CN100419087C

CN100419087C - 用于检测溶藻弧菌的引物序列及检测试剂盒

Info

Publication number: CN100419087C
Application number: CNB2006100161704A
Authority: CN
Inventors: 孙金生; 薛淑霞; 李翔; 耿绪云; 胡金城
Original assignee: Tianjin Fisheries Research Laboratory
Current assignee: Tianjin Fisheries Research Laboratory
Priority date: 2006-10-19
Filing date: 2006-10-19
Publication date: 2008-09-17
Anticipated expiration: 2026-10-19
Also published as: CN1944667A

Abstract

本发明公开了一种用于检测溶藻弧菌的引物序列及检测试剂盒，检测试剂盒由下述试剂组成，试剂A：将普通营养肉汤与陈海水混合，经高压灭菌制成；试剂B：将PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、灭菌双蒸水混合制成；试剂C：将SEQ ID No1、SEQ ID No2所述的核苷酸序列，dNTPs，MgCl₂混合制成；试剂D：溶藻弧菌的基因组总DNA；试剂E：灭菌双蒸水；试剂F：TBE电泳缓冲液，使含Tris——硼酸，EDTA制成；试剂G：琼脂糖，使含溴化乙锭，本发明的引物，优化了PCR反应条件和体系，建立起检测溶藻弧菌的PCR检测方法，在此基础上装配出简便、快速、灵敏、特异的检测溶藻弧菌的试剂盒。

Description

用于检测溶藻弧菌的引物序列及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术中的DNA序列，使用该序列对一种细菌进行检测的试剂盒，特别是涉及一种用于检测溶藻弧菌的引物序列及检测试剂盒。

背景技术

溶藻弧菌是沿海地区食物中毒和散在性腹泻的重要病原菌，同时也是多种水生动物的致病菌，如南美白对虾、斜带石斑鱼、鲑点石斑鱼、贝类、大黄鱼、黄鳍鲷、锯缘青蟹等均可被溶藻弧菌感染致病，并产生不同的病症。特别是近几年由溶藻弧菌感染所引起的海水工厂化养殖大菱鲆和褐牙鲆腹水病，给海水工厂化养殖企业造成了巨大的经济损失。同时，溶藻弧菌可通过海产品感染人类，造成急性肠道疾病。

目前对细菌性疾病的治疗大多依赖于抗生素，抗生素的滥用不仅使病原菌产生了抗性，同时对人的健康也造成了一定的压力。建立起准确、快速检测病原菌的方法，构建有效的预报预警机制，在目前来说是非常必要和紧迫的。

现在对溶藻弧菌的鉴定主要依赖于常规的生理生化方法，该方法耗时、费力，并且弧菌种类多，生理生化特征相似，造成生化反应结果难以判定，从而影响了细菌鉴定的准确率。

多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction，简称PCR)技术检测灵敏度高，特异性强，检验周期短，操作相对简便。但目前尚无用此种方法对溶藻弧菌快速诊断与检测的报导。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种用于检测溶藻弧菌的引物序列。

本发明的第二个目的是提供一种对海水工厂化养殖水生经济动物以及养殖水体中的溶藻弧菌跟踪监测，并具有简便、灵敏、特异、快速特点的溶藻弧菌检测试剂盒

本发明的技术方案概述如下：

一种用于检测溶藻弧菌的引物序列，它由上游引物和下游引物组成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。

一种溶藻弧菌检测试剂盒，由下述试剂组成：

试剂A：将0.5-2.0g普通营养肉汤与50mL的陈海水混合，经0.1-0.5Kpa高压灭菌制成；

试剂B：将10倍浓度的PCR反应缓冲液1.5-5.0μL、Taq DNA聚合酶1-3U、灭菌双蒸水17-19μL混合制成；

试剂C：将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.2-0.8μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.2-0.8μL，10mM dNTPs 0.2-0.8μL，25mM MgCl₂1.0-4.0μL混合制成；

试剂D：20-100ng/mL的溶藻弧菌的基因组总DNA；

试剂E：灭菌双蒸水；

试剂F：取50mL 20倍TBE电泳缓冲液，使其中含有0.09mol羟基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸(EDTA)制成；

试剂G：0.3-0.6g琼脂糖，使其中含溴化乙锭15-30μg。

优选的是：所述试剂A为：将1.25g普通营养肉汤与50mL的陈海水混合，经0.1-0.5Kpa高压灭菌制成；所述试剂B为：将10倍浓度的PCR反应缓冲液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、灭菌双蒸水17.25μL混合制成；所述试剂C为：将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl₂ 1.5μL混合制成；所述试剂D为：40-60ng/mL的溶藻弧菌的基因组总DNA；

所述试剂G为：0.3g琼脂糖，使其中含溴化乙锭20μg。

所述溶藻弧菌的基因组总DNA是用下述方法提取的：取在2216E平板上培养18-24h的溶藻弧菌，用灭菌的双蒸水制成菌悬液，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取溶藻弧菌的基因组总DNA。本发明的优点：

利用溶藻弧菌的基因保守序列设计一对引物，优化PCR反应条件和反应体系，建立起检测溶藻弧菌的PCR检测方法，在此基础上装配出简便、快速、灵敏、特异的一种溶藻弧菌检测试剂盒，该试剂盒可用于对海水工厂化养殖水生经济动物以及养殖水体中的细菌的跟踪监测，同时也可用于对海产品以及人类腹泻的临床检测，具有很高的实用价值。

附图说明

图1为检测溶藻弧菌电泳结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种用于检测溶藻弧菌的引物序列，它由上游引物和下游引物组成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No 1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。

序列表

SEQ ID No1：

5’--AAGAGGGTTACTTTCATCAG-3

SEQ ID No2：

5’--CGTGTTTCCACCAGCAT-3’

实施例2

一种溶藻弧菌检测试剂盒，由下述试剂组成：

试剂A：将1.25g普通营养肉汤与50mL的陈海水混合，经0.3Kpa高压灭菌制成；

试剂B：将10倍浓度的PCR反应缓冲液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、灭菌双蒸水17.25μL混合制成；

试剂C：将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl₂ 1.5μL混合制成；

试剂D：60ng/mL的溶藻弧菌的基因组总DNA；

试剂E：灭菌双蒸水；

试剂F：取50mL 20倍TBE电泳缓冲液，使其中含有0.09mol羟基甲基氨基甲烷-硼酸(Tris-硼酸)，2mmol乙二胺四乙酸(EDTA)制成；

试剂G：0.3g琼脂糖，使其中含溴化乙锭20μg；

灭菌牙签一包。

本发明的主要原理为：

试剂A对样品中的溶藻弧菌进行预培养，然后经过离心，重悬，煮沸等步骤释放出溶藻弧菌基因组总DNA，试剂B和试剂C含有多聚酶链式反应试剂，将试剂B和试剂C按比例混合在一起，通过加入溶藻弧菌基因组总DNA，对溶藻弧菌的某一基因进行特异性扩增。由于我们所设计的这对引物为溶藻弧菌所特有，如果样品中含有溶藻弧菌，经过多聚酶链式反应扩增后，核酸浓度会达到10⁸mol以上，经过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，在紫外分析仪中可以探测到一定分子量的目的条带。如果没有溶藻弧菌，则不能扩增到同样分子量的目的条带。

实施例3

一种溶藻弧菌检测试剂盒，由下述试剂组成：

试剂A：将0.5g普通营养肉汤与50mL的陈海水混合，经0.1Kpa高压灭菌制成；

试剂B：将10倍浓度的PCR反应缓冲液1.5μL、Taq DNA聚合酶1U、灭菌双蒸水17μL混合制成；

试剂C：将10μM SEQ IDNo1所述的核苷酸序列0.2μL，10μM SEQ IDNo2所述的核苷酸序列0.2μL，10mM dNTPs 0.2μL，25mM MgCl₂ 1.0μL混合制成；

试剂D：20ng/mL的溶藻弧菌的基因组总DNA；

试剂E：灭菌双蒸水(二次蒸馏水)；

试剂F：取50mL 20倍TBE电泳缓冲液，使其中含有0.09mol羟基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol EDTA制成；

试剂G：0.3g琼脂糖，使其中含溴化乙锭15μg；

灭菌牙签一包。

实施例4

一种溶藻弧菌检测试剂盒，由下述试剂组成：

试剂A：将2.0g普通营养肉汤与50mL的陈海水混合，经0.5Kpa高压灭菌制成；

试剂B：将10倍浓度的PCR反应缓冲液5.0μL、Taq DNA聚合酶3U、灭菌双蒸水19μL混合制成；

试剂C：将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.8μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.8μL，10mM dNTPs 0.8μL，25mM MgCl₂ 4.0μL混合制成；

试剂D：100ng/mL的溶藻弧菌的基因组总DNA；

试剂E：灭菌双蒸水；

试剂G：0.6g琼脂糖，使其中含溴化乙锭30μg；

灭菌牙签一包。

实施例5

一种溶藻弧菌检测试剂盒，由下述试剂组成：

试剂A：将1.5g普通营养肉汤与50mL的陈海水混合，经0.2Kpa高压灭菌制成；

试剂B：将10倍浓度的PCR反应缓冲液2.5μL、Taq DNA聚合酶2U、灭菌双蒸水18μL混合制成；

试剂C：将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl₂3.0μL混合制成；

试剂D：40ng/mL的溶藻弧菌的基因组总DNA；

试剂E：灭菌双蒸水；

试剂G：0.4g琼脂糖，使其中含溴化乙锭20μg；

灭菌牙签一包。

实施例6

所述溶藻弧菌的基因组总DNA是用下述方法提取的：取在2216E平板上培养18小时(也可以是培养20小时或24小时)的溶藻弧菌，用灭菌的双蒸水制成菌悬液，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(Bacterial Genomic DNAMini-prep Kit)提取溶藻弧菌的基因组总DNA，做为阳性对照。细菌基因组DNA提取试剂盒(Bacterial Genomic DNAMini-prep Kit)为天为时代公司产品。溶藻弧菌购于中科院微生物研究所。

实施例7

用本发明的一种溶藻弧菌检测试剂盒检测方法如下：

1、样品处理：取0.1-0.3g或100-300μL样品，加入800μL试剂A，用灭菌的牙签充分捣碎样品组织，37℃8-12h，3000rpm/min离心1min；

2、取600μL上清，13000rpm/min离心5min，弃上清；

3、加20μL试剂E，用加样枪头轻轻搅动沉淀使其充分悬浮；

4、95℃处理15min，稍离心，上清作为细菌DNA的提取液；

5、PCR扩增：取18.1μL试剂B与4.9μL试剂C混合，加入2μL细菌DNA提取液，同时分别取2μL试剂D和试剂E分别加入另外两个18.1μL试剂B与4.9μL试剂C混合的PCR反应管中，分别作为阳性对照和空白对照，在PCR仪上进行扩增，反应条件为：94℃ 2min预变性，94℃ 40sec，58℃ 45sec，72℃ 1min，29个循环，72℃ 10min，4℃保存；

6、反应结束后，取试剂F用蒸馏水做40倍稀释，将试剂G倒入100mL的三角瓶内，加入稀释后的试剂F，加热，直至溶液清亮，稍冷却，倒入制胶槽；

7、取5-10μL PCR反应产物加2μL上样缓冲液，经1％琼脂糖凝胶电泳30-35min后于紫外仪上观察，若在485bp处出现反应条带，则为溶藻弧菌阳性，若无条带为阴性，阳标应在485bp处出现反应条带，空白应无反应条带。

图1中M为DL2000Marker(从上到下分子量依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1为空白对照；2为阳性样品；3为阳性对照。

Claims

1. 一种用于检测溶藻弧菌的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

2. 一种溶藻弧菌检测试剂盒，其特征是由下述试剂组成：

试剂C：将10μM SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列0.2-0.8μL，10μM SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列0.2-0.8μL，10mM dNTPs 0.2-0.8μL，25mM MgCl₂ 1.0-4.0μL混合制成；

试剂D：20-100ng/mL的溶藻弧菌的基因组总DNA；

试剂E：灭菌双蒸水；

试剂F：取50mL 20倍TBE电泳缓冲液，使其中含有0.09mol羟基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸制成；

试剂G：0.3-0.6g琼脂糖，使其中含溴化乙锭15-30μg。

3. 根据权利要求2所述的一种溶藻弧菌检测试剂盒，其特征是所述试剂A为：将1.25g普通营养肉汤与50mL的陈海水混合，经0.1-0.5Kpa高压灭菌制成；所述试剂B为：将10倍浓度的PCR反应缓冲液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、灭菌双蒸水17.25μL混合制成；所述试剂C为：将10μM SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl₂ 1.5μL混合制成；所述试剂D为：40-60ng/mL的溶藻弧菌的基因组总DNA；所述试剂G为：0.3g琼脂糖，使其中含溴化乙锭20μg。

4. 根据权利要求2或3所述的一种溶藻弧菌检测试剂盒，其特征是所述溶藻弧菌的基因组总DNA是用下述方法提取的：取在2216E平板上培养18-24h的溶藻弧菌，用灭菌的双蒸水制成菌悬液，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取溶藻弧菌的基因组总DNA。