CN113355400B - 一种基于t3 dna连接酶的镉离子检测方法 - Google Patents

一种基于t3 dna连接酶的镉离子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，它是通过设计一种DNA模板，当目标物镉离子存在的情况下，目标物拉近了链两端的距离，使得3’端和5’端互补配对，形成平末端；在T3 DNA连接酶的作用下，使该模板环化；再加入一段与环状模板互补配对的寡核苷酸链，作为后续扩增反应的引物；在加入phi 29 DNA聚合酶的作用下，开启滚环扩增反应，得到较长的一段核苷酸链条；在得到的产物中加入荧光染料SYBR Green I，使染料插入到DNA链条中，在517‑537nm的激发波长下，用紫外分光光度计进行检测样品，然后在487‑507nm的激发波下测得荧光强度；使用Real‑Time PCR方法对镉离子进行检测，验证本发明的方法的准确性。

Description

一种基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测方法，具体为一种基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法。
背景技术
由于工业废水的排放，使得一些重金属元素排入河流、湖泊或者海洋中。重金属元素随着食物链进入生物体内，不能被生物降解掉，而是在生物体内逐渐积累，当达到一定量时，它会影响生物的正常生理活动，进而危害生物的健康。鉴于镉离子的有害影响，(EPA)美国环境保护局，设定了饮用水中的最大镉污染值为5ppb。所以实现镉离子的高灵敏性检测是一项至关重要的工作。常见的镉离子检测技术有原子吸收光谱法、原子荧光光谱法以及诱导耦合等离子体光谱法。尽管这些方法的选择性和准确性都很高，但是它们中大多数都需要复杂的样品预处理过程以及耗时的检测程序。因此，需要开发出一种具有高灵敏性、高特异性、简单、快速的镉离子检测方法。
滚环扩增技术因其扩增速度快、模板序列可设计、扩增分子量大以及保真度高等优点，被广泛应用于生物检测领域。这种等温酶扩增技术，它利用独特的DNA和RNA聚合酶，例如Phi29、Bst、Vent exo-DNA聚合酶以及T7 RNA聚合酶，最终可产生包含数十至数百个串联重复序列的单链DNA或者RNA。这种强大的扩增技术已成为生物医学研究和纳米生物技术中优良的工具。虽然这种扩增方法非常方便、高效，但是RCA系统在实际应用中由于产物量大，会引起非特异性非特异性结合。这是其在实际应用中的一个很大的挑战。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，设计目标物适配体序列的模板，该模板既作为识别元件又作为启动元件，激活信号扩增反应，然后通过滚环扩增技术将信号进行放大，提高了整个检测方法的灵敏度与特异性。
技术方案：本发明所述的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，包括如下步骤：
(1)设计一种DNA模板，加入含有镉离子的样品溶液、T3连接酶混合液、T3 DNA连接酶反应缓冲液以及DEPC水，孵育；当目标物镉离子存在的情况下，目标物拉近了链两端的距离，使得3’端和5’端互补配对，形成平末端；在T3 DNA连接酶的作用下，该模板环化；
(2)再加入一段与上述环化模板互补配对的寡核苷酸链，作为后续扩增反应的引物；
(3)再加入phi 29DNA聚合酶，开启滚环扩增反应，得到较长的一段核苷酸链条；
(4)在步骤(3)得到的产物中加入荧光染料SYBR Green I，使染料插入到DNA链条中，在517-537nm的激发波长下，用紫外分光光度计检测样品中的镉离子，然后在487-507nm的激发波下测得荧光强度；
(5)使用Real-Time PCR方法对步骤(4)中样品的镉离子进行检测，验证本发明的方法的准确性。
所述的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，步骤(1)中所述的T3 DNA连接酶是在缓冲液1中，缓冲液1含有Tris-HCl、ATP、MgCl2、DTT、PEG 6000；
步骤(2)扩增反应的缓冲液为缓冲液2，含有Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4、DTT；
步骤(4)中的荧光染料SYBR Green I是在溶液3中，含有Tris-HCl、EDTA。
所述的的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，所述DNA模板为：5’P-ACTGTTGTGGTATTATTTTTGGTTGTGCAGT-OH 3’；引物序列为：5’-GGTTAATACCAC-3’
所述的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，步骤在(3)是步骤(2)所得产物与缓冲液2、BSA、dNTP、Phi 29DNA聚合酶以及DEPC水，孵育。
所述的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，步骤(4)是分别取步骤(3)所得反应溶液，加入SYBR Green I以及去离子水，将混合液孵育，最终在517-537nm的激发波长下，用紫外分光光度计进行检测，然后在487-507nm的激发波长下测得样品的荧光强度。
所述的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，步骤(1)中镉离子浓度为0-100nM。
在此本发明开发出的检测镉离子的方法，虽然也是依赖于滚环扩增增强信号，但是由于该模板是镉离子的适配体，又是由于镉离子的存在才会诱导适配体的变构，这使得整个滚环扩增的激活依赖于镉离子。仅当镉离子存在时，模板的构象发生的改变，在T3 DNA连接酶的作用下，最终使得线性适配体形成一种环状的模板。所以在加入相应的酶与原料后可以启动整个扩增反应的进行。当含有目标物时，由于目标物与适配体的相互结合，使得模板的3’端和5’端互补配对；在T3 DNA连接酶的作用下，该模板连接成环，以供后续的信号扩增反应；当没有目标物时，无法使模板弯曲成环，进而无法启动后续的扩增反应，最终检测到的荧光强度很低，具体见图1。由于适配体与目标物之间的高度特异性，降低了模板构象的非特异性的改变。综上所述，本发明开发的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，对于食品安全分析以及水环境保护无疑具有重大的意义。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：(1)本方法通过利用适配体与目标物之间的作用力，使得适配体发生变构，进而更容易在T3 DNA连接酶的作用下，连接成环。这种模板充当两种角色：a.识别目标物的元件；b.启动扩增反应的模板。充分利用了核酸的可编程性，降低了非特异性信号的影响。(2)本方法依赖了滚环扩增作为信号扩增的手段，避免了传统扩增方法的繁琐，使得整个反应都在恒温下进行。对于实时定点的检测样品具有巨大的意义。(3)本发明采用简易模板设计与恒温的扩增技术相结合形成检测痕量金属元素的检测方法。可用于食品、水样中有害离子的检测，具有无需额外标记、变温处理、高灵敏、低成本以及高通量检测的优势，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是该方法的整个策略图；
图2是该方法以及Real-Time PCR在含有不同浓度的镉离子样品中的荧光强度的变化趋势；其中，系列1为该方法的荧光值；系列为RT-PCR测得的荧光值；
图3是该方法的特异性检测分析。
具体实施方式
药品和试剂：实验中所使用的的所有DNA均由生工生物工程(上海，中国)合成，并且经HPLC纯化。
实施例1
缓冲液1具体配制为：132mM Tris-HCl、2mM ATP、20mM MgCl2、2mM DTT、15％PEG6000(pH 7.6@25℃)]，25℃。
缓冲液2具体配制为：50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT(pH7.5@25℃)。
SYBR Green I染料溶液的配制：先配制溶液3，具体配制为：10mM Tris-HCl、10mMEDTA,pH＝8.0)，然后将SYBR Green I染料与溶液3按照1:100的体积比例进行稀释。
表1基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法所用到的模板序列
模板序列 5’P-ACTGTTGTGGTATTATTTTTGGTTGTGCAGT-OH 3’
引物序列 5’-GGTTAATACCAC-3’
(1)分别取5μL的不同浓度镉离子的样品溶液与5μL的模板序列进行孵育。然后加入1μL的T3 DNA连接酶、20μL 2×T3 DNA连接酶反应缓冲液1以及9μL去离子水。进行孵育20-40min。
(2)分别取10μL的上述连接产物与10μL的反应引物，在37℃反应30分钟。
(3)分别在上述得到的反应溶液中，加入4μL的缓冲液2、1μL的BSA(10mg/mL)、5μL的dNTP(10mM)、1μL的Phi 29DNA聚合酶(10U/μL)以及9μL的DEPC水。整个反应在30℃下孵育2h，65℃下孵育10min，对酶进行灭活。
(4)分别在上述得到的反应溶液中加入等量的SYBR Green I溶液(约为终体积的1/10)，将混合液孵育30min，最终在527nm的激发波长下，用紫外分光光度计进行检测，然后得到497nm的激发波下的荧光强度。
实施例2
灵敏度实验
选择镉离子浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90以及100nM的样本溶液进行验证，结果如图2所示。确定了检测线性范围为0-100nM，检测限达到了0.08ppb。
实施例3
选择性实验
重复实施实例1中的步骤，其它条件不变，选择铅离子、镍离子、钴离子作为干扰元素检测荧光，得到本方法的选择性结果图，在相同条件下，检测其他离子与镉离子的荧光值如图3所示，从图中可以看出本发明所述方法对目标分子具有良好的选择性。
实施例4
本发明检测方法的回收率实验
将样品换成去离子水，并向样品中分别加入等量20、40以及60nM的Cd2+，获得本方法在实际样品检测目标分子中的回收率，结果见表2。
表2基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法
水样中Cd2+加标浓度(nM) 20 40 60
回收率 95％ 95％ 98％
实施例5
本发明与基于Real-Time PCR的检测结果进行比较
由于该方法是基于荧光染料的荧光法来检测最终的荧光强度，所以本发明使用了检测荧光强度的金标准方法Real-Time PCR进行验证试验。结果如图2所示。该方法比Real-Time PCR方法更加灵敏和节约时间。

Claims (5)

1.一种基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)设计一种DNA模板，加入含有镉离子的样品溶液、T3 DNA连接酶混合液、T3 DNA连接酶反应缓冲液以及DEPC水，孵育；当目标物镉离子存在的情况下，目标物拉近了链两端的距离，使得3’端和5’端互补配对，形成平末端；在T3 DNA连接酶的作用下，该模板环化；
(2)再加入一段与上述环化模板互补配对的寡核苷酸链，作为后续扩增反应的引物；
(3)再加入phi 29DNA聚合酶，开启滚环扩增反应，得到较长的一段核苷酸链条；
(4)在步骤(3)得到的产物中加入荧光染料SYBR Green I，使染料插入到DNA链条中，在517-537nm的激发波长下，用紫外分光光度计检测样品中的镉离子，然后在487-507nm的激发波下测得荧光强度；
(5)使用Real-Time PCR方法对步骤(4)中样品的镉离子进行检测，验证方法的准确性；
所述DNA模板为：5’P-ACTGTTGTGGTATTATTTTTGGTTGTGCAGT-OH 3’；引物序列为：5’-GGTTAATACCAC-3’。
2.根据权利要求1所述的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的T3 DNA连接酶是在缓冲液1中，缓冲液1含有Tris-HCl、ATP、MgCl2、DTT、PEG 6000；
步骤(2)扩增反应的缓冲液为缓冲液2，缓冲液2含有Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4、DTT：
步骤(4)中的荧光染料SYBR Green I是在溶液3中，溶液3含有Tris-HCl、EDTA。
3.根据权利要求2所述的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，其特征在于，步骤(3)是步骤(2)所得产物与缓冲液2、BSA、dNTP、Phi 29DNA聚合酶以及DEPC水，孵育。
4.根据权利要求1所述的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，其特征在于，步骤(4)是分别取步骤(3)所得反应溶液，加入SYBR Green I以及去离子水，将混合液孵育，最终在517-537nm的激发波长下，用紫外分光光度计进行检测，然后在487-507nm的激发波长下测得样品的荧光强度。
5.根据权利要求1所述的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，其特征在于，步骤(1)中镉离子浓度为0-100nM。
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