CN102519913B - 偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,该装置包括直角棱镜(1)、一面镀有反射膜的基片(2)、恒温流通池(3)、第一光路机构(4)、注射泵(5)、第二光路机构(6)、第一锁相放大器(7)、处理系统(8)和第二锁相放大器(9)。所述装置能够实现对具有各向异性的生物样品之间的反应进行高灵敏定量和/或定性表面等离子信号检测的同时进行荧光成像观察;所述装置能够同时检测具有各向异性的生物样品的P偏振光特性和S偏振光特性;通过所述调角机构的调节能够使所述第一光路机构的入射光和/或出射光与所述反射膜之间的夹角在0-90度之间连续变化,操作简便;所述装置能够检测的折射率变化高达2×10-5,检测灵敏度高达10-11g/ml,图像分辨率高达2μm。
Description
技术领域
本发明涉及检测生物分子反应的装置技术领域,特别涉及一种能够检测生物分子各向异性的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置。
背景技术
研究人员在许多生物有机系统和化学材料中发现了高度有序的分子组装体,如染色体、细胞壁、细胞质、蛋白质链和超分子自组装等,然而对这些高度有序的分子组装体的组织结构和生理功能一直不是很清楚。偏振光谱测量能够提供包含各向异性分子组装体的复杂体系的重要信息,并且可以通过Mueller矩阵来阐述光与分子组装体之间的相互作用信息,不同偏振态差分光谱携带了双极性吸收中各向异性的分布信息。
目前,对各向异性分子组装体的研究主要依赖于偏振光谱技术。近年来发展起来的偏振显微技术主要应用于晶体拓扑、材料科学和生物科学。差分光谱技术可以提高显微系统的分辨率,通过差分偏振显微技术能够实现对各向异性有机分子的成像。一些研究人员已经通过在激光共聚焦显微镜系统基础上加入差分可调偏振设备及相应的差分设备,通过高频调制和锁相放大检测达到对各向异性分子的高分辨率成像。也有研究人员在表面等离子共振系统中加入光弹调制和锁相放大元件获得高分辨率的各向异性材料的表面等离子共振数据。
上述两种系统都无法通过荧光图像定量区分复杂有机分子体系、生物组织和细胞内的各向异性结构的分布。分子的各向异性特性可以通过光与分子之间相互作用时光的偏振态的改变体现出来。这方面的检测一直依赖于偏振光谱技术,无法实现直观成像。目前,非常需要一种新的检测系统,以实现对极性荧光与分子之间相互作用共聚焦成像的同时得到精确的定量信息,为深层次了解生物复杂体系的分子结构和生物功能提供更有力的工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置。
本发明提供的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置包括直角棱镜、一面镀有反射膜的基片、恒温流通池、第一光路机构、注射泵、第二光路机构、第一锁相放大器、处理系统和第二锁相放大器;
所述第一光路机构包括第一激光器、光束整形镜组、第一光弹调制器、斩波器、聚焦透镜、第一偏振分析器和第一探测器;所述第一激光器、所述光束整形镜组、所述第一光弹调制器和所述斩波器依次设置在沿入射光的光路上;所述聚焦透镜、所述第一偏振分析器和所述第一探测器依次设置在沿出射光的光路上;
所述第二光路机构包括第二激光器、第二光弹调制器、第一孔径光阑、分色反射镜、XY扫描镜、倒置激光扫描共聚焦显微镜、第三光弹调制器、第二孔径光阑、第二偏振分析器、第二探测器和控制器;所述第二激光器、所述第二光弹调制器、所述第一孔径光阑和所述分色反射镜依次设置在沿激发光的光路上;所述倒置激光扫描共聚焦显微镜、所述XY扫描镜、所述分色反射镜、所述第三光弹调制器、所述第二孔径光阑、所述第二偏振分析器和所述第二探测器依次设置在沿荧光的光路上;所述控制器分别与所述第二光弹调制器和所述第三光弹调制器电连接;
所述恒温流通池上端开口,所述基片设置在所述恒温流通池上使得所述恒温流通池上端封闭,所述基片镀有反射膜的一面朝向所述恒温流通池内;
所述棱镜设置在所述基片上,所述棱镜与所述基片之间有折射率匹配液;
所述恒温流通池的进液口和出液口通过管路分别与所述注射泵的出液口和进液口连接;
所述恒温流通池置于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜的载物台位置;
所述第一探测器依次与所述第一锁相放大器和所述处理系统电连接,所述处理系统分别与所述注射泵、所述倒置激光扫描共聚焦显微镜和所述第二锁相放大器电连接,所述第二锁相放大器分别与所述第二探测器和所述控制器电连接。
优选地,所述装置还包括三维调节机构,用于调节所述恒温流通池及置于其上的所述基片和所述棱镜的空间三维位置,以使得所述基片表面的所述反射 膜位于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜的焦平面处。
优选地,所述装置还包括调角机构,用于调节所述第一光路机构的入射光和/或出射光的光路方向。
优选地,通过所述调角机构的调节能够使所述第一光路机构的入射光和/或出射光与所述反射膜之间的夹角在0-90度之间连续变化。
优选地,所述第一锁相放大器和所述第二锁相放大器分别用于将来自所述第一探测器和所述第二探测器的光信号转换成电信号并将转换后的电信号发送到所述处理系统。
优选地,所述倒置激光扫描共聚焦显微镜用于对生物样品的反应过程进行成像并将其发送到所述处理系统。
优选地,所述处理系统包括带有BNC适配器的数据采集卡和数据处理装置,所述数据采集卡与所述数据处理装置电连接。
优选地,所述BNC适配器用于接受来自所述第一锁相放大器和所述第二锁相放大器的电信号,所述数据采集卡用于采集所述BNC适配器输出的数据,所述数据处理装置用于对来自所述数据采集卡的数据进行存储、分析和处理。
优选地,所述恒温流通池的侧壁和底面采用石英玻璃材质;所述恒温流通池的进液口和出液口采用聚四氟乙烯材质的密封圈密封。
优选地,所述棱镜和所述基片的材质相同。
优选地,所述基片表面的所述反射膜包括金膜、银膜、Au(45nm)/[TiO2(20nm)/ITO(20nm)]4/Au(20nm)复合膜、Au(25nm)/[TiO2(20nm)/SiO2(20nm)]2/Au(30nm)复合膜、金纳米阵列结构、Au(45nm)/[TiO2(20nm)/ITO(20nm)]4/Au(20nm)纳米阵列结构或Au(25nm)/[TiO2(20nm)/SiO2(20nm)]2/Au(30nm)纳米阵列结构。
优选地,所述第一激光器是波长为632.8nm的He-Ne激光器;所述第二激光器是波长分别为488nm、514nm和457nm的多线氩离子激光器。
本发明具有如下有益效果:
(1)所述装置能够实现对具有各向异性的生物样品之间的反应进行高灵敏定量和/或定性表面等离子信号检测的同时进行荧光成像观察;
(2)所述装置能够同时检测具有各向异性的生物样品的P偏振光特性和S偏振光特性;
(3)通过所述调角机构的调节能够使所述第一光路机构的入射光和/或出射光与所述反射膜之间的夹角在0-90度之间连续变化,操作简便;
(4)所述装置能够检测的折射率变化高达2×10-5,检测灵敏度高达10-11g/ml,图像分辨率高达2μm。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置的示意图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的发明内容作进一步的描述。
实施例1
如图1所示,本实施例提供的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置包括直角棱镜1、一面镀有反射膜的基片2、恒温流通池3、第一光路机构4、注射泵5、第二光路机构6、第一锁相放大器7、处理系统8和第二锁相放大器9、三维调节机构(图中未示出)和调角机构(图中未示出)。
所述第一光路机构4包括第一激光器401、光束整形镜组402、第一光弹调制器403、斩波器404、聚焦透镜405、第一偏振分析器406、第一探测器407和两个机械臂(图中未示出);其中,在一机械臂上沿入射光的光路方向依次设置有所述第一激光器401、所述光束整形镜组402、所述第一光弹调制器403和所述斩波器404,在另一机械臂上沿出射光的光路方向依次设置有所述聚焦透镜405、所述第一偏振分析器406和所述第一探测器407。
所述第二光路机构6包括第二激光器601、第二光弹调制器602、第一孔径光阑603、分色反射镜604、XY扫描镜605、倒置激光扫描共聚焦显微镜606、第三光弹调制器607、第二孔径光阑608、第二偏振分析器609、第二探测器610和控制器611。所述第二激光器601、所述第二光弹调制器602、所述第一孔径光阑603和所述分色反射镜604依次设置在沿激发光的光路上;所述倒置激光扫描共聚焦显微镜606、所述XY扫描镜605、所述分色反射镜604、所述第三光弹调制器607、所述第二孔径光阑608、所述第二偏振分析器609和所述第二探测器610依次设置在沿荧光的光路上;所述控制器611分别与所述第 二光弹调制器602和所述第三光弹调制器607电连接。
所述恒温流通池3上端开口,所述基片2设置在所述恒温流通池3上使得所述恒温流通池3上端封闭,所述基片2镀有反射膜的一面朝向所述恒温流通池3内。所述棱镜1设置在所述基片2上。所述棱镜1与所述基片2之间有折射率匹配液,用于使所述棱镜1和所述基片2的折射率匹配。在本实施例中,所述恒温流通池3的外部尺寸例如为30mm×25mm×1.17mm;所述恒温流通池3的内部例如为中空的圆柱形,其尺寸例如为Φ17×1mm;所述恒温流通池3的侧壁和底面采用例如石英玻璃材质,且侧壁和底面的厚度例如分别为1mm和0.17mm;所述恒温流通池3的进液口和出液口采用例如聚四氟乙烯材质的密封圈密封;所述恒温流通池3中的温度范围例如为30-60℃,其温度精度例如为±0.1℃。所述直角棱镜1和所述基片2的材质相同。在本实施例中,所述直角棱镜1和所述基片2均采用例如LaSFN9玻璃材质;所述直角棱镜1的尺寸例如为20mm×20mm×28mm;所述基片2的尺寸例如为30mm×25mm×1mm;所述基片2的一面镀有例如48nm厚的金膜;所述直角棱镜1与所述基片2之间的折射率匹配液的折射率例如为1.70。
所述恒温流通池3的进液口和出液口通过管路分别与所述注射泵5的出液口和进液口连接。所述注射泵5用于使恒温流通池3中的液体循环流通。在本实施例中,所述注射泵5采用例如带有控制器的注射泵,其容量例如为10μL~140ML,其流速例如为0.001μl/hr~147ml/min。
所述恒温流通池3置于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜606的载物台位置。在本实施例中,所述倒置激光扫描共聚焦显微镜606采用例如40倍物镜,其分辨率例如为2μm,所述倒置激光扫描共聚焦显微镜606的焦平面在竖直方向的可调距离例如为2.7-3.7mm。所述三维调节机构用于调节所述恒温流通池3及置于其上的所述基片2和所述棱镜1的空间三维位置,以使得所述基片2表面的所述金膜位于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜606的焦平面处。在本实施例中,所述三维调节机构为手动三维调节机构,其调节精度可达0.1μm。
所述第一激光器401发出的入射光经所述光束整形镜组402准直成准平行光后入射到所述第一光弹调制器403中,所述第一光弹调制器403用于使入射光以一定频率在P偏振光与S偏振光之间作周期性的转换,透过所述第一光弹调制器403的P偏振光或S偏振光经所述斩波器404后以入射角等于全反射角的方式入射到所述棱镜1和所述基片2中并被所述基片2表面的所述金膜反射 后出射;所述出射光经所述聚焦透镜404聚焦后入射到所述第一偏振分析器406中,所述第一偏振分析器406用于将检测不需要的偏振光信号过滤掉并让检测需要的偏振光信号透过,透过所述第一偏振分析器406出射的偏振光信号被所述第一探测器407接受。所述第一探测器407与所述第一锁相放大器7电连接,所述第一探测器407将接受到的光信号发送到所述第一锁相放大器7。在本实施例中,所述第一激光器401的功率例如为15mW,其波长例如为632.8nm;所述光束整形镜组402包括沿入射光的光路方向依次设置的连续变倍扩束镜头和准直镜筒;所述连续变倍扩束镜头的适用波长范围例如为400~800nm,其扩束比例如为5-6倍;所述准直镜筒的镜筒总长度例如为134mm;所述光束整形镜组402的入射光斑和出射光斑的直径例如分别为4mm和24mm。在本实施例中,所述第一探测器407采用例如硅光电二极管。
所述调角机构用于调节所述第一光路机构4的入射光和/或出射光的光路方向。通过所述调角机构的调节能够使所述第一光路机构4的入射光和/或出射光与所述金膜之间的夹角在0-90度之间连续变化。
所述第二激光器601发出的激发光入射到所述第二光弹调制器602中,所述第二光弹调制器602用于使激发光以一定频率在P偏振光与S偏振光之间作周期性的转换,透过所述第二光弹调制器602的P偏振光或S偏振光经所述第一孔径光阑603过滤掉杂散光后入射到所述分色反射镜604中。在本实施例中,所述第二激光器601采用例如波长分别为488nm、514nm和457nm的多线氩离子激光器。所述分色反射镜604采用仅能让长波长的光通过的分色反射镜。在本实施例中,所述分色反射镜604仅能让波长等于或大于400nm的光通过。激发光经所述分色反射镜604后传播方向改变90度入射到所述XY扫描镜605中,所述XY扫描镜605用于使所述装置在二维平面内的检测范围扩大。透过所述XY扫描镜605的激发光入射到所述倒置激光扫描共聚焦显微镜606中并被聚焦在位于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜606焦平面处的所述金膜上。所述金膜表面的生物分子样品中的荧光物质受到激发光的激发后发射出荧光,其中一部分荧光经所述倒置激光扫描共聚焦显微镜606收集后依次入射到所述XY扫描镜605和所述分色反射镜604中。经所述分色反射镜604过滤掉激发光后的荧光入射到所述第三光弹调制器607中,所述第三光弹调制器607用于 使荧光以一定频率在P偏振光与S偏振光之间作周期性的转换。透过所述第三光弹调制器607的P偏振光或S偏振光经所述第二孔径光阑608过滤掉杂散光后入射到所述第二偏振分析器609中,所述第二偏振分析器609用于将检测不需要的偏振光信号过滤掉并让检测需要的偏振光信号透过。透过所述第二偏振分析器609的偏振光信号被所述第二探测器610接受。在本实施例中,所述第二探测器610采用例如PMT(光电倍增管)阵列。所述第二探测器610将接受到的光信号转换成电信号后发送到所述第二锁相放大器9。所述第二光弹调制器602和所述第三光弹调制器607的调制频率相同。所述控制器611用于获取所述第二光弹调制器602和所述第三光弹调制器607的调制频率并将其作为参考频率发送到所述第二锁相放大器9。
所述第一锁相放大器7与所述处理系统8电连接,所述处理系统8分别与所述注射泵5、所述倒置激光扫描共聚焦显微镜606和所述第二锁相放大器9电连接,所述第二锁相放大器9分别与所述第二探测器610和所述控制器611电连接。所述第一锁相放大器7和所述第二锁相放大器9分别用于将来自所述第一探测器407和所述第二探测器610的光信号转换成电信号并将转换后的电信号发送到所述处理系统8。
所述处理系统8包括带有BNC(Bayonet Nut Connector)适配器的数据采集卡和数据处理装置,所述数据采集卡与所述数据处理装置电连接。在本实施例中,所述数据处理装置采用例如计算机。所述BNC适配器用于接受来自所述第一锁相放大器7和所述第二锁相放大器9的电信号,所述数据采集卡用于采集所述BNC适配器输出的数据,所述数据处理装置用于对来自所述数据采集卡的数据进行存储、分析和处理。
在本实施例中,所述金膜上有用化学方法修饰的抗免疫球蛋白Anti-IgG,所述恒温流通池3中流通有含有用荧光标记的具有各向异性的免疫球蛋白IgG抗体分子的水溶液,Anti-IgG与IgG抗体分子接触时发生反应,应用本实施例所述装置可以检测偏振调制的表面等离子共振信号,同时获得上述反应过程中的共聚焦荧光偏振图像。本实施例所述装置能够检测的折射率变化可达2×10-5,检测灵敏度高达10-11g/ml,图像分辨率高达2μm。
实施例2
所述第一探测器407采用例如型号为9863/100B的光电倍增管,其它与实施例1相同。与实施例1相比,本实施例所述装置的灵敏度和检测精度能提高2个数量级。
实施例3
所述基片2表面的反射膜采用例如Au(45nm)/[TiO2(20nm)/ITO(20nm)]4/Au(20nm)复合膜或Au(25nm)/[TiO2(20nm)/SiO2(20nm)]2/Au(30nm)复合膜,其它与实施例1相同。与实施例1相比,本实施例所述装置的灵敏度和检测精度能提高1-2个数量级。
实施例4
所述基片2表面的反射膜采用例如用纳米刻蚀法制备的金纳米阵列结构,其它与实施例1相同。与实施例1相比,本实施例所述装置的灵敏度和检测精度能提高1-2个数量级。
实施例5
所述基片2表面的反射膜采用例如Au(45nm)/[TiO2(20nm)/ITO(20nm)]4/Au(20nm)纳米阵列结构或Au(25nm)/[TiO2(20nm)/SiO2(20nm)]2/Au(30nm)纳米阵列结构,其它与实施例1相同。与实施例1相比,本实施例所述装置的灵敏度和检测精度能提高1-3个数量级。
实施例6
所述第一探测器407采用例如1300×1024面阵CCD(电荷耦合器件),其它与实施例1相同。本实施例所述装置能够实现对面积等于或大于9cm2的阵列式各向异性生物样品进行检测。
应当理解,以上借助优选实施例对本发明的技术方案进行的详细说明是示 意性的而非限制性的。本领域的普通技术人员在阅读本发明说明书的基础上可以对各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (12)
1.偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,该装置包括直角棱镜(1)、一面镀有反射膜的基片(2)、恒温流通池(3)、第一光路机构(4)、注射泵(5)、第二光路机构(6)、第一锁相放大器(7)、处理系统(8)和第二锁相放大器(9);
所述第一光路机构(4)包括第一激光器(401)、光束整形镜组(402)、第一光弹调制器(403)、斩波器(404)、聚焦透镜(405)、第一偏振分析器(406)和第一探测器(407);所述第一激光器(401)、所述光束整形镜组(402)、所述第一光弹调制器(403)和所述斩波器(404)依次设置在沿入射光的光路上;所述聚焦透镜(405)、所述第一偏振分析器(406)和所述第一探测器(407)依次设置在沿出射光的光路上;
所述第二光路机构(6)包括第二激光器(601)、第二光弹调制器(602)、第一孔径光阑(603)、分色反射镜(604)、XY扫描镜(605)、倒置激光扫描共聚焦显微镜(606)、第三光弹调制器(607)、第二孔径光阑(608)、第二偏振分析器(609)、第二探测器(610)和控制器(611);所述第二激光器(601)、所述第二光弹调制器(602)、所述第一孔径光阑(603)和所述分色反射镜(604)依次设置在沿激发光的光路上;所述倒置激光扫描共聚焦显微镜(606)、所述XY扫描镜(605)、所述分色反射镜(604)、所述第三光弹调制器(607)、所述第二孔径光阑(608)、所述第二偏振分析器(609)和所述第二探测器(610)依次设置在沿荧光的光路上;所述控制器(611)分别与所述第二光弹调制器(602)和所述第三光弹调制器(607)电连接;
所述第二光弹调制器(602)和所述第三光弹调制器(607)的调制频率相同;
所述恒温流通池(3)上端开口,所述基片(2)设置在所述恒温流通池(3)上使得所述恒温流通池(3)上端封闭,所述基片(2)镀有反射膜的一面朝向所述恒温流通池(3)内;
所述棱镜(1)设置在所述基片(2)上,所述棱镜(1)与所述基片(2)之间有折射率匹配液;
所述恒温流通池(3)的进液口和出液口通过管路分别与所述注射泵(5)的出液口和进液口连接;
所述恒温流通池(3)置于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜(606)的载物台位置;
所述第一探测器(407)依次与所述第一锁相放大器(7)和所述处理系统(8)电连接,所述处理系统(8)分别与所述注射泵(5)、所述倒置激光扫描共聚焦显微镜(606)和所述第二锁相放大器(9)电连接,所述第二锁相放大器(9)分别与所述第二探测器(610)和所述控制器(611)电连接。
2.根据权利要求1所述的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,所述装置还包括三维调节机构,用于调节所述恒温流通池(3)及置于其上的所述基片(2)和所述棱镜(1)的空间三维位置,以使得所述基片(2)表面的所述反射膜位于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜(606)的焦平面处。
3.根据权利要求1所述的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,所述装置还包括调角机构,用于调节所述第一光路机构(4)的入射光和/或出射光的光路方向。
4.根据权利要求3所述的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,通过所述调角机构的调节能够使所述第一光路机构(4)的入射光和/或出射光与所述反射膜之间的夹角在0-90度之间连续变化。
5.根据权利要求1所述的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,所述第一锁相放大器(7)和所述第二锁相放大器(9)分别用于将来自所述第一探测器(407)和所述第二探测器(610)的光信号转换成电信号并将转换后的电信号发送到所述处理系统(8)。
6.根据权利要求1所述的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,所述倒置激光扫描共聚焦显微镜(606)用于对生物样品的反应过程进行成像并将其发送到所述处理系统(8)。
7.根据权利要求1所述的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,所述处理系统(8)包括带有BNC适配器的数据采集卡和数据处理装置,所述数据采集卡与所述数据处理装置电连接。
8.根据权利要求7所述的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,所述BNC适配器用于接受来自所述第一锁相放大器(7)和所述第二锁相放大器(9)的电信号,所述数据采集卡用于采集所述BNC适配器输出的数据,所述数据处理装置用于对来自所述数据采集卡的数据进行存储、分析和处理。
9.根据权利要求1所述的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,所述恒温流通池(3)的侧壁和底面采用石英玻璃材质;所述恒温流通池(3)的进液口和出液口采用聚四氟乙烯材质的密封圈密封。
10.根据权利要求1所述的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,所述棱镜(1)和所述基片(2)的材质相同。
11.根据权利要求1所述的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,所述基片(2)表面的所述反射膜包括金膜、银膜、Au45nm/[TiO220nm/ITO20nm]4/Au20nm复合膜、Au25nm/[TiO220nm/SiO220nm]2/Au30nm复合膜、金纳米阵列结构、Au45nm/[TiO220nm/ITO20nm]4/Au20nm纳米阵列结构或Au25nm/[TiO220nm/SiO220nm]2/Au30nm纳米阵列结构。
12.根据权利要求1所述的偏振调制型激光共聚焦表面等离子共振装置,其特征在于,所述第一激光器(401)是波长为632.8nm的He-Ne激光器;所述第二激光器(601)是波长分别为488nm、514nm和457nm的多线氩离子激光器。
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