率不好；又由于照明系统在反应罐内工作，不便于更换光源、切换光源激发波长，无法区分不同种类的细胞，如死细胞与活细胞；且频繁的取样与消毒会给在线的生物培养造成染菌的隐患。
2004年德国专利DE10350243介绍了一种利用SLD(Super LightDiode)照明，Multimode Fiber(多模光纤)传输、同步高速摄像的在线细胞显微观察仪。激光或发光二极管发出的光线经多模光纤传输到反应罐内，照射反应罐(反应器)内的细胞，细胞反射的光线经物镜汇聚后成像在CCD摄像机上。由于细胞在反应罐内不断地运动，因此要求摄像机的曝光时间比较小，才能在瞬间抓住细胞影像。摄像机拍摄的图片送入计算机处理。该方案采用亮视场照明方式，对于透明细胞所成图像的对比度以及分辨率不好；又由于在反应罐搅拌速度较快的情况下必然采用高速摄像机，由于没有取样装置限制景深，因此与图1所示方案一样对景深影响无法消除；同时由于其光源采用复杂的SLD(Super Light Diode超亮发光二极管)，光源驱动控制器比较复杂，因此更换光源、切换激发波长成本高且比较困难。
发明内容
本实用新型所要解决的技术问题是采用暗视场照明以提高在线细胞显微观察仪对于细胞所成图像的对比度以及分辨率；提供一种可更换波长的外部光源系统；结构简单的机械取样装置，操作简便和制造成本低的用于生化反应器的在线细胞显微观察仪。
为解决上述技术问题，本实用新型采用的技术方案如下：
一种在线细胞显微观察仪，包括观察仪主体，物镜，观察入射窗，取样装置，外部光源系统；观察仪主体前端设置观察入射窗，观察入射窗前部设置取样装置，观察仪主体内，观察入射窗后面放置物镜和外部光源系统，其特点是：外部光源系统与物镜之间设置反射棱镜，物镜后面，观察入射窗前设有反射镜，反射棱镜前面放置环形光阑片，反射棱镜侧面上部置有CCD或面阵图像传感器；取样装置由取样块，弹性元件，移动装置构成，其中，取样块与移动装置的驱动轴之间连接弹性元件，取样块前端面与观察入射窗之间的间隙构成采样池。
外部光源系统由光源，聚光镜，可换滤色片7组成；光源为卤素灯或LED灯，其发射的光线经过聚光镜聚焦后形成平行光束后透过可换滤色片产生所需的波段光线。
观察仪主体通过锁紧螺母与反应罐相连接；观察仪主体与反应罐之间采用密封圈密封。
移动装置之一由驱动轴，连接杆，取样拉杆，弹性元件组成，其中装有驱动轴的连接杆通过螺丝与取样拉杆相连接，取样拉杆与弹性元件在连接处通过焊接进行密封和连接，同时弹性元件的另外一端面也在连接处通过焊接与观察仪主体相连接。
移动装置之二由驱动轴，电机，取样筒组成，其中取样筒连接在观察仪主体的前端，取样筒后端置有电机，电机输出轴连接驱动轴。
取样块由三个不同直径圆柱体构成，且由不锈钢或蓝宝石材料制成。
CCD或面阵图像传感器经光电转换将数字信号传输给图像采集处理单元，集处理单元将处理结果送入计算机分析，显示或存储。
本实用新型的有益效果是：
(1)光源发出平行光束透过可替换的不同滤色片产生特定波段的光线后，通过环形光阑片处理将所入射的光线转换为环形的平行光束，并且经过反射镜形成一个具有大环形孔径角的照明光线照射取样块与观察仪观察窗之间所形成的取样池内部的细胞溶液。由于照明光线是环绕细胞溶液进行入射照明的，其光线不返回进入物镜。因此视场是暗视场。只有被照射的溶液中细胞或颗粒的反射光线进入物镜后经镀有反射膜的45度反射棱镜反射后投射到CCD或面阵图像传感器上。因此，本实用新型的外部光源系统通过替换不同滤色片、能很方便地更换波长；同时暗视场照明能提高观察仪对于透明细胞所成图像的对比度以及分辨率；
(2)取样装置由取样块，弹性元件，移动装置构成，取样块的端面与观察仪观察窗之间的间隙空间形成了一个与反应罐隔离的取样池，此时取样池内的溶液细胞与反应罐内的溶液细胞相对隔离，不随反应罐的搅拌器运动，便于观察。而且移动装置结构简单，使用方便，制造成本低。
附图说明
图1是荧光激发法的在线显微装置的结构原理图；
图2是美国专利US 6,809,862的显微观察仪的光学原理示意图；
图3是美国专利US 6,809,862的显微观察仪的采样腔、清洗腔结构示意图；
图4是本实用新型的光学照明以及成像光路示意图；
图5是本实用新型的取样装置实施例之一结构示意图；
图6是本实用新型的取样装置实施例之二结构示意图；
图7，8是采样池的工作示意图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本实用新型作进一的说明。
如图4所示，本实用新型的用于生化反应器的在线细胞显微观察仪，包括观察仪主体43，反射镜23，物镜24，观察入射窗22，取样装置40，外部光源系统60，反射棱镜25，环形光阑片26，CCD或面阵图像传感器30。
观察仪主体前端设置观察入射窗22，观察入射窗22前部设置取样装置40，观察仪主体43内，观察入射窗22后面放置物镜24和外部光源系统60。
外部光源系统60与物镜24之间设置反射棱镜25，物镜24后面，观察入射窗22前设有反射镜23，反射棱镜25前面放置环形光阑片26，反射棱镜25侧面上部置有CCD或面阵图像传感器30。
外部光源系统60由光源28，聚光镜29，可换滤色片27组成；灯源28可以采用卤素灯、LED灯，其发射的光线经过聚光镜29聚焦后形成平行光束出射。平行光束透过可替换滤色片27产生特定波段的光线后，通过环形光阑片26处理将所入射的光线转换为环形的平行光束。环形平行光束经过反射镜23形成一个具有大环形孔径角的照明光线照射取样块21与观察仪观察窗22之间所形成的取样池内部的细胞溶液。由于照明光线是环绕细胞溶液进行入射照明的，其光线不返回进入物镜24。因此视场是暗视场。只有被照射的溶液中细胞或颗粒的反射光线进入物镜24后经镀有反射膜的45度反射棱镜25反射后投射到CCD或面阵图像传感器30上。经30光电转换后成为数字信号传输给图像采集处理单元31。图像采集处理单元31将处理结果送计算机32进行分析，显示或存储。
如图5，6所示，取样装置40由取样块21，弹性元件38，移动装置构成，其中，取样块21与移动装置的驱动轴51之间连接弹性元件38，取样块21前端面与观察入射窗22之间的间隙构成采样池50。
如图5所示，移动装置之一由驱动轴51，连接杆46，取样拉杆44，弹性元件39组成，其中装有驱动轴51的连接杆46通过螺丝47与取样拉杆44相连接，取样拉杆44与弹性元件39通过在9a处焊接进行密封和连接，同时弹性元件39的另外一端面也通过在9b处焊接与观察仪主体43相连接。
观察仪主体43通过锁紧螺母42与反应罐41相连接。观察仪主体43与反应罐41之间采用密封圈45密封。观察仪观察入射窗22浸入反应罐41内部，其材料为石英玻璃或蓝宝石。取样块21为三个不同直径圆柱体形状，采用不锈钢或蓝宝石材料制成。其一端面与弹性元件38焊接，另外一端面可以沿观察仪观察窗中心轴线方向左右移动，与观察仪观察窗22组成了一个采样池50。
向外拉动取样拉杆44，取样拉杆44通过连接杆46、弹性元件38推动取样块21向靠近观察窗22方向移动，同时弹性元件39处于压缩状态；向内推动取样拉杆44，取样拉杆44通过连接杆46、弹性元件38推动取样块21向远离观察窗22方向移动，同时弹性元件39处于松弛状态。弹性元件38、39均采用不锈钢材料制成，同时连接杆46、拉杆44也是由不锈钢材料制成。
如图7，8所示，当连接杆46沿箭头方向移动时，连接杆46通过弹性元件38带动取样块21朝着远离观察仪观察窗22的方向移动，取样块21与观察仪观察窗22之间的距离变大，这时取样块21与观察仪观察窗22之间的组成的取样池50与反应罐41连通，取样池细胞溶液与反应罐内的细胞溶液连通。当连接杆46通过弹性元件38带动取样块21朝着靠近观察仪观察窗22的方向移动时，取样块21与观察仪观察窗22之间的距离变小，到达极限位置时，取样块21的端面与观察仪观察窗22之间的间隙空间形成了一个与反应罐41隔离的取样池50，此时取样池50内的溶液细胞与反应罐内的溶液细胞相对隔离，不随反应罐的搅拌器运动，便于观察。成形后的取样池的深度大小可以通过控制取样块21端面与观察仪观察窗22之间的距离来获得。
如图6所示，移动装置之二由驱动轴51，电机48，取样筒49组成，其中取样筒49连接在观察仪主体43的前端，取样筒49后端置有电机48，电机48输出轴连接驱动轴51。
观察仪主体43与反应罐41通过锁紧螺母42相连接。采样池50是由取样块21的一个端面与观察仪观察窗22之间的间隙组成。电机48为耐高温电机，密封在观察仪主体43中的浸入反应罐溶液部分中。当电机48通过弹性元件38带动取样块21沿着使采样池50体积变小的方向移动至一个极限位置，采样池50内的细胞溶液与反应罐41内的溶液隔离，因此采样池内的细胞溶液相对静止，便于观察。相反，当电机48带动取样块21向另一方向移动时，取样池50内的溶液与反应罐41内的细胞溶液混合。
本实用新型的实施例一：
为验证本实用新型，使用本实用新型的一种用于生化反应器的在线细胞显微观察仪在微生物反应器中对重组酵母发酵过程观察应用
在培养过程中每2h取样一次进行细胞光密度(OD600)测定、细胞干重、离线显微镜血球计数，同时在线细胞显微观察仪进行自动观察和计数，结果如表1。
由表1可知：在线细胞显微观察仪的细胞在线计数结果与细胞光密度(OD600)、细胞血球计数板计数结果基本一致，而在培养后期时稍微偏大。各细胞浓度与发酵时间进行指数方程拟合，线性相关系数以在线细胞显微观察仪最高，与血球计数板离线计数基本一致，而明显高于细胞光密度和细胞干重计数法的结果，这是由于光密度法和干重法均无法区分死、活细胞、以及发酵液中的固形物颗粒，因而误差较大。
表1离线、在线细胞计数和细胞光密度、细胞干重结果比较
               离线血球计数    在线细胞显微    细胞光密度    细胞干重
培养时间(h)    板菌数          观察仪计数      OD600         DCW
               (107个/mL)      (107个/mL)                    (g/L)
0              0.99±0.12      1.2±0.08       8.2           6.1
4              3.10±0.11      3.12±0.09      8.9           6.6
6              6.29±0.10      6.31±0.10      10.1          7.2
8              12.11±0.11     12.27±0.10     12.1          8.3
10             16.46±0.09     16.50±0.11     13.8          9.2
R2(线性相关)   0.9908          0.9934          0.9237        0.9353
本实用新型的实例二：
为验证本实用新型，使用本实用新型的用于生化反应器的在线细胞显微观察仪在哺乳动物细胞反应器中对重组动物细胞(HEK293)培养过程观察应用
发酵过程每24h取样一次进行离线细胞血球计数。二者细胞计数结果如表2。由表2可知，离线的血球计数和在线细胞显微观察仪的细胞数量计数结果基本一致。
表5L机械搅拌式反应器培养HEK293细胞密度比较
Figure Y20072007120700131

Claims (7)

1.一种在线细胞显微观察仪，包括观察仪主体(43)，物镜(24)，观察入射窗(22)，取样装置(40)，外部光源系统(60)，观察仪主体(43)前端设置观察入射窗(22)，观察入射窗(22)前部设置取样装置(40)，观察仪主体(41)内，观察入射窗(22)后面放置物镜(24)和外部光源系统(60)，其特征在于，所述外部光源系统(60)与物镜(24)之间设置反射棱镜(25)，物镜(24)后面，观察入射窗(22)前设有反射镜(23)，反射棱镜(25)前面放置环形光阑片(26)，反射棱镜(25)侧面上部置有CCD或面阵图像传感器(30)；所述取样装置(40)由取样块(21)，弹性元件(38)，移动装置构成，其中，取样块(21)与移动装置的驱动轴(51)之间连接弹性元件(38)，取样块(21)前端面与观察入射窗(22)之间的间隙构成采样池(50)。
2.根据权利要求1所述的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述外部光源系统(60)由光源(28)，聚光镜(29)，可换滤色片(27)组成；所述光源(28)为卤素灯或LED灯，其发射的光线经过聚光镜(29)聚焦后形成平行光束后透过可换滤色片(27)产生所需的波段光线。
3.根据权利要求1所述的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述观察仪主体(43)通过锁紧螺母(42)与反应罐(41)相连接；观察仪主体(43)与反应罐(41)之间采用密封圈(45)密封。
4.根据权利要求1所述的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述移动装置由驱动轴(51)，连接杆(46)，取样拉杆(44)，弹性元件(39)组成，其中装有驱动轴(51)的连接杆(46)通过螺丝(47)与取样拉杆(44)相连接，取样拉杆(44)与弹性元件(39)在连接处(9a)通过焊接进行密封和连接，同时弹性元件(39)的另外一端面也在连接处(9b)通过焊接与观察仪主体(43)相连接。
5.根据权利要求1所述的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述移动装置由驱动轴(51)，电机(48)，取样筒(49)组成，其中取样筒(49)连接在观察仪主体(43)的前端，取样筒(49)后端置有电机(48)，电机(48)输出轴连接驱动轴(51)。
6.根据权利要求1所述的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述取样块(21)由三个不同直径圆柱体构成，且由不锈钢或蓝宝石材料制成。
7.根据权利要求1所述的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述CCD或面阵图像传感器(30)经光电转换将数字信号传输给图像采集处理单元(31)，集处理单元(31)将处理结果送入计算机(32)分析，显示或存储。
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