CN102242219A - 一种鉴定白菜紫色性状的方法及专用引物对 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定白菜紫色性状的方法及专用引物对。该引物对，其中一条引物如SEQ ID NO：1所示，另一条引物如SEQ ID NO：2所示。本发明利用F2群体将控制紫色性状的基因首次定位到A3染色体上，找到了与紫色性状紧密连锁的分子标记，该分子标记可以用于鉴定大白菜的紫色性状，为进一步进行分子标记辅助育种和克隆基因奠定基础。本发明鉴定方法鉴定结果准确可靠，在大白菜的生长早期便可进行鉴定，无需等待其植株长成时再鉴定，节省了时间，降低了劳动成本，加快了育种速度，具有重要意义。

Description

一种鉴定白菜紫色性状的方法及专用引物对

技术领域

本发明涉及一种鉴定白菜紫色性状的方法及专用引物对。

背景技术

花青素是存在于植物中的水溶性色素，由一个基本的结构母核和不同的取代基组成，因取代基种类及位置不同而形成了不同颜色的花青素，包括粉、红、紫和蓝色等，大约88％的被子植物的花颜色是由花青素决定的，花青素主要积累在植物液泡中并有多种生理功能，例如吸引昆虫传粉，抵御低温和紫外线伤害，以及防治植物病害等；花青素是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂，具有抗氧化衰老、抗突变、抗癌与抗动脉硬化功能；此外，花青素还是一种安全、无毒的天然食用色素。因此，花青素在园艺、医药、化妆、食品等方面具有一定的应用潜力和研究价值。

白菜紫色品种是近几年在国内出现的新类型，主要由国外引入。2006年前后，国外推出了应用细胞质Ogu CMS不育系育成的紫色小白菜杂交一代(中文名称“紫罗兰”)，在国内市场销售、种植，影响较大。这份紫色小白菜植株综合表现为：个体生长速度缓慢，叶片正面紫色，叶片背面绿色，叶柄翠绿。在秋季栽培条件下，由于阳光充足，叶片的亮紫色表现尤为突出等特点。张德双等采用多份大白菜与引进的紫色小白菜杂交，得到了2份紫色的大白菜中间材料。白菜紫色品种的紫色是由花青素类物质所致。研究表明，白菜紫色品种花青素含量比普通品种高很多。

目前关于大白菜紫色性状来源的报道主要有3种途径：西北农林科技大学于2001年开始着手进行紫色大白菜新品种的选育工作，试验所用的紫红色基因源来自紫菜薹；孙日飞于2006年报道了利用紫红色芥菜作为紫色源，经过种间杂交和连续回交，成功地获得了紫红色大白菜新种质；2007年张德双报道了选用2份大白菜(07-721和07-802)与紫色小白菜杂交，分别获得杂交F₁代，再用2份大白菜与2个F₁分别回交转育，已初步获得紫色大白菜中间材料(07D3和07D5)。

孙日飞等经初步研究认为，来自芥菜的紫红色基因源，紫红色基因与控制黄色、橘红色的基因遗传表现相反，表现为显性；张德双等通过大白菜与紫色小白菜变种间杂交，初步研究认为叶片紫色对绿色受1对遗传基因控制，紫色对绿色为显性，决定叶片紫色的基因具有累加效应；张明科等通过大白菜与紫菜薹种间杂交和连续回交，通过调察和统计，进行常规和分子分析后，初步研究认为，紫色性状为数量性状，是受一对主基因控制的部分显性遗传，并呈现出剂量效应，可能还受到微效基因和环境条件的共同影响。尽管所用的紫色基因源不同，但紫色性状表现出较相似的遗传趋势。

分子标记辅助育种是分子标记技术与常规育种相结合的产物，具有准确、不受环境条件干扰等优点。利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测与目的基因紧密连锁的分子标记，筛选出所要的基因型，辅助常规育种，从而达到提高育种效率、加快育种进程的目的。

目前蔬菜作物上主要对抗病、抗逆及重要农艺性状基因开展了分子标记及定位的研究工作，这将是开展分子标记辅助育种及定位、图位克隆重要基因的基础。国内外已经大规模开展了包括白菜、甘蓝、番茄、甜(辣)椒、黄瓜、马铃薯等主要蔬菜作物的分子标记研究，这些主要性状的分子标记为开展蔬菜作物的分子标记辅助育种提供了重要基础。张明科等获得了2个与大白菜紫色性状连锁的RAPD标记，遗传距离分别为13.73cM和18.65cM。尽管张明科找到了与紫色性状连锁的标记，但是其遗传距离还相对较远，远达不到分子标记辅助育种的要求。

目前，在所应用的标记中，RFLP标记所需DNA量较大，步骤较多，周期长，制备探针及检测中要用到放射性同位素，成本高；RAPD标记因使用的引物比较短，对反应条件极为敏感，稍有改变便影响扩增产物的重现，重复性较差，稳定性不好。另外，RAPD是显性标记，不能区分纯合基因型与杂合基因型，无法直接用于基因型分析；AFLP标记费用比较昂贵，且方法需经多步操作，统计分析困难，对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高；SNP提供的信息较少，且费用较高。相比之下SSR标记具有了以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高。(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高。(3)共显性遗传，不易被自然选择和人工选择所淘汰，符合孟德尔遗传定律。(4)易于利用PCR技术分析，对DNA质量要求低，用量少，不需使用同位素，即使是部分降解的样品也可进行分析。(5)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于鉴定白菜紫色性状的引物对。

本发明所提供的用于鉴定白菜紫色性状的引物对，其中一条引物如1)所示，另一条引物如2)所示：

1)为如下A或B：

A、核苷酸序列为SEQ ID NO：1的DNA分子；

B、将A限定的DNA分子经过1个或几个碱基的替换，得到的具有相同功能的由A衍生的DNA分子；

2)为如下C或D：

C、核苷酸序列为SEQ ID NO：2的DNA分子；

D、将C限定的DNA分子经过1个或几个碱基的替换，得到的具有相同功能的由C衍生的DNA分子。

上述任一所述引物对在鉴定白菜紫色性状中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的一个目的是提供一种辅助鉴定白菜紫色性状的方法。

本发明所提供的辅助鉴定白菜紫色性状的方法，包括如下步骤：用上述任一所述引物对对待测白菜进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物的大小为213bp，则确认所述待测白菜颜色候选为紫色。

上述引物对中、上述应用中、上述鉴定方法中，所述白菜颜色均指白菜叶片颜色，尤其指叶片正面颜色即叶片向阳面颜色。

上述引物对中、上述应用中、上述鉴定方法中，所述白菜为含有控制紫色性状的基因的白菜，具体可为紫色小白菜与其它白菜杂交得到的后代白菜。

本发明利用F₂群体将控制紫色性状的基因首次定位到A3染色体上，找到了与紫色性状紧密连锁的共显性分子标记，建立了大白菜紫色分子标记辅助选择系统。本发明方法鉴定结果准确可靠，在早期便可鉴定出纯合的材料，选择性强，减少了育种的盲目性，节省了时间，降低了劳动成本，加快了育种进程，具有重要意义。该分子标记不仅可以用于鉴定大白菜的紫色性状，而且为克隆紫色基因和转基因研究奠定基础。

附图说明

图1为大白菜、紫色小白菜亲本、F₁及F₂群体。A：大白菜(P₁)，B：紫色小白菜(P₂)，C：F₁，D：F₂分离群体。

图2为BVb005P10-18引物两池各单株的电泳结果。P₁：绿色，P₂：紫色，L1和L2：绿色池，Z1和Z2：紫色池，1-11：紫色单株，12-23：绿色单株。M1∶100bp marker，M2：50bpmarker。

图3为BVb005P10-18在F₂群体上的琼脂糖凝胶电泳结果。M：50bp marker，1-186∶186个F₂单株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、分子标记的应用

一、材料

大白菜(09-680)在文献“张德双，张凤兰，赵岫云，余阳俊，徐家炳，于拴仓，汪维红.2011.大白菜(大白菜×紫色小白菜)叶片紫色性状的遗传分析.中国蔬菜，2：36-38”中公开过，公众可从北京市农林科学院获得。

紫色小白菜(09N-742)在文献“张德双，张凤兰，赵岫云，余阳俊，徐家炳，于拴仓，汪维红.2011.大白菜(大白菜×紫色小白菜)叶片紫色性状的遗传分析.中国蔬菜，2：36-38”中公开过，公众可从北京市农林科学院获得。

以大白菜P₁(09-680)和P₂紫色小白菜(09N-742)为亲本，杂交获得F₁，然后自交得到F₂代，用186个F₂单株构建F₂群体(图1)。

二、分子标记

表1：BVb005P10-18序列

三、方法

1、DNA提取

分别对P₁、P₂和F₁以及186个F₂单株用CTAB法提取基因组DNA。

2、SSR反应体系和程序

SSR的PCR反应体系为12.5μL，其中包含：1.25μL 10×buffer，0.6μL 2.5mMdNTPs，10uM上下游引物各0.8μL，1μL 30ng/μL模板DNA，0.15μL 5U/μL Taq，7.9μL ddH₂O。

PCR扩增采用Touchdown程序。热循环程序为：94℃变性3min，94℃变性1min，62℃复性1min(每个循环降低0.8℃)，72℃延伸1min，12个循环；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，23个循环，72℃延伸8min。

扩增产物用3％的超高分辨率琼脂糖凝胶电泳检测。

3、结果判定

若在琼脂糖凝胶上只显示213bp的条带，则确认该大白菜的颜色性状为紫色纯合；若213bp和313bp都有，则为紫色杂合。

四、结果

利用BSA方法，分别选取11个紫色单株和12个绿色单株构建紫色和绿色池，从225对SSR引物中筛选出双亲间和两池之间有差异的标记12对，然后将池打开，进一步验证这12对引物可靠性，其中BVb005P10-18在单株间差异明显(图2)。

用BVb005P10-18进行鉴定的结果如表2和图3。

表2BVb005P10-18标记与紫色基因在F₂群体中的遗传连锁分析

本研究所获得的分子标记通过在F₂群体中的验证发现，在186个单株中，除了2个单株未扩增出条带外，其余184个单株吻合率为100％(图3)。表明此标记与大白菜紫色性状紧密连锁，完全可以用于分子标记辅助选择。

Claims (3)

1.一种用于鉴定白菜紫色性状的引物对，其中一条引物如1)所示，另一条引物如2)所示：

1)为如下A或B：

A、核苷酸序列为SEQ ID NO：1的DNA分子；

B、将A限定的DNA分子经过1个或几个碱基的替换，得到的具有相同功能的由A衍生的DNA分子；

2)为如下C或D：

C、核苷酸序列为SEQ ID NO：2的DNA分子；

D、将C限定的DNA分子经过1个或几个碱基的替换，得到的具有相同功能的由C衍生的DNA分子。

2.权利要求1所述引物对在鉴定白菜紫色性状中的应用。

3.一种辅助鉴定白菜紫色性状的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述引物对对待测白菜进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物的大小为213bp，则确认所述待测白菜颜色候选为紫色。

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