CN103525910B - 转植酸酶基因玉米bvla430101品系特异性定量pcr检测方法 - Google Patents

转植酸酶基因玉米bvla430101品系特异性定量pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法，包括以下步骤：合成引物及与引物配合使用的荧光探针，上游引物的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；步骤2，从转植酸酶基因玉米BVLA430101中提取出DNA并制备其稀释液；步骤3，配制PCR反应体系；步骤4，将DNA稀释液加入到PCR反应体系中，采用定量PCR仪对所述DNA稀释液进行PCR扩增反应并检测。本发明的方法具有高效、灵敏、准确等优点，适合转植酸酶基因玉米BVLA430101及其加工产品的定量检测。

Description

转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种转基因植物品系特异性定量PCR检测方法，具体的说，涉及一种转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法。
背景技术
随着农业转基因生物技术的快速发展，全球转基因作物的种植面积迅猛增加。截止到2012年底，全球已有28个国家共种植了25种转基因作物，种植面积达到1亿7千3百万公顷，其中转基因玉米种植面积超过5500万公顷，占玉米种植面积的35%。尽管我国目前还没有批准转基因玉米的种植，但已批准了国外9个转基因玉米品系进口用作加工原料。随着转基因作物的广泛种植和商业化应用，转基因产品的安全性问题引起了公众的重视，许多国家和地区纷纷开始实施转基因标签制度，对转基因产品实施限量标识和进口，如欧盟设立了对转基因食品进行标识的最低含量阈值(0.9%)，即只有相关产品中转基因成分的含量高于这一阈值时才需标识。我国政府高度重视转基因生物的安全管理，颁布实施了《农业转基因生物安全管理条例》及其配套管理规章，对农业转基因生物及其产品实行安全评价、产品标识、生产许可、经营许可、进口许可、加工许可等制度，且采用强制性标识方法，只要含有转基因成分就必须标识。转基因检测方法的建立是这些规章制度得以顺利实施的关键。迄今为止，我国已经研究和制定了多个转基因玉米的检测方法，并颁布为国家标准(如农业部869号公告-3-2007转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种定性PCR方法)。
2009年8月，我国批准了自主研发的转植酸酶基因玉米BVLA430101的生物安全证书。它是通过基因枪将黑曲霉中的植酸酶基因转入到玉米中，经过多代筛选培育而成的。转入植酸酶的目的是降解玉米中大量含有的植酸，释放可被动物利用的无机磷，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本，减少动物粪、尿中磷的排泄，减轻环境污染，具有广阔的应用前景。尽管Chen等报道了转植酸酶基因玉米采用的启动子、终止子和目的基因的名称(Rumei Chen，Guangxing Xue，et al.Transgenic maize plantsexpressing a fungal phytase gene.Transgenic Res.2008，17：633-643.)，但并没有提供确切的可以直接查询到的序列信息，也未提供启动子、目的基因和终止子之间的具体连接方式。对转基因检测来说，这些详细的信息对转基因材料的身份确认是必不可少的。2010年，谢家建等人报道了转植酸酶基因玉米BVLA430101完整表达框序列以及构建PCR方法（专利公开号为CN101792811A，公开日为2010年08年04）；同时他们揭示了该玉米品系转化体外源插入片段的5’端旁侧序列，并基于此序列信息建立了PCR定性检测方法（专利公开号为CN10172812A，公开日为2010年08年04）。但是，目前依然尚无关于定量方法检测转植酸酶基因玉米BVLA430101的报道或者专利。因此有必要建立一种新型转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR精确检测技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、灵敏、准确的检测转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现，本发明涉及一种转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法，包括以下步骤：
步骤1，合成具有以下核苷酸序列的引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，
下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，
荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所示荧光探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；
步骤2，从转植酸酶基因玉米BVLA430101中提取出DNA并制备其稀释液；
步骤3，配制PCR反应体系，包括以下组分：所述正向引物、所述反向引物、所述荧光探针、10×Buffer、dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶、ddH2O；
步骤4，将所述DNA稀释液加入到所述PCR反应体系中，采用定量PCR仪对所述DNA稀释液进行PCR扩增反应并检测。
优选的，步骤1中，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。
优选的，步骤1中，所述上游引物、下游引物和荧光探针的浓度均为10μmol/L。
更优选的，步骤2中，所述DNA稀释液的浓度为20ng/μL。
进一步优选的，在步骤3中，PCR反应体系，包括以下组分：10×Buffer2.5μL；2mmol/L dNTPs2.5μL；25mmol/L MgCl25μL；10μmol/L正向引物0.6μL；10μmol/L反向引物0.6μL；10μmol/L荧光探针0.4μL；5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL；ddH2O8.1μL。
最优选的，步骤4中，将5μL所述DNA稀释液加入到所述反应体系中，采用定量PCR仪对所述DNA稀释液进行PCR扩增反应并检测。
优选的，所述PCR扩增反应的条件为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用了特异性上游引物、下游引物和荧光探针，检测特异性和准确度高，而且高效灵敏。本发明提供的检测方法适合于转植酸酶基因玉米BVLA430101及其加工产品的定量检测，可更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册（New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001）中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。
实施例
本实施例涉及一种转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法，
主要包括以下步骤：
步骤（1），合成具有以下核苷酸序列的引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，浓度为10μmol/L，
下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，浓度为10μmol/L，
荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1，浓度为10μmol/L；
以上引物和荧光探针的核苷酸序列是针对转植酸酶基因玉米BVLA430101及产品的品系特异性某特定位点，即外源基因与玉米基因组DNA的整合为点设计，通过该设计就可以精确检测转基因玉米中BVLA430101的转化事件；
步骤（2），制备BVLA430101品系的DNA稀释液：采用常规的DNA提取手段，从转植酸酶基因玉米BVLA430101中提取出浓度为20ng/μL的DNA稀释液；
步骤（3），配制25μL PCR反应体系，包括以下组分：
反应体系中Buffer、MgCl2及Taq DNA聚合酶来自上海申能博彩生物科技有限公司；
步骤（4），将5μL所述DNA稀释液加入到25μL PCR反应体系中，采用定量PCR仪对所述DNA稀释液进行PCR扩增反应并检测，PCR扩增反应的条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环，本实施例中采用的是Rotor-Gene3000A定量PCR仪（Corbett Research，Australia）。
在本实施例中，采用5位人员参与协同实验验证。在转化体特异性定量PCR检测方法验证中，要求每位人员逐步稀释转植酸酶基因玉米BVLA430101的模板，建立其外源和内源标准曲线。观察其标准曲线的线性相关系数，反应效率以及数据的重复性，重演性等结果。每位人员通过非转基因玉米的DNA稀释转基因玉米DNA，配制含转基因玉米5%、3%、1%（W/W）的盲样。并且根据建立的标准曲线，计算3个盲样的相对含量，观察盲样的计算值与其真实值之间的差异大小。在本实验中，实际样品的定量分析是采用相对定量法，既用外源基因和内标准基因含量的比值来表示检测样品中转基因成分的含量。将盲样在相同阈值下的Ct值分别代入外源，内源的标准曲线，得到对应值，根据公式（样品转基因含量（％）＝外源目的基因的拷贝数×100/内标准基因的拷贝数）进行转基因含量的计算。每次实验要求设立三个重复，重复三轮实验。实验结果如表1所示。
表1转化体特异性定量PCR检测方法验证结果
定量结果的准确性由平均值（Mean GMO）和偏差（Bias）来评估，精确性由标准偏差（SD）和相对标准偏差（RSD）来评估。混合样品的转基因玉米含量的计算值与其真实值之间的偏差在2.60%～7.52%之间，均小于25%，并且计算值与真实值之间的偏差随着混合样品转基因玉米含量的减少而增加。但是我们检测转基因玉米含量为1%的混合样本时，其计算值与真实值仍然在可以接受范围内；而且，在三次重复之间，转基因玉米含量的计算值之间的标准偏差和相对标准偏差也在理想范围内，结果表明转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量检测方法具有高的精确性和准确性。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，合成具有以下核苷酸序列的引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，
下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，
荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所示荧光探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；
步骤2，从转植酸酶基因玉米BVLA430101中提取出DNA并制备其稀释液；
步骤3，配制PCR反应体系，包括以下组分：所述上游引物、所述下游引物、所述荧光探针、10×Buffer、dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶、ddH2O；
步骤4，将所述DNA稀释液加入到所述PCR反应体系中，采用定量PCR仪对所述DNA稀释液进行PCR扩增反应并检测；
所述引物和荧光探针的核苷酸序列是针对转植酸酶基因玉米BVLA430101及产品的品系特异性的特定位点，即外源基因与玉米基因组DNA的整合为点设计的。
2.如权利要求1所述的转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法，其特征在于，步骤1中，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。
3.如权利要求1所述的转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法，其特征在于，步骤1中，所述上游引物、下游引物和荧光探针的浓度均为10μmol/L。
4.如权利要求3所述的转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法，其特征在于，步骤2中，所述DNA稀释液的浓度为20ng/μL。
5.如权利要求4所述的转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法，其特征在于，步骤3中，所述PCR反应体系包括以下组分：
6.如权利要求5所述的转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法，其特征在于，步骤4中，将5μL所述DNA稀释液加入到所述反应体系中，采用定量PCR仪对所述DNA稀释液进行PCR扩增反应并检测。
7.如权利要求1所述的转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的条件为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环。
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Rapid real-time PCR detection of transgenic cry1C rice using plasmid molecule as calibrator;Hui Wang等;《Eur Food Res Technol》;20130411;第237卷;101-107 *

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