CN102965272A - 发酵联动装置及发酵联动的实现方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵联动装置及利用该发酵联动装置进行发酵联动的实现方法，所述的发酵联动装置包括发酵母罐、发酵子罐、监控系统和分析系统，所述发酵母罐通过管道与所述发酵子罐相连，所述发酵母罐和发酵子罐分别与所述监控系统相连接，所述分析系统对所述监控系统测得的数据进行集中分析。通过本发明的一种发酵联动装置对发酵过程的优化可以缩短研发周期，降低优化的成本。

Description

发酵联动装置及发酵联动的实现方法

 

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，特别涉及一种发酵联动装置及发酵联动的实现方法。

背景技术

生物发酵过程是以有生命活力的细胞为主题，给予特定的培养环境条件来生产有价值的目的产物的过程，发酵工艺条件的优化研究对于指导生产过程的顺利有效开展起着非常重要的作用，现行的发酵工艺优化研究主要是在特定的发酵罐中通过分批发酵或连续发酵试验进行考察，或利用几个发酵罐同时进行分批实验考察，有的还对发酵罐装备了多参数采集系统，来进行发酵过程的优化研究。由于发酵过程中微生物生理代谢特性的复杂性和受环境影响的变异不确定性，使得进行发酵工艺条件优化时批次数据之间的可比较性较差，因此对过程的优化结论带来了较大的偏差或得到相反的结论，同时对于周期较长的抗生素发酵过程优化，整体优化所需的周期较长，不利于生产进度的推进和生产效益的快速提高。

为此，现有的方法是以不同发酵产品为对象形成了各种或通用的装置技术系统和应用方法，如中国专利“一种发酵过程优化与放大的方法与装置”（专利号：200810042759.0），其重点就是设计用于研究的装置系统，通过发酵过程各种传感器所获得的数据以及计算机软件包数据处理，把生物反应器中复杂的生物过程分解为不同尺度的特性研究，了解不同尺度的事件之间的关系，每个尺度都有不同的学科原理和变化规律，研究它们的量变到质变，以及由此形成的对复杂系统总体的影响，这样才有可能解决发酵过程优化所面临的局部与整体的关系，由此形成了一套基于参数相关分析的发酵过程多尺度问题研究的优化技术和发酵过程多参数调整的放大技术。总之，尽可能多的获得发酵过程各层面的生物信息，然后以多尺度参数相关原理，通过计算机软件的实时数据处理，在海量数据中找到以参数相关性特征为依据的过程优化关键参数，即敏感参数，进而用来指导发酵工艺操作，由此大大推动了发酵过程优化与放大技术的研究进展。

但是以上装置与方法只是从海量数据中找到过程优化依据的关键敏感参数，只是带有方向性的研究工作，真正做到用于实际生产还需要做大量实验工作，也就是说要在已取得的研究方向上进行细化研究，才能进一步取得优化的工艺操作条件或装备放大设计。

这些细化实验工作所遇到的最大困难是每批试验之间的可比性，试验时要求初始细胞生理状态一致性、反应器生长环境可比性、数据采集与分析比较的可信性。由于生命过程以及与外界环境之间关系的高度复杂关系，只要一个微小的变化就可能引起过程的差异，这个微小的变化有可能来自菌种的获得与种子培养、不同的培养基原材料来源、灭菌操作的差异、操作条件的细微差异、不同发酵设备特性的差异、甚至员工的操作习惯等，这些细微变化引起的结果表现在获得的发酵过程参数趋势曲线的多样性、时变性、相关耦合性与不确定性。因此，在如此复杂的多因素研究变化下，又是长达几十到上百小时的发酵操作实验，每批之间的数据可比性就成为大问题，为此，整个细化研究周期有时达数月或数年。即使如此，获得的结果还总是存在各种疑惑，影响了有关生产或工程设计问题的决策。

综上所述，现有技术中的发酵装置不能保证初始细胞生理状态的一致性、反应器生长环境的一致性，因此数据采集与分析可信性是不够的。另外，现有的发酵优化周期长，成本高。

发明内容

发酵过程是一个复杂的生命系统，其过程特征是包括生物信息在内的参数多样性、参数时变性、参数之间的相关耦合性、以及过程参数变化的不确定性。为适应上述特点的过程研究，达到过程优化与放大的目的，设计联动并行发酵培养装置，当对发酵母罐发酵过程一定的阶段的工艺控制条件进行优化时，将这个时刻的发酵培养液无菌转入到并行的发酵子罐中，通过子罐的测控系统把发酵子罐中微生物的初始生理状态调成与发酵母罐一致后，对发酵子罐进行不同考察因素或不同水平的控制，并对其生理代谢参数的变化进行实时采集，考察一定时间内发酵过程的代谢变化，得到该阶段的最优化控制工艺，从而指导发酵母罐的生产试验研究。

为了促进发酵过程实验研究更加快速、准确地优化不同阶段的发酵工艺条件，急需对不同阶段的培养过程进行优化调整试验，同时要保证在这个阶段的影响因素考察时初始的微生物生理状态具有一致性，且除待考察因素外，其他环境因素尽量保证一致性，这样才能保证所得数据的可对比性。

本发明的第一目的是为了解决现有技术中的问题，提供一种发酵联动装置，将发酵母罐中的发酵液在多个发酵子罐中进行优化，以实现其初始细胞生理状态的一致性，且除待考察因素外，其他环境因素尽量保证一致性，以实现所得的数据具有可比性，同时各发酵母罐、发酵子罐的各控制参数进行集中采集分析，从而保证了得到的有关菌体生理或操作参数数据具有可靠性。

本发明的第二目的是提供上述发酵联动装置的实现方法，以达到准确地优化发酵母罐不同培养阶段的发酵工艺条件。

为实现第一目的，本发明的技术方案是：

一种发酵联动装置，其特征是，包括发酵母罐、发酵子罐、监控系统和分析系统，所述发酵母罐通过管道与所述发酵子罐相连，所述发酵母罐和发酵子罐分别与所述监控系统相连接，所述分析系统对所述监控系统测得的数据进行分析。

进一步，所述发酵母罐为1至2个，所述发酵子罐为2至8个，优选4至8个，所述各发酵子罐并联并通过管道连接到发酵母罐上。

进一步，所述发酵子罐的容积为0.25L至50L，所述发酵母罐的容积为50L至500L。

进一步，所述发酵母罐的总容积为发酵子罐的总容积的2.5至50倍。

进一步，所述发酵子罐的容积为5L至50L，所述发酵母罐的容量为500L至120000L。

进一步，所述发酵母罐的总容积为发酵子罐的总容积的2.5至480倍。

进一步，所述每个发酵子罐的几何形状、容积和有关配件都相同。

进一步，每个发酵子罐和发酵母罐均配有电机、搅拌器、传感单元、安装支架、工艺管道系统以及电气控制柜，所述电气控制柜通过其内的计算机芯片及电气元器件对所述发酵子罐和发酵母罐进行控制。

进一步，所述的传感单元包括温度传感器、pH传感器、溶解氧传感器、全罐称量传感器、尾气分析仪、测速传感器、压力传感器、消泡传感器和补料称重传感器，还包括细胞显微在线观察仪、活菌量传感器、氧化还原电位ORP传感器、菌浓OD传感器及空气流量传感器中的一个或两个以上。

进一步，所述监控系统为三级计算机控制系统，其中第一级计算机控制系统对所述发酵母罐和发酵子罐形成的各参数的回路进行检测与控制；第二级计算机控制系统对所述发酵母罐和发酵子罐中的单个罐体的参数进行数据采集、设定值控制与控制回路整定；第三级计算机控制系统对前两级系统的参数进行参数综合分析并输出到终端。

为实现第二目的，本发明的技术方案是：

上述发酵联动装置的发酵联动的实现方法，其特征是包括如下步骤：

第一步：在所述发酵母罐中加入培养基、灭菌、接种和培养；

第二步：通过所述分析系统对监控系统从发酵母罐中获得的发酵过程多尺度参数进行相关分析；

第三步：根据分析系统的分析结果确定影响发酵过程的关键敏感参数；

第四步：将发酵母罐培养到预定阶段；

第五步：将发酵母罐中的培养液同体积输送到多个发酵子罐中；

第六步：根据发酵母罐确定的影响发酵过程的关键敏感参数，确定各子罐相应的控制参数，通过监控系统调节并控制各发酵子罐，并对各发酵子罐进行多参数采集；

第七步：通过分析系统对发酵子罐中采集到的多参数进行相关分析，指导发酵母罐生产试验。

进一步，所述第五步之前包括对各发酵子罐及发酵母罐与发酵子罐的连接管道进行灭菌的步骤。

进一步，所述第二步中的发酵过程检测参数为直接参数和间接参数；

其中所述的直接参数包括直接在线检测参数和离线手工检测参数；

其中所述的直接在线检测参数为温度、搅拌转速、通气流量、罐压、消泡、pH、溶解氧浓度、发酵液重量、补料量、尾气氧浓度、尾气二氧化碳浓度；

所述的离线手工检测参数为菌量、残糖浓度、比生长速率及NH₂-N含量；

所述的间接参数为耗氧率OUR、二氧化碳释放率CER、呼吸商RQ及体积氧传递速率K_La。

本发明的发酵联动装置可用于发酵过程时变操作条件研究（温度，rpm、通气、pH、DO、…）、发酵培养基配比与调整研究、发酵过程最佳补料系统与操作研究、菌丝形态与抗剪切研究、微量元素影响与调节、种龄、培养级数与种子质量研究、发酵设备特性研究、恒化特性与多级连续培养研究、菌体生理特性研究、基因工程比生长率与诱导因子研究、基因改造与生物学特性、生物过程转录、表达、调控技术与生物信息学研究、系统生物学或合成生物学底盘细胞生理特性研究，等等。

本发明的有益效果是：

通过与发酵母罐相连的多个并行的发酵子罐，可以保证各发酵子罐初始生理状态一致性；

通过对各个子罐中除待考察因素外，其他环境因素尽量保证一致性，这样才能保证所得数据的可对比性，从而保证了优化过程获得的数据的可信性；

多个发酵子罐可以同时对多个影响敏感参数的因素进行高可信的优化研究，从而缩短研发周期，降低优化的成本；

各个发酵子罐与发酵母罐采用集中控制及数据集中采集与统一综合分析，从而降低了每罐单独分析可能造成的人为或软件分析带来了误差，从而具有数据采集与分析比较的可信性。

综上所述，本发明的发酵联动装置克服了发酵过程复杂多因素研究变化以及几十到上百小时的批发酵操作实验所引起的数据可靠性问题，大大增加了实验可信性，缩短了长达数月或数年的过程优化研究周期。

附图说明

附图1为发酵联动装置示意图；

附图2为发酵联动实现方法的流程图；

附图3为发酵联动框图。

附图中的标记分别为：

1．发酵母罐；               2．发酵子罐；

3．搅拌器；                 4．接种之后的发酵液；

201-207．框图步骤。

具体实施方式

下面结合附图对本发明发酵联动装置及发酵联动的实现方法的具体实施方式作详细说明。

参见附图1，发酵母罐1与多个发酵子罐2通过管道进行连接，多个发酵子罐并联连接后与发酵母罐1相连，形成发酵联动装置，各个发酵子罐2与发酵母罐1之间设置阀门等管件来控制发酵子罐2与发酵母罐1之间的连通，并可以对培养液从发酵母罐1输送至发酵子罐2的过程进行控制，保证发酵子罐2中的接种后的发酵液4和发酵母罐1中的发酵液相同，且各子罐间发酵液的量相同，即保证了各个发酵子罐中的菌体的初始生理状态的一致性。发酵联动装置还包括监控系统和分析系统，发酵母罐1和发酵子罐2分别与监控系统相连接，分析系统对监控系统测得的数据进行分析。多个发酵子罐2的数量为4至8个，发酵母罐一般为一个，也可设置两个连接在一起。每个发酵子罐2的容积为2L至50L，每个发酵母罐的容积为50L至500L，优选发酵母罐1的总容积为发酵子罐2总容积的1至4倍。为了保证每个发酵子罐2的除待考察环境参数一致性，每个发酵子罐2的几何形状、容积和有关配件（图中只示出了搅拌器3）都相同。发酵母罐1和发酵子罐2均配有相关配件包括电机、搅拌器3、传感单元、安装支架、工艺管道系统以及电气控制柜，电气控制柜通过其内的计算机芯片及电气元器件对发酵子罐和发酵母罐进行控制。其中传感单元包括温度传感器、pH传感器、溶解氧传感器、全罐称量传感器、尾气分析仪接口、测速传感器、压力传感器、消泡传感器、补料称重传感器、细胞显微在线观察仪、活菌量传感器、氧化还原电位ORP传感器、菌浓OD传感器、空气流量传感器。电子监控系统包括三级计算机控制系统，其中第一级系统对单回路参数如温度、转速、通气量、pH、DO、补料称重、罐体称重等进行检测与控制；第二级系统对各个单罐参数如温度，搅拌转速，通气流量，罐压，消泡，pH，溶解氧浓度，发酵液重量，补料量设定值控制，包括实施数据显示、电极自动标定、回路整定等参数进行检测与控制；第三级系统对各个罐的状态参数集中进行显示和控制。数据分析系统即为可视化综合数据分析与过程研究用软件包（沪DGY-2007-0798），可以在多终端显示，并根据研究需要可在不同终端显示不同画面。

参见附图2，发酵联运的实现方法包括步骤如下：第一步：在所述发酵母罐中加入培养基、灭菌、接种和培养（图中第201步）；

第二步：通过所述分析系统对监控系统从发酵母罐中获得的发酵过程多尺度参数进行相关分析（图中第202步）；

第三步：根据分析系统的分析结果确定影响发酵过程的关键敏感参数（图中第203步）；

第四步：将发酵母罐培养到预定阶段（图中第204步）；

第五步：将发酵母罐中的培养液同体积输送到多个发酵子罐中（图中第205步）；

第六步：根据发酵母罐确定的影响发酵过程的关键敏感参数，确定各子罐相应的控制参数，通过监控系统调节并控制各发酵子罐，并对各发酵子罐进行多参数采集（图中第206步）；

第七步：通过分析系统对发酵子罐中采集到的多参数进行相关分析，指导发酵母罐生产试验（图中第207步）。

在第二步中的发酵过程多尺度参数包括直接参数和间接参数；

其中所述的直接参数包括直接在线检测参数和离线手工检测参数；

所述的直接在线检测参数为温度、搅拌转速、通气流量、罐压、消泡、pH、溶解氧浓度、发酵液重量、补料量、尾气氧浓度、尾气二氧化碳浓度；

所述的离线手工检测参数为菌量、残糖浓度、比生长速率及NH₂-N含量；

所述的间接参数为耗氧率、二氧化碳释放率、呼吸商及体积氧传递速率。

参见附图3，联动实验过程是，发酵母罐进行灭菌处理后，在发酵母罐中配制培养基并灭菌后接种，经前期发酵获得影响发酵过程的关键敏感参数后移种至已经消过毒的多个发酵子罐中，从而保证了发酵子罐中初始的菌体生理状态的一致性，调节各发酵子罐的操作参数，对发酵子罐进行除待考察因素外，其他环境因素尽量保证一致性的培养，根据影响发酵过程的关键敏感参数的不同条件对各个发酵子罐进行优化培养研究，培养后获得菌体的宏观代谢曲线，用于指导发酵母罐生产试验研究。

实施例1：

4个并行的5L发酵子罐、还包括1个50L发酵母罐和电子监测控制系统与数据分析系统，发酵母罐通过管道与发酵子罐的各罐相连，用以实现从母罐内将发酵液输送到各个子罐中，发酵子罐的各发酵罐和发酵母罐的发酵罐都能够实现发酵过程中pH、DO、体积、尾碳浓度、尾氧浓度、摄氧率（OUR）、二氧化碳释放速率（CER）、呼吸商（RQ）、活细胞浓度等参数的在线采集与对比分析。

利用本发明对荚膜红单胞菌（Rhodopseudomonas capsulatus）辅酶Q10生产过程的中试研究；

菌种： 荚膜红单胞菌（选用浙江新和成生物医药公司的菌种）。

具体步骤为：

（1）菌种传代：培养基为2%的酵母膏培养基，培养基温度为30℃，培养时间为72小时，至长出深蓝色菌落；

（2）菌种扩大培养：将步骤（1）的菌种接入已灭菌的种子罐，进行两级培养，在无光照的条件下，控制温度为28～30℃，搅拌100～300rpm，压力为0.02～0.05Mpa，培养20～24小时；

（3）发酵补料培养：在无菌条件下，将步骤（2）培养出的种子液接入发酵罐，在无光照的条件下，控制发酵温度28～32℃，搅拌100～300rpm，压力0.02～0.05Mpa，培养时间100～120小时，在发酵过程进行葡萄糖溶液（含0.15%的磷酸二氢钾溶液）连续补加维持糖浓度0.7%、pH用氨水控制在6.7，发酵培养108h；

其中步骤（2）中种子罐的培养基配方，按质量百分比计为：硫酸铵0.10～0.50%、硫酸镁0.10～0.50%、磷酸二氢钾0.02～0.10%、葡萄糖0.30～1.00%、玉米浆粉0.02～0.10%、碳酸钙0.35～0.90%、维生素B1 0.001～0.01%，余量为水，pH值6.8，培养基灭菌温度为118～121℃，时间为30分钟；

其中步骤（3）中发酵罐的培养基配方，按质量比计为：葡萄糖2.50～4.50%、玉米浆粉0.80～1.30%、硫酸铵0.10～0.50%、磷酸二氢钾0.05～0.30%、硫酸镁0.50～2.00%，余量为水，pH值6.8，培养基灭菌温度为118～121℃，时间为30分钟。

通过50L发酵母罐进行发酵实验，通过参数相关性分析发现影响发酵过程的敏感参数为过程的氧消耗速率(OUR)，氧限制是影响发酵过程产物合成代谢和菌体生长代谢的关键。而氧消耗速率受到氧传递速率的控制；因此将处于合成期的培养液在4个并行的发酵子罐上进行不同氧传递速率控制实验考察，当培养周期为38h时，将发酵培养液通过无菌管道转移到4个联动并行的5L发酵子罐培养系统中（2.5L/子罐），发酵子罐调整一致的转速和总通气量，通过调整子罐中空气和纯氧的比例，将4个发酵子罐控制在不同的OUR水平（75mmol/L/h, 65mmol/L/h, 55mmol/L/h, 45mmol/L/h）,培养10小时后考察考察荚膜红单胞菌从生长期转向合成期是最佳的氧消耗速率控制。

实验结果显示，发酵子罐能够很好的进行氧消耗速率OUR等的采集和控制，OUR的控制误差小于4.5%，对比试验测试结果表明，在该阶段将OUR控制在55mmol/L/h的水平对促进菌体生长和产物合成最有利，而且转化率明显高于其他控制水平，其结果如下表所示：

最终结果再用于指导50L发酵母罐的生产，在辅酶Q10的发酵过程中，当菌体浓度（在线活细胞）转入稳定期时，通过搅拌将OUR控制在55±2mmol/L/h，放罐点104小时，产物浓度达到2780±45mg/ml，其产量比对照（2463±59mg/ml）提高了12.9%。

采用本发明技术方案，充分缩短了分批考察多个OUR控制水平所需的时间，同时保证了考察的菌体初始生理状态一致性和实验结果的可对比性，提高了实验效率。

实施例2：

采用8个并行的5L发酵子罐、1个500L发酵母罐组成的实验装置，利用该组合可以考察发酵过程中特定阶段剪切应力和关键因素环境温度的变化对发酵代谢的影响。

本实施例对利福霉素发酵过程的优化研究，生产菌株为：地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)，其实验步骤如下：

(1)斜面培养基(％)：蔗糖 3.0，蛋白胨0.5，KCl 0.05，FeSO₄ 0.001，KH₂PO₄ 0.1，MgSO₄·7H₂O 0.05，琼脂1.8，pH7.0，余量为水。将种子划线接种到装有斜面培养基的平板中，28℃，培养时间为48小时，相对湿度30--60％，培养周期12～15d。

 (2)种子培养基(％)：葡萄糖2.0，豆饼粉1.0，蛋白胨1.0，KH₂PO₄ 0.01，KNO₃ 0.05，余量为水。培养温度28℃，培养时间48h。

将步骤（2）的菌种接入已灭菌的种子罐，进行两级培养，控制温度为28～30℃，搅拌250～400rpm，压力为0.02～0.05Mpa，培养20～24小时；

(3)发酵培养基(％)： 葡萄糖 11.0，鱼粉 0.5，豆饼粉1.0，KNO₃ 0.8，KH₂PO₄ 0.02，CaCO₃ 0.5，氯化钴 3μg/ml，余量为水。发酵补料培养：在无菌条件下，将步骤（2）培养出的种子液接入发酵母罐，在无光照的条件下，控制发酵温度28～32℃，压力0.02～0.05Mpa，培养时间100～120小时，在发酵过程进行葡萄糖溶液（含0.15%的磷酸二氢钾溶液）连续补加维持糖浓度0.7%、pH用氨水控制在6.7，发酵培养108h；

（4） 联动并行实验装备，从分装后开始计时，培养一定周期的时间后，放罐进行过程参数的分析。

通过发酵子罐进行多参数采集，同时能更好地实现从过程动态的角度优化关键因素的调控工艺。

各发酵子罐在不同剪切力（转速400、500、600、700rpm）的情况下，随着剪切力的增加，地中海拟分枝杆菌发酵液中菌球的直径迅速变小，当转速高于600rpm时，菌体成散落的丝网状菌丝存在，尽管溶解氧浓度都在临界氧浓度35%以上，但产物的合成速率显著下降，在500rpm的剪切力下的菌体形态产物合成速率最快。

同时温度也是利福霉素发酵过程中一个关键的影响因素，温度直接影响著菌体胞内代谢活力及对氧的摄取速率，各发酵子罐分别控制26、27、28、29℃，可以看出随着培养温度的升高氧消耗速率也随之升高当温度控制在28℃时，氧的消耗速率在14.5mmol/L/h，产物的合成速率最快为125mg/L/h。可见利用8联并行发酵罐系统进行发酵过程中所得关键影响因子最佳控制水平的优化，对于缩短研发时间和科研工作效率起着非常重要的作用。

实施例3：

4个2L发酵子罐、1个50L发酵母罐组成的实验装置，利用该组合可以考察乳酸、乙醇、己酸等微耗氧和厌氧发酵过程不同阶段的pH值控制策略优化。将50L或更大的生产罐培养到特定阶段的培养液无菌转接到无菌的2L发酵子罐中，通过调整进气中空气和氮气的比例，并结合采集到的每个发酵子罐和发酵母罐的发酵过程参数信息，控制每个发酵子罐中的菌体状态与发酵母罐相一致，然后改变子罐中不同的pH控制水平，培养一段时间后，进行多参数相关分析，得到在该阶段最优的pH控制策略，用于指导发酵母罐的生产。

实施例4：

采用5个50L发酵子罐、1个120吨(体积为120000L)发酵母罐联动并行发酵试验，进行葡萄糖酸工业发酵过程优化研究，利用该组合可以考察发酵过程中维持不同糖浓度对过程氧传递和发酵代谢的影响研究。

培养条件：黑曲霉（上海工业微生物研究所黑曲霉M276）。

培养基：

(1)斜面培养基，按每升计算，葡萄糖8g、酵母膏2g、蛋白胨2g、 MgSO₄ 0.2 g、 NaH₂PO₄ 0.19g 、KH₂PO₄ O.1g、 MnSO₄ O.01g、琼脂 1.5g，余量为水。  将保藏管中的菌种接种于斜面培养基上，在培养箱中培养，28℃，培养3天。

(2)种子培养基，按每升计算，葡萄糖609g、MgSO₄ 0．029g、NaH₂P0₄0.19g、KH₂P0₄ 0.1g、MnS0₄ 0.01g，余量为水。

在无菌操作台上用接种环刮下菌体接种于15L摇瓶中，培养24h，转速420rpm，30℃。采用两级发酵过程控制。

(3)基础发酵液,按每升计算，葡萄糖100g、MgSO₄ 0.03g、KH₂PO₄ 0.2g、(NH₄)₂HPO₄ 0.9g、MnSO₄ 0.06g、CaCO₃ 2.69g (单独灭菌)，余量为水。

将步骤（2）中的种子液按10%的接种量到装有85吨发酵培养基生产罐中，32℃、控制OUR在158的水平，培养32小时。

将120吨发酵母罐培养到8小时（菌体生长进入稳定期，产物开始快速合成）的发酵液分别无菌转接30升到无菌的50升发酵子罐中，通过与发酵母罐生理代谢曲线的对比，调整50L发酵子罐中的控制条件，使得达到与发酵母罐一致的代谢状态，然后通过改变补料糖液的补加速率，使发酵子罐中的糖浓度控制在不同的浓度水平，分别为1±0.4%、3±0.6%、7±0.6%、9±0.8%、14±0.9%并控制每个发酵子罐具有相同的温度、转速、通气量和搅拌形式等条件，观察底物浓度对氧传递和菌体代谢的影响。

结果表明，初始生理代谢状态一致的发酵液，在相同的控制条件下，底物葡萄糖浓度的变化对发酵过程氧传递速率影响非常显著，当葡萄糖浓度降到6%以下时，能明显促进培养液中氧传递的效果，溶氧随着葡萄糖浓度降低呈略微上升趋势，从而带来菌体的氧消耗速率OUR大幅度上升。当葡萄糖浓度控制在1±0.4%时OUR明显较高，糖消耗速率较快，葡糖糖酸的合成速率达到了22.4g/L/h，当葡萄糖浓度控制在3±0.6%、7±0.6%、9±0.8%和14±0.9%时的合成速率分别为15.4 g/L/h、12.2 g/L/h、9.6 g/L/h和9.4 g/L/h，可见当葡萄糖浓度高于9%时氧传递效果明显较差，而且不再随葡萄糖的浓度变化而变化。因此在葡糖糖酸的发酵生产中，控制合适的葡萄糖补加策略对提高产率和节能降成本方面非常关键。

实施例5

    采用4个250mL发酵子罐、1个50L发酵母罐联动并行发酵试验，进行维生素B12发酵过程优化研究，利用该组合可以考察发酵过程中维持供氧水平对发酵代谢的影响研究。

（1）生产菌：脱氮假单胞菌（石家庄制药集团华荣公司AL-0125）。

（2） 种子培养基(g/L): 蔗糖 40，玉米浆 20，甜菜碱 5，(NH₄)₂SO₄ 1，(NH₄)₂HPO₄ 2，MnSO₄·H₂O 0.8，CoCl·6H₂O 0.02，MgO 0.3，DMBI 0.01，ZnSO₄·7H₂O 0.01,pH 7.2-7.4；

（3）发酵培养基(g/L): 蔗糖 80，玉米浆 45，甜菜碱 14，(NH₄)₂SO₄ 1，KH₂PO₄  0.75，CoCl·6H₂O 0.075，MgO 0.5，DMBI 0.05，ZnSO₄·7H₂O 0.08,CaCO₃ 1，pH 7.2-7.4；

补料培养基1(g/L): 葡萄糖 500，DMBI 0.15， CoCl·6H₂O 0.15，pH自然；

补料培养基2(g/L): 甜菜碱 30，DMBI 0.4，CoCl·6H₂O 0.3，pH6.2-6.5。

（4）菌悬液制备: 用无菌水洗涤培养好的斜面，制成菌浓为10⁸个细胞每毫升的菌悬液。

（5）母瓶种子培养: 将制好的菌悬液接种2ml到母瓶培养基中，装量100ml/500ml，32℃，转速260rpm，培养20-22小时。

（6）50L发酵母罐培养: 将培养好后镜检无菌的母瓶种子液1250ml并瓶到无菌的2L三角瓶中，火焰保护接种到装有25L培养基的50L发酵母罐中，培养条件为二级搅拌浆，32℃，通气量20L/min，发酵过程中根据菌体生长情况开始连续补加葡萄糖和甜菜碱料液培养基。

将50L发酵母罐培养到110小时（菌体处于产物快速合成期）的发酵液分别无菌转接150ml到无菌的250mL发酵子罐中，通过在线采集参数的对比，通过转速调节，控制四个平行的发酵子罐处于不同的OUR水平（因为脱氮假单胞菌对氧的高亲和力，培养中后期，溶氧浓度一直为0的最低水平，因此OUR的高低就反映了不同的供养水平的高低），并使得其中2号发酵子罐的OUR水平与50L发酵母罐一致，控制在33±0.8mmol/L/h，其它三个分别控制在15±0.7mmol/L/h、24±0.9mmol/L/h和41±1.1mmol/L/h，并控制每个发酵子罐具有相同的温度、通气量和搅拌形式等条件，观察不同供氧水平对菌体代谢的影响。

结果表明，初始生理代谢状态一致的发酵液，不同的供氧水平对发酵代谢变化影响非常显著，在维持氧消耗速率水平在控制在33±0.8mmol/L/h的50L发酵母罐和4个250mL的发酵子罐组成的联动发酵罐中，底物葡萄糖的消耗速率、产物的合成速率、产物对葡萄糖的转化率都非常一致。在4台控制不同供氧水平的并行4台250ml的发酵子罐中的考察结果显示，当供氧水平调节以维持OUR水平为24±0.9mmol/L/h时，维生素B12的合成速率、转化率为最高，而维持OUR水平为15±0.7mmol/L/h情况下糖耗速率明显降低，产物合成速率比24±0.9mmol/L/h时低了29%。随着供氧水平的继续增加，糖的消耗速率显著增加，但维生素B12的合成速率和转化率呈现明显下降的趋势。

不同供氧水平对发酵过程参数的影响

*μ, 对数期的比生长速率；P,合成速率mg/L/h；Y_x/s，菌体量对底物的得率系数;Y_P/s，产物对底物葡萄糖的得率系数; RQ，呼吸熵。

因此在脱氮假单胞菌的维生素发酵过程中，控制合适的供氧水平调控对提高产率和降成本非常关键。该联动发酵实验的实施保证了考察的子反应器和母反应器联动的准确性、以及子反应器之间初始菌体状态的一致性和最终试验结果的可比性。

以上所述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 

Claims (14)

1.一种发酵联动装置，其特征在于：包括发酵母罐、发酵子罐、监控系统和分析系统，所述发酵母罐通过管道与所述发酵子罐相连，所述发酵母罐和发酵子罐分别与所述监控系统相连接，所述分析系统对所述监控系统测得的数据进行集中分析。

2.根据权利要求1所述的发酵联动装置，其特征在于：所述发酵母罐为1至2个，所述发酵子罐为4至8个，所述发酵子罐通过管道并联连接到发酵母罐上。

3.根据权利要求2所述的发酵联动装置，其特征在于：所述发酵子罐的容积为0.25L至5L，所述发酵母罐的容积为50L至500L。

4.根据权利要求3所述的发酵联动装置，其特征在于：所述发酵母罐的总容积为发酵子罐的总容积的2.5至50倍。

5.根据权利要求2所述的发酵联动装置，其特征在于：所述发酵子罐的容积为5L至50L，所述发酵母罐的容量为500L至120000L。

6.根据权利要求5所述的发酵联动装置，其特征在于：所述发酵母罐的总容积为发酵子罐的总容积的2.5至480倍。

7.根据权利要求2所述的发酵联动装置，其特征在于：所述每个发酵子罐的几何形状、容积和有关配件都相同。

8.根据权利要求2所述的发酵联动装置，其特征在于：每个发酵子罐和发酵母罐均配有电机、搅拌器、传感单元、安装支架、工艺管道系统以及电气控制柜，所述电气控制柜通过其内的计算机芯片及电气元器件对所述发酵子罐和发酵母罐进行控制。

9.根据权利要求8所述的发酵联动装置，其特征在于：所述的传感单元包括温度传感器、pH传感器、溶解氧传感器、全罐称量传感器、尾气分析仪、测速传感器、压力传感器、消泡传感器和补料称重传感器。

10.权利要求9所述的发酵联动装置，其特征在于：所述的传感单元还包括细胞显微在线观察仪、活菌量传感器、氧化还原电位传感器、菌浓传感器及空气流量传感器中的一个或两个以上。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的发酵联动装置，其特征在于：所述监控系统为三级计算机控制系统，其中第一级计算机控制系统对所述发酵母罐和发酵子罐形成的各参数的回路进行检测与控制；第二级计算机控制系统对所述发酵母罐和发酵子罐中的单个罐体的参数进行数据采集、设定值控制与控制回路整定；第三级计算机控制系统对前两级系统的参数进行参数综合分析并输出到终端。

12.利用如权利要求1至11中任一项发酵联动装置进行发酵联动的实现方法，其特征在于：包括如下步骤：

第一步：在所述发酵母罐中加入培养基、灭菌、接种和培养；

第二步：通过所述分析系统对监控系统从发酵母罐中获得的发酵过程多尺度参数进行相关分析；

第三步：根据分析系统的分析结果确定影响发酵过程的关键敏感参数；

第四步：将发酵母罐培养到预定阶段；

第五步：将发酵母罐中的培养液同体积输送到多个发酵子罐中；

第六步：根据发酵母罐确定的影响发酵过程的关键敏感参数，确定各子罐相应的控制参数，通过监控系统调节并控制各发酵子罐，并对各发酵子罐进行多参数采集；

第七步：通过分析系统对发酵子罐中采集到的多参数进行相关分析，指导发酵母罐生产试验。

13.根据权利要求12所述的发酵联动的实现方法，其特征在于：所述第五步之前包括对各发酵子罐及发酵母罐与发酵子罐的连接管道进行灭菌的步骤。

14.根据权利要求12所述的发酵联动的实现方法，其特征在于：所述第二步中的发酵过程多尺度参数包括直接参数和间接参数；

其中所述的直接参数包括直接在线检测参数和离线手工检测参数；

所述的直接在线检测参数为温度、搅拌转速、通气流量、罐压、消泡、pH、溶解氧浓度、发酵液重量、补料量、尾气氧浓度及尾气二氧化碳浓度；

所述的离线手工检测参数为菌量、残糖浓度、比生长速率及NH2-N含量；

所述的间接参数为耗氧率、二氧化碳释放率、呼吸商及体积氧传递速率。

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