CN1312368A - 用于过程优化与数据放大的自控发酵罐装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置。该装置根据发酵物料流检测的概念由带电机和搅拌器的发酵罐体、具有14个以上参数检测及控制的仪器仪表和传感装置的传感系统、带特殊安装支架和工艺管道系统以及带有工控机及执行元器件的电气控制柜组成。本装置用于发酵过程优化时可提高发酵单位20～65%。

Description

用于过程优化与数据放大的自控发酵罐装置

本发明涉及生物技术装置，具体涉及一种用于过程优化与数据放大的自控发酵罐装置。

生物反应器是生物技术产业最重要的关键装置之一。

目前国际同类产品的主要公司有德国B.Braun、美国NBS、瑞士Bio Engineering、荷兰Applikon、日本丸菱以及韩国等。其产品的设计原理是根据生物过程动力学为基础的最佳控制操作点进行设计，因此在各种参数控制选择、传感器配置、二次仪表、计算机控制系统直到发酵罐体设计安装及管道部件配置等，不能适应发酵过程细胞代谢流与发酵物料流平衡为基础的优化控制概念，因而严重限制实验室规模发酵过程优化研究以及随后的产业化放大。

NBS、B.Braun及有关产品，一般具有温度、RPM、pH、DO、消泡及补料控制(无补料测量装置)等参数，部分产品也有流量与罐压测量装置。除了在部分报导的实验室自制研究装置以外，在已提供的国内外产品缺少排气O₂、CO₂、补料电子秤量，整体发酵罐体积(或重量)秤重技术等，提供的计算机应用软件只是对操作点的数据变化进行显示，储存和记录，无法作进一步的参数趋势曲线相关分析，因而只能停留在以人工经验为主的实验操作，不能进一步通过计算机联机控制和数据采集系统，实现发酵工艺全过程的数据优化与放大。

本发明的目的是根据发酵过程细胞代谢流及发酵罐物料流平衡的概念与理论，设计符合理论要求的实验装置。通过本装置的实验试验，获取可靠的实验数据，从而达到发酵产品过程工艺优化及用于工业生产的数据放大目的。

本发明提供了一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置。该装置依据发酵物料流检测的概念主要由带电机和搅拌器的发酵罐体、具有14个以上参数检测及控制的仪器仪表和传感装置的传感系统、带特殊安装支架和工艺管道系统以及带有工控机及执行元器件的电气控制柜组成。

本发明用于过程优化与数据放大的自控发酵罐装置检测控制参数配置示意图(如图1所示)，包括1温度传感器；2pH传感器；3溶解氧(DO)传感器；4全罐(含料)秤量传感器；5尾气CO₂接口；6尾气O₂接口；7测速传感器；8压力传感器；9消泡传感器；10热质量流量计；11高精度蠕动泵；12基质补料电子秤；13前体或油电子秤；14酸碱物电子秤；15循环泵；16电磁阀；17数/模转换器；18模/数转换器；19下位机(工控机)；20上位机；21调制解调器；22料瓶；23稀土电机；24预热器。

本发明用于过程优化与数据放大的自控发酵罐装置中的传感系统包括1温度传感器；2pH传感器；3溶解氧(DO)传感器；4全罐(含料)秤量传感器；5尾气CO₂接口；6尾气O₂接口；7测速传感器；8压力传感器；9消泡传感器。

本发明用于过程优化与数据放大的自控发酵罐装置中的支架和工艺管道系统见图1自控发酵罐检测控制参数配置示意图、图2 FUS系列自控发酵罐管路系统示意图和图3罐体总成及管架简图所示，包括22料瓶；24预热器；25全罐(含料)秤量支座；26取样用特殊支架；27罐体总成；28快速装拆机座；29电动机；30管架；31油水分离器；32减压阀；33过滤器；34流量计；35空气过滤器；36压力表；37冷却器；38管道视镜；39热水器；40无死体积取样阀。41消泡传感器接口；42尾气CO₂接口；43尾气O₂接口；44温度传感器；45pH传感接口；46 DO传感器接口。

本发明用于过程优化与数据放大的自控发酵罐装置中的带有工控机及执行元器件的电气控制柜见图1和图3，包括10热质量流量计；11高精度蠕动泵；12基质补料电子秤；13前体或油电子秤；14酸碱物电子秤；15循环泵；16电磁阀；17数/模转换器；18模/数转换器；19下位机；20上位机；21调制解调器；23稀土电机。

发酵罐在生物技术产业化过程中具有重要地位，而发酵罐中所进行的微生物发酵实质上是在分子水平的遗传特性、细胞水平的代谢调节和工程水平的传递特性三个不同方向上发生调控的。发酵过程的复杂性和高度非线性等诸多因素以及多容量过程特征，使系统具有动态性和不可预测性。发酵过程要达到过程优化与数据放大的目标，必须要有成熟的发酵过程参数检测技术的支持。因此，在小试、中试和生产规模的发酵罐上必须配置有大量的传感器，对物化和生物等各种参数进行在线或离线测量，才能为过程分析和优化控制提供充分有效的数据。

本发明首次提出发酵过程细胞代谢流与发酵物料平衡为基础的优化控制概念，通过大量实验数据的充分研究发现发酵过程各个参数具有各自的相关性。如以某抗生素发酵为例较明显的相关特性有：

*氧消耗速率(OUR)与溶解氧浓度(DO)的相关特性，反映了以供氧为质量传递的反应器物料平衡与氧为限制性基质时的微生物耗氧动力学特性。

*转速(rpm)、流量(F)与DO相关特性，反映了在特定发酵液流变特性情况下，在发酵罐中有关供氧操作变量对氧传递系数K_La的影响，由此而引起的DO变化。

*补糖与pH的关系，在葡萄糖为限制性条件时，糖的加入引起pH下降，随着糖被菌体利用，pH上升，由此，根据pH的变化情况来限量糖的加入。

*补糖引起的二氧化碳释放速率(CER)变化，反映了培养液中葡萄糖的利用情况。葡萄糖的限制性基质情况，以及菌体由于代谢变化所引起的对葡萄糖亲和力的大小，都要引起上述相关特性的变化。

*CER与菌量的关系，在非糖限制情况下，特别是发酵初期，菌量与CER成比例关系，反映了接种量、培养基初始情况和环境操作条件等变化。

*CER与pH的相关。在发酵开始后的某一段时间，随着CER的增加，pH下降，当某一段时间后CER不变，pH就开始回升，反映了基础培养基中淀粉水解与还原糖被菌体利用的动态平衡。

*CER与OUR的相关特性，说明碳源在有氧发酵时，二氧化碳的产生与氧的消耗是同时发生，但每产生单元CO₂的量所消耗的氧是不相同的，即RQ值不同。反映了不同还原程度的碳源被利用时不同代谢途径所发生的碳源氧化程度不同。

*通气流量F与pH的相关性。当加糖量不变时，增加通气量，pH上升，降低通气流量，pH下降，实质上是由于CO₂被通气带走或积累所引起的。

此外，在不同碳源限制或非限制下，温度与CER、OUR之间，RQ与菌体生长(x)、产物形成(P)之间、NH₂-N与菌体生长之间，pH与OUR等之间，都存在着不同程度的相关特性。内容很多，这些相关可分为理化相关与生物相关，反映了工程水平的传递、混合特性，细胞水平的代谢强度与代谢途径。有些相关还具有不可逆的时序性，可能是由于环境体系不可逆的变化(例有毒代谢物质形成)，细胞结构的变化(例细胞壁的通透性)或调控基因的作用特性。

就细胞内代谢来看，微生物主要代谢体系大致可分为以下三个体系，即可多条途径利用的碳源分解代谢体系(简称体系Ⅰ)，以反馈调节为主要的结构单元的合成体系(简称体系Ⅱ)，和由遗传因素决定的大分子的合成体系(体系Ⅲ)，这些体系间有的是紧密联系，有的是松散关系，有相对独立的运转能力，外界环境条件的控制，首先是对体系Ⅰ发生影响，体系Ⅰ与体系Ⅱ的联系往往是紧密的，但与体系Ⅲ是松散的，而某抗生素是由体系Ⅲ形成的，由此可见，这种参数曲线的相关特性很难直接与某抗生素生产相关联。因此，造成以生产为目标的曲线相关分析的困难，必须从大量实验中找出有效的相关特性，才能有所突破。

以某一抗生素发酵过程来看(如图4pH、CER、OUR、DO变化相关特性所示)，引起我们注意的是约9小时前的pH下降，是与CER不断上升相对应，表明了pH下降除基础培养基中硫铵中氮源被利用引起的生理酸性外，还与淀粉水解成还原糖作碳源利用有关。在约9小时后，来自于淀粉还原糖增加速率小于菌体需求量的增加，CER开始平缓，随即迅速下降。这时pH开始上升。显而易见，葡萄糖浓度已进入了限制性基质控制范围，从糖代谢及其作用可知，这种糖浓度环境为菌体代谢进入HMP途径以及CAMP的调节作用创造了条件。

随后补入的葡萄糖用来控制pH在一定值，CER也维持在某一数量值。从耗氧发酵特性来看，显而易见，9小时左右OUR也达某一峰值，随后下降。从氧的物料平衡原理，DO也有一个对应的下降峰，也就是9小时左右CER、pH、OUR、DO都有一个对应的上升峰或下降峰。这种峰值的高低，以及出现的时间反映了发酵初期的系统特征，这种特征与各种因素有关，其中包括菌种代谢特性变化，种子质量、接种量，基础培养基情况(配料或消后体积，原材料，配比)等因素，必须从这些相关曲线的异常情况中发现各种可能的因素，及时纠正。

令人感兴趣的是发酵初期RQ值的变化，即有明显的下降峰，持续时间15小时以上(如图5发酵初期的RQ值下降峰所示)，这种RQ的下降，也许是由于丙酰CoA在羧化酶作用下固定CO₂，形成甲基丙二酸。但值得注意的是RQ的下降峰与CER的下降峰同时发生，这期间一旦加入葡萄糖，RQ又对应回升(如图6加入葡萄糖对RQ的影响所示)，说明这种RQ下降峰是由于利用还原性较高的基质作为碳源引起的，经研究分析，只能是有机氮源在起作用。从前述大环内脂的乙酰化反应来看，这种情况有利于甲基丙二酰CoA的形成。计算机在线数据采集所得到结果说明了有机氮源以碳氮骨架通过氨基酸代谢进入到菌体，有利于某抗生素大环的形成，与长期以来认为有机氮源是某抗生素最佳氮源的经验是吻合的。曲线相关还进一步提出了有机氮源利用的时间，利用方式和不同碳源间的竞争性利用特性，为过程工艺优化提供了重要线索。

随着菌量的不断增加，发酵进入了以菌体维持为主的缓慢生长期，即过渡期。从细胞经济和维持的能源供应来看，最理想的碳源就是葡萄糖，由于维持的碳源量增加，培养基中残糖量减少，约在25h左右，发现CER开始下降，说明余留的可水解淀粉碳源不多，如果不及时加入葡萄糖，就可能影响菌体维持，不仅影响菌体量，而且还影响菌体质量。从菌体生长动力学来看，碳源的加入(即提高培养基中碳源浓度)可以提高菌体生长速率，进一步带动氮源消耗，提高菌量，最终表现在CER升高、RQ值也升高，而残糖浓度进一步降低。这种低残糖浓度和低NH₂ ⁺-N浓度，以及高生产能力(即比生产率)和高菌浓(即CER值高)的发酵培养体系的形成，为高产某抗生素创造了条件。只要发酵罐溶氧满足临界以上，及时补糖和前体，一般来说都可以达高产目的。其中补糖控制按前述，以pH值反馈控制，可以根据不同阶段需糖量的不同，以及通气情况及可能的pH测定误差，可适当改变过程pH设定值来达到上述控制补糖的目的。

(1)H⁺平衡

培养液中的pH是一个非常重要的参数，它的改变会引起各种酶活力的改变，影响菌体对基质的利用速度，甚至改变菌体的代谢途径和细胞结构，最终影响产品的得率。但是，另一个引人注意的是，pH变化实质上是H⁺平衡的变化结果，通过有关的物料流的相关分析，对研究菌体代谢和反应器优化操作具有重要的理论与实践意义。

如图7所示是发酵液中的H+平衡图。图中S1、S2、S3和S4分别代表淀粉、葡萄糖、硫铵和黄豆饼粉。k1为催化淀粉水解为葡萄糖的淀粉酶的活力，它的大小与菌体量及菌体活动有关，即k1=αX；k2为菌体转化还原糖为有机酸的速率系数，其值与菌体量与菌体活动有关，即k2=βX；k1N为菌体水解有机氮源产生氨基氮的速率系数，同样假设k1N=γX。

经数学推导得以硫铵为氮源时H⁺的平衡式为： $\frac{{\mathrm{dC}}_{H^{+}}}{\mathrm{dt}}=\mathrm{\βX}({\mathrm{\αXS}}_{1t}+I_c)+k_{3}k\frac{C_N}{k_N+C_N}\·\frac{C_c}{k_c+C_c}X+k_7[\mathrm{CER}-k_L{a}_{{\mathrm{co}}_2}(C_{{\mathrm{co}}_2}-C_{{\mathrm{co}}_2}^{*})]$ ${-k}_4\mathrm{mX}-k_{5}k\frac{C_N}{k_N+C_N}\·\frac{C_c}{k_c+C_c}X-k_6\frac{\mathrm{dP}}{\mathrm{dt}}$ 考虑有机氮源作为氮源利用时，则 $\frac{{\mathrm{dC}}_{H^{+}}}{\mathrm{dt}}=\mathrm{\β}\×(\mathrm{\α}\×S_{1t}+I_C)+\mathrm{\θ}(K\frac{C_N}{K_N+C_N}\·\frac{C_C}{K_C+C_C}X+\frac{{\mathrm{dC}}_N}{\mathrm{dt}}-S_{4t}\mathrm{rX}$ $+K_7[\mathrm{CER}-K_L{a}_{{\mathrm{CO}}_2}(C_{{\mathrm{CO}}_2}-C_{{\mathrm{CO}}_2}^{*})-K_4\mathrm{mX}$ $-K_{5}K\frac{C_N}{K_N+C_N}\·\frac{C_L}{K_C+C_C}X-K_6\frac{\mathrm{dP}}{\mathrm{dt}}$

(2)pH与F的相关性

在实验过程中，发现当空气流量增大时，某抗生素发酵单位较高。以前一直认为是因为供氧提高或发酵液浓缩而引起发酵单位的提高的。但是，从测控系统所提供的数据(见图8pH与F的相关性)来看，每当空气流量增加的时刻，pH都有不同程度的增大。究其原因，从上式可发现，当空气流量增大时，K_La增大，即大的空气流量更多地带走了发酵液中的CO₂，降低了CO₂分压，使得发酵液中H⁺浓度下降，pH上升。而为了控制pH，必须相应地增加葡萄糖的流加量，从而可能有利于某抗生素的合成。

(3)补糖与pH的相关性

近年来，在抗生素等发酵产品的生产中，基于菌体生长或产物形成的最适pH的认识，较先进的发酵工艺普遍采用了流加碳源来控制pH的工艺控制。如果单纯从生化反应与pH的动力学关系来看，确实存在菌体生长或产物形成的最佳pH值。但发酵过程pH值的变化更由于生理酸性或碱性物质的利用或释放，这种变化反映了细胞代谢流或不同基质利用强度的变化。在某抗生素的生物合成过程中，葡萄糖的精确加入非常重要。通过补糖来控制pH，更重要的意义在于控制糖的方式，即控制葡萄糖为限制性基质的代谢流，把菌体的生理代谢向有利于某抗生素生物合成的方向进行。但长期来由于缺乏发酵过程测控系统和数据分析软件的协助，对此缺乏本质的认识，造成生产的波动或实验研究的失败。

图9为某抗生素发酵过程中补糖与pH的相关性。在葡萄糖为限制性基质时，糖的加入引起pH下降，随着糖被菌体利用，pH又将反弹。这种现象也可通过上式来解释，即I_c＞0，引起H⁺浓度上升，pH下降；之后，随着糖的耗遏，有机酸的浓度不断下降，H⁺浓度下降，pH上升。

(4)CER与pH的相关性

在发酵前期(10h之前)，没有流加葡萄糖，培养基中氮源与碳源属非限制性。由于硫铵和葡萄糖过量存在，设有机氮源暂不利用，则氨基氮主要从硫铵中来，同时产物还没有开始形成，即 $I_c=0,\frac{C_N}{k_N+C_N}\·\frac{C_C}{k_C+C_C}=1,\frac{\mathrm{dP}}{\mathrm{dt}}=0$

将上式整理得 $\frac{{\mathrm{dC}}_{H^{+}}}{\mathrm{dt}}={\mathrm{\α\βX}}^2{S}_{1t}+(k_3-k_5)\mathrm{kX}+k_7[\mathrm{CER}-K_L{a}_{{\mathrm{co}}_2}(C_{{\mathrm{co}}_2}-C_{{\mathrm{co}}_2}^{*})]-k_4\mathrm{mX}$

若将CO₂对pH的影响忽略不计，则 $\frac{{\mathrm{dC}}_{H^{+}}}{\mathrm{dt}}=\mathrm{\α\β}{X}^2{S}_{1t}+(k_3-k_5)\mathrm{kX}-k_4\mathrm{mX}$

如图10CER与pH的相关性所示，在发酵刚开始时，上式中S_1t较大，X较小，此时菌体利用培养基中的(NH₄)₂SO₄作为氮源，k₃也较大，故随着CER的增大，pH会以较大的斜率下降。之后，随着发酵的进行，培养基中的淀粉不断水解为葡萄糖，葡萄糖作为碳源和能源被菌体利用而产生酸性物质(如丙酮酸和TCA中的各种物质)，因而随着CER的增大，pH也渐渐下降，但下降的速度已减慢。随着菌体量的增加，菌体对葡萄糖的消耗速率不断加大，但培养基中的淀粉含量已降低到一定程度，淀粉的水解速率满足不了菌体的需求，菌体就开始利用前一时期产生的酸性物质，表现为pH停止下降，在某一值附近维持。随着菌体量的进一步增加，CER也增大，菌体利用酸性物质的速率加大，培养基中酸性物质的浓度渐渐降低，pH开始反弹。当pH反弹到一定程度时，淀粉的水解速度已与菌体对葡萄糖的需求有相当大的差距，显然，此时葡萄糖浓度已成为限制性基质，从前述某抗生素生物合成及其调控机制可知，这种糖浓度环境为菌体代谢进入HMP途径以及发挥cAMP的调节作用创造了条件。某抗生素发酵CER与pH的相关性反映了基础培养基中的淀粉水解速率与菌体对葡萄糖的利用速率之间的动态平衡。

随着葡萄糖浓度进入限制性基质范围，此时应考虑开始流加葡萄糖。补入的葡萄糖用来控制pH在一定值，CER也维持在某一数量值。根据经验，在这一时期，CER和pH都应有一个相应的峰。这种峰出现的时机与峰的高低，反映了发酵初期的系统特征，与种子质量、接种量、培养基情况和菌体代谢特性变化有关。

本发明基于上述发酵过程细胞代谢流及发酵罐物料流平衡的概念与理论，将发酵过程的各个参数科学、有机地联系在一起，使本发明具有如下特点：

(1)根据发酵过程细胞代谢物流所引起的发酵检测参数相关理论指导下的发酵过程计算机数据优化与放大原理，选择了50L以上工作容积，具有温度、搅拌转速、通气流量、罐压、消泡、pH、溶解氧浓度(DO)、发酵液真实体积(或重量)、三个补料量(如基质、前体、油、酸碱物等)的在线参数，并与尾气CO₂和O₂分析仪连接的接口，具有十四个以上参数检测或控制。其发酵罐检测控制参数配置示意见图1自控发酵罐检测控制参数配置示意图。

(2)本发明成功地设计和使用了如下传感技术：

采用先进的热质量流量计，实现了通气质量测量和流量同时控制，为以后的有关氧消耗速率(OUR)、二氧化碳释放速率(CER)等间接参数测量提供了不需温度校正的方便，内给定PID流量自动反馈调节为罐压自动控制提供了简化控制回路的效果(参见图1、2中，序号10)；

压力传感器采用直插式膜隔离罐压传感器，具有抗杂菌污染的不锈钢膜隔离系统，体积小，直接安装罐顶，克服了排气支路带来的随流量不同所引起的压头损失误差(参见图1、2中，序号8)；

用来在线测量培养液体积(或重量)的全发酵罐电子秤重技术，克服了电机扭矩、振动等问题，达到了±0.007％精度，为以后的有关OUR、CER等间接参数的计算机实时数据处理提供了重要基础(参见图1、3中序号4)；

采用高精度可变速蠕动泵，结合在线计算机以占空比调整原理的设计控制，扩大了各种发酵产品的不同补料速率和精度要求(参见图1、3中序号11)；

不同量程范围的补料电子秤的使用，实现了发酵过程的高精度物料平衡计算(参见图1、3中序号12、13、14)。

(3)在罐体和框架上的机械设计特点：

适应罐体(含物料)在线电子秤重元器件的安装支座(参见图3中序号25)；

不影响电子秤重取样系统的支架(参见图3中序号26)；

罐顶可卸式、高容量、小体积变速电机的安装结构(参见图3中序号28)；

适应各种传感器的安装接口(参见图3中序号41、42、43、44、45、46、47、48等)；

热质量流量计的前管道预热系统(参图见1、2中序号24)；

方便操作的多层面开架式管道系统(参见图2、3)。

适合于发酵无菌操作的无死体积取样阀(参见图3中序号40)。

(4)本发明的计算机控制软件是根据现场数据采集和操作的需求以及工艺优化的要求，负责在线参数采集、离线参数输入、间接参数计算、参数数据记录以及部分参数的在线控制，并且通过局域网同步向上位机传送所有参数的数据。由于下位机软件直接和现场的硬件设备相关联，因此要求其具有采集及时、运行稳定以及操作简单的特点。基于此特点，我们选用了组态语言和C语言二种方式分别进行编程设计，同时为了保证数据不丢失、不被破坏，在数据记录时使用了简单冗余技术。图11为人机对话画面，其中图11A为发酵过程控制流程图；图11B为发酵过程实时趋势记录图；图11C为发酵过程pH、补料、消泡控制画面图；图11D为发酵过程温度、转速控制人机画面图。

(5)具有玻璃外门的电气控制柜，安装有二次仪表、工控机系统及各种电气执行元器件及操作键盘在内的独立单元所组成，通过电缆与发酵罐装置连接。外形美观，安装、操作维修方便。

(6)本装置可通过局域网同步向上位机传送所有参数的数据，在上位计算机和软件包的支持下，实现以细胞代谢流所引起的参数相关研究为基础的发酵过程工艺分析，区分发酵过程中所发生的工程水平的传递混和，细胞水平的代谢调节和分子水平的遗传特性等三个不同水平的影响因素，以实现各种高级控制，还可进一步实现远程通讯，在异地进行数据采集和分析。

(7)本装置因能准确地反应发酵全过程，所以可以代替吨级中试发酵罐，由于能将发酵过程的各参数详细、准确地记录和重现具有更优越的用于发酵过程优化与放大性能。

本装置是味精、氨基酸、有机酸、抗生素等传统发酵工业及各种基因工程菌、发酵表达产物的工艺过程优化的基本手段。经本装置FUS-50L(A)自控发酵罐装置研究，然后放大到50M³发酵罐，达到提高抗生素发酵单位45％以上。已经取得的试验结果有：青霉素发酵提高单位40％，红霉素发酵提高单位65％(如图13红霉素发酵实时曲线所示)，金霉素发酵提高单位30％，共计提高工业生产效益每年在5000万以上。本装置能实现标准化，规范化和系列化生产，将具有很大的市场，每年产值在1000万元以上，并对传统生物技术改造和现代生物技术基因工程产品的生产有巨大的社会效益。

实施例

以基因工程人血清白蛋白表达产品为例，本装置中培养基灭菌后，基因工程甲醇营养型酵母由一级种子接种，经180小时以上发酵操作，在计算机人机界面上，得到如图12所示的人血清白蛋白产品表达发酵过程参数趋势曲线图。通过这些曲线的选配以及颜色、分辨率、量程跨度、时间跨度等选择，从这些数据可以看出检测参数曲线的多样性、时变性、相关耦合性和不确定性。

通过相关特性的分析，我们可以看出细胞代谢流的某些分布特征以及在反应器工程水平上传递特性的变化，为我们的发酵过程优化与放大提供了重要线索。相关的内容很丰富，问题就是如何通过分析抓着过程优化或放大的关键内容。

很明显的相关特性如：

*从接种后，DO随着OUR上升不断而下降，反映了以供氧为质量传递的反应器物料平衡与氧为基质时的微生物耗氧动力学特性。

*转速(RPM)、流量(F)与DO相关特性，反映了在特定发酵液流变特性情况下，在发酵罐中有关供氧操作变量对氧传递系数K_La的影响，由此而引起的DO变化。在发酵16、19、23、25小时的几次搅拌提速与DO值的突变相对应，说明了上述关系。在28小时，搅拌转速已达最高值，但由于酵母的高密度发酵的高耗氧，OUR达245mol/m³·h。DO接近零。说明耗氧已远超供氧能力。由此可见，用常规供氧的搅拌发酵罐已不能满足酵母的工业生产应用，必须设法克服。

*补碳源与OUR、DO的关系，克服零水平的DO值是本实验28小时时的主要矛盾。本实验在数据处理软件包的趋势曲线引导下，采用设计合理的基础培养基的方法，在20分钟内，即在发酵时间28.5小时左右反弹，达到DO在70％左右避免了必需采用通纯氧的方法。然后以合适的流加碳源的方法，控制OUR，由此达到控制DO水平。

*pH补氨水与补碳、CER相关特性，以酵母进行高密度高表达此蛋白产品时，工艺规定当pH下降到5.1以下时，采用加氨水控制pH在5.1左右，本装置采用自动流加氨水控制pH的方法，即采用FUS-50L(A)发酵罐中的pH与补氨系统成闭环控制回路，由计算机进行控制。从上位计算机的数据采集系统所得曲线可见。为了达到稳定控制pH，自发酵6小时开始，流加氨水速率(RNH_s)逐渐上升，上升趋势与CER的上升趋势相同。相关程度在0.9左右。发酵时间28小时，基础料液中碳源耗尽，CER、OUR迅即下降，DO上升(说明这期间酵母对碳源的亲和力很大)，这时曲线显示R_NH3下降为零，即停止流加氨水。直到流加碳源开始，氨水流加又重新开始。由此可见，通过pH值的自控调节，达到了培养过程碳源消耗与氮源消耗的自动匹配，实现C/N比的调整。

*氨水流加与菌体生长、表达的关系。整个发酵过程可分为二个时期，发酵开始至60小时为菌体生长期，可以看出流加氨水(R_NH3)速率与菌体生长相对应。也就是说，这时的氨水主要供应菌体生长所需的氮源。60小时至发酵结束，R_NH3明显小于生长期R_NH值，其值与外源表达的蛋白产品相对应，说明这期间氨水主要用在表达外源蛋白所需的氮源。随着发酵周期的延长，表达量减少，R_NH3也逐渐减少甚至停加氨水，发酵终止。

*甲醇流加速率(R_MOH)与OUR、表达的关系。甲醇营养型酵母的主要特征之一是能以甲醇作为唯一碳源和能源，其中醇氧化酶AOX在转录水平上受到严格的双重调控，在碳源饥饿状态下，只有甲醇才能诱导AOX合成后启动P_AOX进行转录和翻译。甲醇营养型酵母另一重要特征是甲醇被AOX氧化为甲醛后，通过完全氧化途径或木酮糖单磷途径为细胞生长提供能量和成分物质。因此，在甲醇营养型酵母表达外源蛋白时时，其代谢流的合理分布是十分重要的问题。此外，值得注意的是，甲醇过量时将对菌体代谢产生严重干涉，即所谓中毒现象，严重时，转录翻译中止。由此，如何控制甲醇的加量就成为关键技术问题。在本项目装置FUS-50L(A)中，在上位计算机数据处理软件包显示的趋势曲线引导下，随着甲醇流加速率(R_MOH)的逐渐增加，OUR逐渐上升，注意防止逆转产生。然后，控制在一个最佳值。即保证菌体所需要的最低碳源(能源)又不表明中毒现象，达到最高表达速率。

*本实验数据重复率好，一般表达在5g/L左右，最高可达7g/L，经放大到500L罐(由B.Braun公司罐经改造后形成的与FUS-50L(A)具有相同检测参数的试验罐)，达到了同样表达水平。由此可见，本实验有关数据可用来放大到20M³以上的发酵罐生产规模。

Claims (8)

1、一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置，其特征在于该装置根据发酵物料流检测的概念由带电机和搅拌器的发酵罐体、具有14个以上参数检测及控制的仪器仪表和传感装置的传感系统、带特殊安装支架和工艺管道系统以及带有工控机及执行元器件的电气控制柜组成。

2、根据权利要求1所述的一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置，其特征在于其中用于发酵检测及控制的具有检测及控制参数仪器仪表的传感系统包括1温度传感器；2pH传感器；3溶解氧传感器；4全罐秤量传感器；5尾气CO₂接口；6尾气O₂接口；7测速传感器；8压力传感器；9消泡传感器。

3、根据权利要求1所述的一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置，其特征在于其中所述的带安装支架的工艺管道系统包括22料瓶；24预热器；25全罐秤量支座；26取样用特殊支架；27罐体总成；28快速装拆机座；29电动机；30管架；31油水分离器；32减压阀；33过滤器；34流量计；35空气过滤器；36压力表；37冷却器；38管道视镜；39热水器；40无死体积取样阀。41消泡传感器接口；42尾气CO₂接口；43尾气O₂接口；44温度传感器；45pH传感接口；46DO传感器接口。

4、根据权利要求1所述的一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置，其特征在于其中所述的带有工控机及执行元器件的电气控制柜包括10热质量流量计；11高精度蠕动泵；12基质补料电子秤；13前体或油电子秤；14酸碱物电子秤；15循环泵；16电磁阀；17数/模转换器；18模/数转换器；19下位机；20上位机；21调制解调器；23稀土电机。

5、根据权利要求1所述的一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置，其特征在于其中所述的带有工控机及执行元器控制柜中的计算机软件是根据现场数据采集和操作的需求以及工艺优化的要求，进行在线参数采集、离线参数计算、参数数据记录以及部分参数的在线控制，通过局域网同步向上位机传送所有参数的数据，选用组态语言和C语言对上位机和下位机分别进行编程设计，并且在数据记录时使用了简单冗余技术。

6、根据权利要求1或2所述的一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置，其特征在于该装置传感系统具有温度、搅拌转速、通气流量、罐压、消泡、pH、溶解氧浓度、发酵液真实体积及重量、三个补料量如基质、前体、油、酸碱物的在线参数，并与尾气CO₂和O₂分析仪连接的接口的十四个以上参数检测及控制。

7、根据权利要求1所述的一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置，其特征在于该装置装有可全罐称重的电子称。

8、根据权利要求1所述的一种用于过程优化与数据放大的自控发酵装置，其特征在于该装置具有不同量程范围的补料电子秤。

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