CN103866042B - Lamp检测玉米mir162的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了LAMP检测玉米MIR162的引物组、试剂盒及方法，所述引物由外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LB组成，其核苷酸序列见SEQ？ID？No：1~5。本发明还保护了含有该引物的LAMP试剂盒。本发明的检测方法具有快速简便、准确灵敏的特点，在转基因产品管理和检验检疫工作中具有实际应用价值，尤其适用于基层实验室和现场检测的推广和应用。

Description

LAMP检测玉米MIR162的引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物品系的检测方法，具体涉及LAMP检测玉米MIR162的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
自1996年转基因作物投入商业化种植以来，经济社会效益逐步显现。根据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)的研究报告，2012年全球转基因作物种植面积达到1.7亿公顷，较1996年（170万公顷）增长了100倍。这些数字反映了全球转基因生物育种的发展态势。但是由于转基因技术可能产生新毒素和过敏原、导致抗性基因的基因漂移等原因，国际社会对转基因食品的安全性仍有相当大的争议。包括我国在内的世界许多国家都出台了转基因产品管理法规，要求对转基因产品进行检测、标识和管理。
转基因玉米作为目前世界上最主要的转基因作物之一，占全世界转基因作物种植面积的30%以上，仅次于转基因大豆。自2009年以来，我国进口玉米大幅增长，2012年全年玉米进口520.74万吨，同比增长197%，主要进口来源地为美国。然而，我国许可进口的转基因玉米品系只有13个。根据我国法律法规，必须对入境玉米进行转基因检测以排除未批准玉米品系进境。
MIR162是由先正达公司开发的抗鳞翅目昆虫的转基因玉米，该品系是通过DNA重组技术，将一种来自苏云金芽孢杆菌的抗鳞翅类昆虫的特异性抗虫基因Vip3A导入玉米基因组中。目前Mir162玉米已经在美国、加拿大、阿根廷、巴西、日本和俄罗斯等国获得了种植批准，并通过了加拿大食品检疫局（CFIA）的安全性审批，但中国农业部并未批准该转基因玉米品系进口。为防止非法转基因生物及其产品在国内种植和销售，对MIR162这种未批准转基因玉米品系的检测十分重要。
转基因玉米成分的检测主要采用TaqMan实时荧光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁琐、耗时长、染料EB有较强毒性、易污染环境等缺点已逐渐被实时荧光PCR检测方法所取代。TaqMan实时荧光PCR灵敏度高、特异性好，但需要荧光PCR仪，设备和试剂成本昂贵，并不普遍适用于检验检疫一线的基层实验室和现场检测。
近年来，环介导等温基因扩增技术（Loop-MediatedIsothermalAmplification，以下简称LAMP）发展迅速。LAMP是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，不需要特殊的试剂和仪器设备，成本低廉，适用于检验检疫一线的基层实验室和现场检测。
国内发布的转基因玉米MIR162品系的检测标准是SN/T1196-2012，国外发布的转基因玉米MIR162品系的检测方法标准是欧盟官方方法“Event-specificmethodforthequantificationofmaizeMIR162byreal-timePCR(CRLVL08/08VR)”，这两个标准均采用实时荧光PCR方法。
其他研究包括：（1）邓婷婷等2012年发表了“转基因玉米MIR162品系的实时PCR及可视芯片检测方法研究”（植物检疫,2012,26(5),14-18）。（2）Jae-HwanKim等2009年发表了利用多重PCR检测四个转基因玉米品系（3272、LY038、MIR162和MON88017）的方法（J.KoreanSoc.Appl.Biol.Chem.2009,52(1),105-107）。（3）路兴波等申请了专利“用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物、探针及其应用”（CN201210053592）和“用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及荧光标记探针及其应用”（CN201210052534）。这些研究全部采用的普通PCR方法和荧光PCR方法。
目前尚未发现将LAMP应用于转基因玉米MIR162品系检测的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速简便、准确灵敏、容易普及、适用基层一线实验室和现场应用的转基因玉米MIR162品系检测方法。
为实现上述目的，本发明提供一种用于检测转基因玉米MIR162品系的LAMP检测引物组。
本发明还保护一种用于检测转基因玉米品系MIR162的LAMP检测试剂盒，其特征在于：含有上述引物组。
本发明还保护一种用于检测转基因玉米品系MIR162的LAMP检测方法，其特征在于：包括使用所述引物组或者所述试剂盒的步骤。
所述方法以样品基因组DNA为模板，利用所述引物组或者所述试剂盒进行等温扩增，反应结束后用荧光染料SYBRGreenI检测扩增产物，结果判定。
本发明所采用的技术方案如下：
一种用于转基因玉米品系MIR162检测的LAMP检测引物组，本发明通过分析转基因玉米品系MIR162基因序列（HI203349）设计，由外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LB组成，所述引物的核苷酸碱基序列分别如下所示：
外引物F3：5’-ACATGTAATGCATGACGTTAT-3’（SEQIDNo:1）
外引物B3：5’-GCCTTATCTGTTGCCTTCA-3’（SEQIDNo:2）
内引物FIP：
5’-CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTC-3’
（SEQIDNo:3）
内引物BIP：
5’-AACTAGGATAAATTATCGCGCGCCGGACGTTTTTAATGTACTGAA-3’（SEQIDNo:4）
环引物LB：5’-TGTCATCTATGTTACTAGATCCCCG-3’（SEQIDNo:5）
一种用于转基因玉米品系MIR162检测的LAMP检测试剂盒，含有权利要求1所述引物组的试剂盒。
一种用于转基因玉米品系MIR162检测的LAMP检测方法，包括如下步骤：
（1）根据上述引物的核苷酸序列信息合成外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LB，分别配制成浓度为10μmol/L的外引物F3溶液、10μmol/L的外引物B3溶液，40μmol/L的内引物FIP溶液、40μmol/L的内引物BIP溶液、40μmol/L的环引物LB溶液作为试剂盒，备用；
（2）提取转基因玉米品系MIR162基因组DNA溶液备用；
（3）等温扩增反应：以样品基因组DNA为模板，利用所述的LAMP检测引物组进行等温扩增。
所述的等温扩增反应体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入：10×ThermoPol缓冲液2.5μL、10μmol/L的外引物F3溶液0.5μL、10μmol/L的外引物B3溶液0.5μL、40μmol/L的内引物FIP溶液1μL、40μmol/L的内引物BIP溶液1μL、40μmol/L的环引物LB溶液1μL、5mM甜菜碱4μL、10mMdNTPs4μL、100mmol/LMgSO41μL、8U/μLBstDNA聚合酶1μL、基因组DNA溶液2μL、6.5μL超纯水，混匀后在PCR管盖内壁加1000×SYBRGreenI溶液2μL。
其中上述10×ThermoPol缓冲液为：0.1mol/LKCl，0.2mol/LpH8.8的Tris-HCl，0.1mol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4和1%TritonX-100。
所述的等温扩增反应条件为：63℃恒温反应90min。
反应结束后采用显色法检测扩增产物，显色法使用的显色剂为荧光染料SYBRGreenI。采用混合PCR产物和1000×SYBRGreenI溶液的方式显色。所述的判定结果是根据反应混合物变绿色作为检出转基因玉米品系MIR162的结论，反之，保持SYBRGreenI的橙色不变，结果为未检出转基因玉米品系MIR162。
本发明的创新特征是：
本发明将LAMP检测技术应用于转基因玉米MIR162品系的检测，针对MIR162的品系特异性基因，应用特异引物组，在恒温条件和简易的设备中，仅用一个半小时左右即可有效地完成检测任务，结果判定简单。检测时间短、检测成本低是本检测方法的特点，尤其适用于基层一线实验室和现场检测，可以作为实时荧光PCR方法的有益补充。
本发明的有益效果为：本发明研制的转基因玉米MIR162品系LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒和检测方法，适用于转基因玉米MIR162品系的检测，检测灵敏度为0.5%，方法快速准确、特异性好，在转基因产品管理和检验检疫实际工作中具有广阔的应用价值与市场前景，尤其适用于基层一线实验室和现场检测的推广和应用。
本发明的创新点，不在LAMP技术本身，而在于研究开发者通过何种手段，将LAMP技术转变为可以用来检测转基因玉米MIR162的检测诊断方法。目前，国内外的研究者，均以建立快速、准确的检测诊断手段为目标。一项快速、准确的检测诊断手段的研发和建立需要研究者的不断探索和努力，也能够创造巨大的社会价值和经济价值。所以本发明是以LAMP技术为基本原理，在此基础上开发创造出其他研究者未能实现的，多条新的引物，从而实现了LAMP方法检测转基因玉米MIR162。如果没有发明人创造性的开发出特殊的引物，LAMP技术只能是一个概念，不能发挥任何价值。
附图说明
图1是本发明LAMP检测MIR162和其他13种植物物种的实验结果图。
图2是本发明LAMP检测14种转基因玉米品系和非转基因玉米的实验结果图。
图3是本发明转基因玉米MIR162品系的LAMP检测方法灵敏度实验结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明中转基因玉米标准品Bt176、Bt11、MON810、GA21、NK603、MON863、1507、3272、MIR604、59122、98140和转基因大豆标准品GTS40-3-2购自IRMM（欧洲标准物质研究所）；转基因玉米标准品MIR162、MON89034、MON88017和转基因油菜GT73购自AOCS（美国油类化学家学会）；转基因水稻BT63和科丰6号来自中国检验检疫科学研究院；其他植物样品均为非转基因样品，购自市场。10×ThermoPol缓冲液、dNTPs和MgSO4购自NewEnglandBiolabs公司；BstDNA聚合酶购自Fermentas公司；甜菜碱(Betaine)购自Sigma公司；10000×SYBRGreenI染料购自Invitrogen公司，使用时10倍稀释成1000×SYBRGreenI溶液。
实施例1：玉米样品的检测
1.引物设计与合成：
根据转基因玉米品系MIR162基因序列（Genbank序列号HI203349），设计LAMP引物组，LAMP引物组由外引物F3、内引物FIP、内引物BIP、外引物B3、环引物LF、环引物LB组成，各引物的具体序列如下：
外引物F3：5’-ACATGTAATGCATGACGTTAT-3’SEQIDNo:1
外引物B3：5’-GCCTTATCTGTTGCCTTCA-3’SEQIDNo:2
内引物FIP：
5’-CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTC-3’
SEQIDNo:3
内引物BIP：
5’-AACTAGGATAAATTATCGCGCGCCGGACGTTTTTAATGTACTGAA-3’SEQIDNo:4
环引物LB：5’-TGTCATCTATGTTACTAGATCCCCG-3’SEQIDNo:5
上述引物由TAKARA公司合成。分别配制成浓度为10μmol/L的外引物F3溶液、10μmol/L的外引物B3溶液，40μmol/L的内引物FIP溶液、40μmol/L的内引物BIP溶液、40μmol/L的环引物LB溶液作为试剂盒，备用。
基因组DNA的提取：
DNA提取方法参见《分子克隆实验指南第三版》（萨姆布鲁克D.W拉塞尔著.科学出版社2002[美]J.黄培堂等译）。材料为转基因玉米标准品MIR162。
等温扩增：
3.1等温扩增的反应体系和反应条件
以上述提取的基因组DNA为模板，进行等温扩增反应。
等温扩增反应体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入：10×ThermoPol缓冲液2.5μL、10μmol/L的外引物F3溶液0.5μL、10μmol/L的外引物B3溶液0.5μL、40μmol/L的内引物FIP溶液1μL、40μmol/L的内引物BIP溶液1μL、40μmol/L的环引物LB溶液1μL、5mM甜菜碱4μL、10mMdNTPs4μL、100mmol/LMgSO41μL、8U/μLBstDNA聚合酶1μL、基因组DNA溶液2μL（上述步骤2提取）、6.5μL超纯水，混匀后在PCR管盖内壁加1000×SYBRGreenI溶液2μL。
其中上述10×ThermoPol缓冲液为：0.1mol/LKCl，0.2mol/LpH8.8的Tris-HCl，0.1mol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4和1%TritonX-100。
将样品管放入PTC-200PCR仪（美国Bio-Rad公司），设置反应条件为：63℃恒温反应90min。
等温扩增产物的显色检测
扩增混合物与PCR管盖上的荧光染料SYBRGreenI颠倒混匀，肉眼观察反应结果。
转基因玉米MIR162品系采用上述LAMP检测引物组扩增的产物与荧光染料混合后呈绿色，根据显色后呈绿色还是成橙色来判断是否含有转基因玉米MIR162品系。呈绿色表明检出转基因玉米MIR162品系成分，呈橙色表明未检出转基因玉米MIR162品系成分。
实施例2：用于转基因玉米MIR162品系检测的LAMP方法的特异性确定
取其他植物物种的种子或果实13份、不同转基因玉米品系标准品14份，非转基因玉米1份，按上述方法分别提取基因组DNA，并进行LAMP等温扩增，荧光染料SYBRGreenI显色法检测结果。结果显示只有转基因玉米MIR162品系特异性产生绿色，检测结果如图1和图2所示。
所用引物组和方法见实施例1。
图1是应用本发明的引物组和检测方法检测MIR162和其他13种植物物种的实验结果图；管1－14依次为转基因玉米MIR162(10%，即转基因玉米MIR162质量和总的玉米质量的比值，或称为质量百分比，以下同)、非转基因大豆、大米、土豆、豌豆、绿豆、小麦、胡萝卜种子、番茄、木瓜、转基因水稻BT63、科丰6号、转基因大豆GTS40-3-2和转基因油菜GT73。从图中可以看出，只有转基因玉米MIR162呈绿色（管1），其他样品均为橙色。
图2是应用本发明的引物组和检测方法检测14种转基因玉米品系和非转基因玉米的实验结果图；其中，管1－15依次为转基因玉米MIR162(10%)、转基因玉米59122（10%）、转基因玉米Bt11（10%）、转基因玉米NK603（10%）、转基因玉米Bt-176（5%）、转基因玉米MON810（5%）、转基因玉米MON89034（100%）、转基因玉米1507（10%）、转基因玉米MIR604（10%）、转基因玉米MON88017（10%）、转基因玉米98140（10%）、转基因玉米3272（100%）、转基因玉米GA21（10%）、转基因玉米MON863（10%）和非转基因玉米。从结果可以看出，只有转基因玉米MIR162呈绿色（管1），其他样品均呈橙色。
从图1和2的结果可以看出，其他植物物种、其他转基因玉米品系和非转基因玉米均呈橙色，没有发生特异性扩增。实验结果表明建立的LAMP方法具有良好的特异性，可用于转基因玉米MIR162品系的检测。
实施例3：用于转基因玉米MIR162品系检测的LAMP方法的灵敏度确定
将转基因玉米品系MIR162标准品与非转基因玉米种子混合，配制成转基因玉米品系MIR162相对百分含量（w/w）为100%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的玉米种子样品，按上述实施例方法分别提取基因组DNA，再进行等温扩增，显色法检测结果。检测结果如图3所示。图3是本发明转基因玉米MIR162品系的LAMP检测方法灵敏度试验结果图。管1－7依次为转基因玉米品系MIR162含量分别为100%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的玉米种子样品的LAMP检测结果。
所用引物组和方法见实施例1。
实验结果显示：转基因玉米MIR162含量为100%、10%、5%、1%和0.5%的样品均呈绿色，0.1%和0%的样品呈橙色，说明建立的LAMP方法可从转基因玉米MIR162含量为0.5%的样品中成功检测出转基因玉米MIR162，具有较高的灵敏度，符合检测的要求。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCELISTING
<110>双雅,陈
<120>LAMP检测玉米MIR162的引物组、试剂盒及方法
<130>P9939
<160>5
<170>PatentInversion3.3
<210>1
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<213>人工合成
<400>1
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<210>2
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tgtcatctatgttactagatccccg25

Claims (6)

1.一种用于检测转基因玉米MIR162品系的LAMP引物组，所述引物由外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LB组成，所述引物的碱基序列分别为SEQIDNo：1~5。
2.一种用于检测转基因玉米MIR162品系的LAMP检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述引物组。
3.一种用于检测转基因玉米MIR162品系的LAMP检测方法，其特征在于：包括使用权利要求1所述引物组或者权利要求2所述试剂盒的步骤。
4.权利要求3所述检测转基因玉米MIR162品系的LAMP检测方法，其特征在于，以样品基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组或者权利要求2所述试剂盒进行等温扩增，反应结束后用荧光染料SYBRGreenI显色，结果判定。
5.权利要求4所述检测转基因玉米MIR162品系的LAMP检测方法，其特征在于，所述等温扩增中的反应体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入：10×ThermoPol缓冲液2.5μL、10μmol/L的外引物F3溶液0.5μL、10μmol/L的外引物B3溶液0.5μL、40μmol/L的内引物FIP溶液1μL、40μmol/L的内引物BIP溶液1μL、40μmol/L的环引物LB溶液1μL、5mM甜菜碱4μL、10mMdNTPs4μL、100mmol/LMgSO41μL、8U/μLBstDNA聚合酶1μL、基因组DNA溶液2μL、6.5μL超纯水，混匀后在PCR管盖内壁加1000×SYBRGreenI溶液2μL；等温扩增反应条件为：63℃恒温反应90min。
6.权利要求3所述检测转基因玉米MIR162品系的LAMP检测方法，其特征在于，所述结果判定是荧光染料SYBRGreenI显色后扩增产物呈绿色即作为检出转基因玉米品系MIR162。
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