CN101798593A - 大豆锈病菌的检测引物、试剂盒以及实时pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种大豆锈病菌的检测引物、试剂盒以及实时PCR检测方法，引物包括正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，正向引物的序列是：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；反向引物的序列是：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。检测方法依次有合成引物、待测物中加入引物、扩增反应：包括预变性、重复进行一个反应区间、对PCR仪自动记录的反应结果进行HRM分析。具有检测简单、快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好、易于推广应用的优点，可广泛用于对实际检疫和田间调查过程中所发现的病组织进行大豆锈病菌分子生物学鉴定或检测，特别适用于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用。
Description
技术领域
本发明涉及包含酶或微生物的测定或检验方法，特别是涉及一种大豆锈病菌的检测引物、试剂盒以及实时PCR检测方法。
背景技术
大豆锈病菌(Phakopsora pachyrhizi Sydow)，又名豆薯多层锈菌，是危害豆科经济作物的专性寄生的气传真菌，属担子菌亚门真菌。寄主范围目前认为仅限于豆科植物，主要侵染大豆叶片和叶柄，严重时茎杆和豆荚也能受害，属于主权国家禁止入境的植物检疫危险性有害生物。有必要建立大豆锈病菌的快速检测方法，加强口岸检疫有效防止大豆锈病菌进境，以保护本国大豆生产。
通常采用的现有聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，缩略为PCR)的分子诊断方法，可以基本满足部分植物病原微生物的准确快速检疫、检测和鉴定要求，但是，将EvaGreen染料用于实时PCR和高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting，缩略为HRM)分析进行植物病原真菌的检测在国内外还是处于起步阶段。EvaGreen染料是一种DNA结合染料，非常稳定且无致突变性和细胞毒性。通过有选择的结合双链DNA，EvaGreen在实验中可以使用较高的浓度，对PCR的抑制作用很低，对低熔点的DNA链也可以检测到。而HRM是一种遗传学分析手段，它通过实时监测升温过程中DNA染料与PCR扩增产物的结合情况的独特的熔解曲线形状，特别是其中的产物峰，就可以对不同的核酸片段进行区分，而且具有很高的特异性、稳定性和重复性。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆锈病菌的检测引物。
本发明所要解决的另一个技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆锈病菌的检测试剂盒。
本发明所要解决的再一个技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆锈病菌的实时PCR检测方法。
对于本发明所要解决的大豆锈病菌检测引物，采用以下技术方案予以解决：
这种大豆锈病菌的检测引物，包括正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，
所述正向引物Rs-F的序列是：
SEQ ID NO：1：PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；
所述反向引物Rs-R的序列是：
SEQ ID NO：2：PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。
优选地，所述正向引物Rs-F具有如下的核酸序列：
PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’SEQ ID NO：1。
优选地，所述反向引物Rs-R具有如下的核酸序列：
PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’SEQ ID NO：2。
对于本发明所要解决的大豆锈病菌的检测试剂盒，采用以下技术方案予以解决：
这种大豆锈病菌的检测试剂盒包含一对引物，所述一对引物是正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，
所述正向引物Rs-F的序列是：
SEQ ID NO：1：PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；
所述反向引物Rs-R的序列是：
SEQ ID NO：2：PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。
优选地，所述正向引物Rs-F具有如下的核酸序列：
PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’SEQ ID NO：1。
优选地，所述反向引物Rs-R具有如下的核酸序列：
PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’SEQ ID NO：2。
对于本发明所要解决的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，采用以下技术方案予以解决：
这种大豆锈病菌的实时PCR检测方法，依次有以下步骤：
1)合成引物，2)待测物中加入引物，3)扩增反应。
这种大豆锈病菌的实时PCR检测方法的特点是：
所述步骤1)合成引物，是一对由特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R组成的一对特异性引物，再按照特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R的序列分别合成特异性引物备用；
所述正向引物Rs-F的序列是：
SEQ ID NO：1：PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；
所述反向引物Rs-R的序列是：
SEQ ID NO：2：PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。
对于本发明所要解决的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，采用以下进一步的技术方案予以解决：
所述步骤2)待测物中加入引物，是对大豆锈病菌的PCR扩增体系进行扩增反应。
所述扩增体系包含浓度为10～100ng/μL的1μL大豆锈病菌基因组DNA模板、1μM备用的特异性引物、EvaGreen反应混合液EvaGreen Master Mix 12.5μL，总体积为25μL。
所述步骤3)扩增反应依次有以下子步骤：
3·1)在95℃下预变性15min；
3·2)在95℃下反应15s、在60℃下反应60s，为一个反应区间，重复进行40次；
3·3)对PCR仪自动记录的反应结果进行HRM分析，95℃持续15秒，60℃持续15秒，95℃持续15秒。
所述HRM分析是对反映大豆锈病菌基因组DNA为模板与PCR扩增产物反应结果的熔解曲线进行分析。
所述分析的判定标准是：如果阳性对照有明显的产物峰，阴性对照和空白对照没有产物峰，而样品的检测结果有产物峰，判定待测物为大豆锈病菌；如果阳性对照有明显的产物峰，阴性对照和空白对照没有产物峰，而样品的检测结果没有产物峰，判定待测物为非大豆锈病菌。
本发明与现有技术对比的有益效果是：
提出了适用于大豆锈病菌EvaGreen PCR快速检测的引物和试剂盒。检测方法具有检测简单、快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好、易于推广应用的优点，可以广泛用于对实际检疫和田间调查过程中所发现的病组织进行大豆锈病菌分子生物学鉴定或检测，特别适用于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用。
附图说明
附图是本发明具体实施方式的PCR扩增反应的特异性试验结果示意图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式并对照附图对本发明作进一步说明。
一种大豆锈病菌的实时PCR检测方法，采用检测试剂盒中的检测引物，包括正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，
正向引物Rs-F的序列是：
SEQ ID NO：1：PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；
具有如下的核酸序列：
PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’SEQ ID NO：1；
反向引物Rs-R的序列是：
SEQ ID NO：2：PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。
具有如下的核酸序列：
PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’SEQ ID NO：2。
具体检测依次有以下步骤：
1)合成引物：先设计一对由特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R组成的一对特异性引物，再按照特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R的序列分别合成特异性引物备用；
正向引物Rs-F的序列是：
SEQ ID NO：1：PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；
反向引物Rs-R的序列是：
SEQ ID NO：2：PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。
2)待测物中加入引物，对大豆锈病菌的PCR扩增体系进行扩增反应。扩增体系包含浓度为10～100ng/μL的1μL大豆锈病菌基因组DNA模板、1μM备用的特异性引物、EvaGreen反应混合液EvaGreen Master Mix 12.5μL(超世生物公司出品，型号为H30102)，总体积为25μL。
3)扩增反应依次有以下子步骤：
3·1)在95℃下预变性15min；
3·2)在95℃下反应15s、在60℃下反应60s为一个反应区间，重复进行40次；
3·3)对PCR仪自动记录的反应结果进行HRM分析，95℃持续15秒，60℃持续15秒，95℃持续15秒。
对反映DNA染料与PCR扩增产物反应结果的熔解曲线进行分析的判定标准是：如果以大豆锈病菌基因组DNA为模板的阳性对照有明显的产物峰，阴性对照和空白对照没有产物峰，而样品的检测结果有产物峰，则判定所检测的真菌为大豆锈病菌；如果以大豆锈病菌基因组DNA为模板的阳性对照有明显的产物峰，阴性对照和空白对照没有产物峰，而样品的检测结果没有产物峰，则判定所检测的真菌为非大豆锈病菌。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。
0910206ST-大豆锈病菌的检测引物、试剂盒以及实时PCR检测方法-序列表.SEQ
序列表
<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
<120>大豆锈病菌的检测引物、试剂盒以及实时PCR检测方法
<130>0910206 ST
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gtgcacttta ttgtggctca aaact 25
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atgattaata ggtgggttgc agc 23
Claims (10)
1.一种大豆锈病菌的检测引物，包括正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，其特征在于：
所述正向引物Rs-F的序列是：
SEQ ID NO：1：PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；
所述反向引物Rs-R的序列是：
SEQ ID NO：2：PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。
2.如权利要求1所述的大豆锈病菌的检测引物，其特征在于：
所述正向引物Rs-F具有如下的核酸序列：
PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’SEQ ID NO：1。
3.如权利要求2所述的大豆锈病菌的检测引物，其特征在于：
所述反向引物Rs-R引物具有如下的核酸序列：
PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’SEQ ID NO：2。
4.一种大豆锈病菌的检测试剂盒，包含一对引物，所述一对引物是正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，其特征在于：
所述正向引物Rs-F的序列是：
SEQ ID NO：1：PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；
所述反向引物Rs-R的序列是：
SEQ ID NO：2：PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。
5.一种大豆锈病菌的实时PCR检测方法，依次有以下步骤：1)合成引物，2)待测物中加入引物，3)扩增反应，其特征在于：
所述步骤1)合成引物，是先设计一对由特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R组成的一对特异性引物，再按照特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R的序列分别合成特异性引物备用；
所述正向引物Rs-F的序列是：
SEQ ID NO：1：PPSG2FP-F：5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；
所述反向引物Rs-R的序列是：
SEQ ID NO：2：PPSG2RP-R：5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。
6.如权利要求5所述的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，其特征在于：
所述步骤2)待测物中加入引物，是对大豆锈病菌的PCR扩增体系进行扩增反应。
7.如权利要求4所述的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，其特征在于：
所述扩增体系包含浓度为10～100ng/μL的1μL大豆锈病菌基因组DNA模板、1μM备用的特异性引物、EvaGreen反应混合液EvaGreen Master Mix 12.5μL，总体积为25μL。
8.如权利要求7所述的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，其特征在于：
所述步骤3)扩增反应依次有以下子步骤：
3·1)在95℃下预变性15min；
3·2)在95℃下反应15s、在60℃下反应60s，为一个反应区间，重复进行40次；
3·3)对PCR仪自动记录的反应结果进行HRM分析，95℃持续15秒，60℃持续15秒，95℃持续15秒。
9.如权利要求8所述的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，其特征在于：
所述HRM分析是对反映大豆锈病菌基因组DNA为模板与PCR扩增产物反应结果的熔解曲线进行分析判定。
10.如权利要求9所述的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，其特征在于：
所述分析判定的标准是：如果阳性对照有明显的产物峰，阴性对照和空白对照没有产物峰，而样品的检测结果有产物峰，判定待测物为大豆锈病菌；如果阳性对照有明显的产物峰，阴性对照和空白对照没有产物峰，而样品的检测结果没有产物峰，判定待测物为非大豆锈病菌。
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| CN102559865A (zh) * | 2011-10-17 | 2012-07-11 | 四川农业大学 | 猪氟烷基因快速分型试剂盒及其检测方法 |
| CN104232775A (zh) * | 2014-09-18 | 2014-12-24 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一个与大豆抗锈病基因位点紧密连锁的分子标记GmSSR18-40及其应用 |
| CN116179751A (zh) * | 2023-02-21 | 2023-05-30 | 南京农业大学 | 大豆锈病菌的检测靶标、lamp引物、试剂盒及其检测方法 |
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| CN116179751B (zh) * | 2023-02-21 | 2024-03-26 | 南京农业大学 | 大豆锈病菌的检测靶标、lamp引物、试剂盒及其检测方法 |
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