CN103820566B - 转基因玉米das-40278-9品系特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量分析方法，具体是指转基因玉米DAS-40278-9品系特异定量PCR精准检测方法。本发明采用设计的特异性上游引物序列DAS-40278-9event-F、下游引物序列DAS-40278-9event-R、荧光探针序列DAS-40278-9event-P、DAS-40278-9品系的DNA稀释液以及Taqman Master mix（2×）和水配制成PCR反应体系，进行定量PCR检测。本发明主要建立了一种高扩增效率、高准确度的Taqman定量PCR检测技术，适用于国内农业转基因生物及产品监督检验、进出境口岸转基因生物及产品检验、企业内部进口原材料含转基因DAS-40278-9品系生物成分检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量的分析方法。
背景技术
国际上很多国家对转基因产品实施限量标识和进口，而我国尚无具体的转基因产品标识阈值。为了打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，同时弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系，更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，建立一种新型转基因玉米DAS-40278-9品系特异定量PCR精准检测方法已成为必要。
目前关于转基因玉米DAS-40278-9的检测技术，主要集中在普通定性PCR分析方法和标准，尚无关于扩增检测转基因玉米DAS-40278-9及产品的品系特异性某特定位点（基因序列）的定量PCR精准检测技术。
发明内容
本发明的目的主要是提供一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米DAS-40278-9及产品的品系特异性某特定位点的定量PCR精准检测技术。
本发明通过下述技术方案实现：
转基因玉米DAS-40278-9品系特异定量PCR精准检测的引物和探针，
上游引物序列，DAS-40278-9event-F：5'-GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3'；
下游引物序列，DAS-40278-9event-R：5'-TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3'；
荧光探针序列，DAS-40278-9event-P：5'-FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3'。
转基因玉米DAS-40278-9品系特异定量PCR精准检测方法，包括以下步骤：
（1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，DAS-40278-9event-F：5'-GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3'
下游引物序列，DAS-40278-9event-R：5'-TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3'
荧光探针序列，DAS-40278-9event-P：5'-FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3'；
（2）制备DAS-40278-9品系的DNA稀释液；
（3）配制PCR反应体系；
（4）定量PCR检测。
进一步地，步骤（1）所述合成的引物及荧光探针的浓度均为10μmol/l，步骤（2）所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
再进一步地，步骤（3）所述的配制PCR反应体系，即将3μl的DNA稀释液加入到20μl反应体系中，所述20μl的反应体系包括以下组分：
另外，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环。
本发明具有以下优点及有益效果：
（1）本发明打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒；
（2）本发明弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系；
（3）本发明提供的检测技术可更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权；
（4）本发明扩增效率高、准确度高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
实施例
转基因玉米DAS-40278-9品系特异定量PCR精准检测方法，包括以下步骤：
（1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，DAS-40278-9event-F：5'-GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3'
下游引物序列，DAS-40278-9event-R：5'-TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3'
荧光探针序列，DAS-40278-9event-P：5'-FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3'。
本实施例引物及荧光探针的合成浓度均为10μmol/l。
以上引物和荧光探针的核苷酸序列是针对转基因玉米DAS-40278-9及产品的品系特异性某特定位点，即目的基因与受体玉米基因组旁侧位点设计；通过该设计就可以精准检测转基因玉米中DAS-40278-9的转化事件。
（2）制备DAS-40278-9品系的DNA稀释液；即采用常规的DNA提取手段，从转基因玉米DAS-40278-9中提取出浓度为50ng/μl的DNA稀释液。
（3）配制PCR反应体系；即将3μl制备好的DNA稀释液加入20μl反应体系中即可。
以上20μl反应体系包括以下组分：
（4）定量PCR检测。
根据上述PCR反应体系，在以下PCR反应条件下对产物进行扩增并检测，PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环。本实施例中采用的是ABI公司生产的7500型荧光定量PCR仪器。
对本实施例的方法数据连续重复做21个平行样品，对该21个样品进行了检测，其检测数据如表1。
表1
对本实施例方法灵敏度检测数据见表2
表2
采用本发明能够精准检测转基因玉米中DAS-40278-9转化事件及其含量，获得标准曲线斜率，在-3.6～-3.1之间，相关系数大于0.99，扩增效率为94.8%，在90%～110%的范围内。待检样品的定量检测结果（1.024%）非常接近真实值（1%），检测结果的相对偏差小于国际认可的25%，检测结果的不确定度小于10%。本发明灵敏度测定结果表明，5个基因拷贝以上的样品中均能收集到荧光信号，本发明灵敏度为5个copies。
由以上检测结果可得知，本方法的各指标均满足国际认可的精准基因定量检验方法的范围，本发明的扩增效率高、准确度高。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省农业科学院分析测试中心
<120> 转基因玉米DAS-40278-9品系特异定量PCR精准检测的引物和探针及方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 上游引物（DAS-40278-9event-F）
<400> 1
gtccagcacg aaccattgag t 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 下游引物（DAS-40278-9event-R）
<400> 2
ttcattgtat tctggctttg ctg 23
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 荧光探针（DAS-40278-9event-P）
<400> 3
caacagcacc gtaccttgaa gcggaat 27
Claims (5)
1.转基因玉米DAS-40278-9品系特异定量PCR精准检测的引物和探针，其特征在于,
上游引物序列，DAS-40278-9event-F：5'-GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3'；
下游引物序列，DAS-40278-9event-R：5'-TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3'；
荧光探针序列，DAS-40278-9event-P：5'-FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3'。
2. 转基因玉米DAS-40278-9品系特异定量PCR精准检测方法，其特征在于,包括以下步骤：
（1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，DAS-40278-9event-F：5'-GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3'
下游引物序列，DAS-40278-9event-R：5'-TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3'
荧光探针序列，DAS-40278-9event-P：5'-FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3'；
（2）制备DAS-40278-9品系的DNA稀释液；
（3）配制PCR反应体系；
（4）定量PCR检测。
3. 根据权利要求2所述的转基因玉米DAS-40278-9品系特异定量PCR精准检测方法，其特征在于，步骤（1）所述合成的引物及荧光探针的浓度均为10μmol/l，步骤（2）所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
4. 根据权利要求3所述的转基因玉米DAS-40278-9品系特异定量PCR精准检测方法，其特征在于，步骤（3）所述的配制PCR反应体系，即将3μl的DNA稀释液加入到反应体系中，所得的反应体系包括以下组分：
2×Taqman Master mix 10μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
荧光探针 0.5μl
DNA稀释液 3.0μl
水 7.5μl。
5. 根据权利要求2或4所述的转基因玉米DAS-40278-9品系特异定量PCR精准检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环。
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