CN108207620B - 一种高含量花青素芥菜品系及其选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高含量花青素芥菜品系，所述高含量花青素芥菜品系由紫色小白菜09N‑742、紫叶油菜p1029和紫叶芥菜1280‑1与芥菜杂交获得。本发明利用紫色小白菜09N‑742、紫叶油菜p1029和紫叶芥菜1280‑1三种具有调控花青素代谢基因的植物与芥菜杂交，将各自拥有的调控花青素代谢的基因，按照基因的分离和重组规律，共同整合到口感良好、食客广泛的芥菜中，相比于现有技术中只整合一种花青素来源的育种方法，显著提高了花青素的含量。

Description

一种高含量花青素芥菜品系及其选育方法
技术领域
本发明涉及一种芥菜品系及其选育方法，尤其是涉及一种高含量花青素芥菜品系及其选育方法。
背景技术
花青素是一种水溶性植物色素，存在于液泡内的细胞液中，其颜色可随细胞液酸碱度的不同而改变。由于不同植物的细胞液酸碱度不同，所以不同植物的花青素颜色不同，既而赋予各种植物多种多样的色彩，一般而言，深色植物，例如紫色或者黑色植物的花青素含量较高。
近年来有研究表明，花青素具有高效抗氧化和清除自由基的功能，并且可作为食品防腐剂代替苯甲酸等合成防腐剂，还可作为食品着色剂。可见，其具有丰富的营养价值和工业价值。因此，开发花青素产品以及选育花青素含量高的蔬菜成为目前的一个研究热点。
在现有技术中，人们通过将花青素含量高的植物与日常人们喜爱食用的蔬菜进行杂交，从而培育出花青素含量高、且口感良好适于食用的蔬菜。但是，目前的选育方法通常只选取一种花青素含量高的植物作为花青素的提供者，因此，其所得培育品系的花青素含量虽有提升，但提升幅度不大，不能满足人们对花青素含量的需求。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种高含量花青素芥菜品系及其选育方法，其所得芥菜品系具有三种花青素来源，从而大幅提升芥菜中花青素的含量。
本发明采用的技术方案如下：
一种高含量花青素芥菜品系，由紫色小白菜09N-742、紫叶油菜p1029和紫叶芥菜1280-1与芥菜杂交获得。
本发明利用紫色小白菜09N-742、紫叶油菜p1029和紫叶芥菜1280-1三种具有调控花青素代谢基因的植物与芥菜杂交，将各自拥有的调控花青素代谢的基因，按照基因的分离和重组规律，共同整合到口感良好、食客广泛的芥菜中，相比于现有技术，只整合一种花青素来源的育种方法，显著提高了花青素的含量。
优选地，所述芥菜为香港客家芥菜。香港客家芥菜具有早熟、植株大和产量高等优点，通过采用香港客家芥菜作杂交父本，一方面能够缩短育种时间，另一方面能够将早熟、植株高大和产量高等优点强化到后代。由于其植株大且产量高，因此培育所得品系的叶片面积大，相应的花青素含量高且产量大。
一种高含量花青素芥菜品系的选育方法，包括以下步骤：
1)具有一种花青素来源的芥菜品系的选育：
紫色小白菜09N-742作母本，芥菜作父本杂交得到F1代，筛选F1代中表现型为紫色叶片的单株作母本，芥菜为轮回亲本，连续回交后，筛选回交后代中表现型为紫色叶片的单株进行自交，然后利用基因标记一从自交后代中筛选得到纯合体09N-742-B；
紫叶油菜p1029作母本，芥菜作父本杂交得到F1代，筛选F1代中表现型为紫色叶片的单株作母本，芥菜为轮回亲本，连续回交后，筛选回交后代中表现型为紫色叶片的单株进行自交，然后利用基因标记二从自交后代中筛选得到纯合体p1029-B；
紫叶芥菜1280-1作母本，芥菜作父本杂交得到F1代，筛选F1代中表现型为紫色叶片的单株作母本，芥菜为轮回亲本，连续回交后，筛选回交后代中表现型为紫色叶片的单株进行自交，然后利用基因标记三从自交后代中筛选得到纯合体1280-1-B；
2)具有两种花青素来源的芥菜品系的选育：
纯合体09N-742-B与纯合体p1029-B杂交后自交，然后利用基因标记一和基因标记二，在自交后代中共同筛选得到纯合体09N-742-p1029-B；
纯合体p1029-B与纯合体1280-1-B杂交后自交，然后利用基因标记二和基因标记三，在自交后代中共同筛选得到纯合体1280-1-p1029-B；
3)具有三种花青素来源的芥菜品系的选育：纯合体09N-742-p1029-B和纯合体1280-1-p1029-B杂交后自交，然后利用基因标记一、基因标记二和基因标记三，从自交后代中共同筛选得到纯合体09N-742-p1029-1280-1-B；
4)高含量花青素芥菜品系的选育：纯合体09N-742-p1029-1280-1-B自交，得到高含量花青素的芥菜新品系。
本发明所采用的紫色小白菜09N-742、紫叶油菜p1029和紫叶芥菜1280-1均为深色蔬菜，具有较高的花青素含量。同时，此三种蔬菜的基因组中均具有调控花青素代谢的基因，且这些调控花青素代谢的基因为非同源基因。本发明通过逐步聚合的方式，将三者各自具有的调控花青素代谢的基因，通过杂交逐渐聚合到一种后代中，使后代同时具有来自三者的调控花青素代谢的基因。并且在此过程中，通过回交技术，不断强化稳定来自亲本双方的性状，最终得到具有高含量花青素和高产量、好口感的芥菜新品系。另外，由于紫色小白菜09N-742、紫叶油菜p1029和紫叶芥菜1280-1均还具有调控花青素基因的基因标记，相较于现有技术中直接观察表现型的粗犷做法，本发明利用此基因标记通过分子生物学方法，能够明确指示出所培育的品系是否含有调控花青素代谢的基因。
进一步地，在步骤1)至3)中，所述的基因标记一是紫色小白菜09N-742基因组中调控花青素代谢基因的标记引物BVRCI613和标记引物BVRCI417；所述的基因标记二是紫叶油菜p1029基因组中调控花青素代谢基因的标记引物598-1；所述的基因标记三是紫叶芥菜1280-1基因组中调控花青素代谢基因的标记引物PLC871。不同植物品系中关于调控花青素基因的基因标记有所不同，具有特异性。通过特异性的基因标记对自交后代中的紫色叶片单株进行纯合体筛选，可以直接根据电泳条带是否与花青素供体植物的电泳条带相同，判断后代是否为纯合体。相比于从外部观察表现型进行纯合体筛选，具有更高的准确性，能够精准地筛选到基因组中已经整合了调控花青素代谢基因的纯合体。
进一步地，步骤1)至3)中，在步骤1)至3)中，所述的标记引物BVRCI613具有序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述的标记引物BVRCI417具有序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；所述的标记引物598-1具有序列表中SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；所述的标记引物PLC871具有序列表中SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。。
进一步地，步骤1)中，所述连续回交的代数为5代。通过芥菜作轮回亲本，与每一后代中的紫色叶片单株回交5代，一方面使作为轮回亲本的芥菜所具有的早熟、植株高大和产量高等性状，通过5代回交的不断强化，从而稳定的遗传给后代；另一方面不断筛选每一后代中紫色叶片单株作为母本进行5次回交，即不断筛选每一次后代个体中基因组含有调控花青素代谢基因的植株作为母本，将其含有调控花青素代谢基因的染色体通过染色体分离和重组稳定遗传给后代。
进一步地，步骤1)中，所述连续回交在花蕾期进行，人工去除紫色叶片单株的雄蕊后进行人工授粉。在花蕾期可以区分雌雄花时，进行人工去雄从而避免紫色叶片单株自交，并对香港客家芥菜的雄蕊和紫色叶片单株的雌蕊进行人工授粉，通过人工去雄和人工授粉操作保障回交的顺利进行，进一步在后代中巩固来源于香港客家芥菜的早熟、植株高大和产量高等性状。
进一步地，步骤1)至3)中，所述自交的代数为1代。通过紫色叶片单株自交1代后筛选纯合体，一方面节省育种的时间，另一方面，自交一代相比于自交多代，表现型为紫色叶片的植株，是纯合体的概率高，相对来说，筛选难度小。
一种高含量花青素芥菜品系的鉴定方法，包括以下步骤：
1)取待测芥菜植株叶片，提取DNA做实验组；分别取紫色小白菜09N-742植株、紫叶油菜p1029植株和紫叶芥菜1280-1植株的叶片，提取DNA做对照组；
2)待测芥菜的DNA依次与标记引物BVRCI613、标记引物BVRCI417、标记引物598-1和标记引物PLC871进行PCR扩增；紫色小白菜09N-742植株的DNA，依次与标记引物BVRCI613和标记引物BVRCI417进行PCR扩增；紫叶油菜p1029植株的DNA，与标记引物598-1进行PCR扩增；紫叶芥菜1280-1植株的DNA，与标记引物PLC871进行PCR扩增；
3)分别对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳并观察条带，在标记引物BVRCI613的PCR扩增产物电泳结果中，待测芥菜植株的电泳条带与紫色小白菜09N-742植株的条带相同；在标记引物BVRCI417的PCR扩增产物电泳结果中，待测芥菜植株的电泳条带与紫色小白菜09N-742植株的条带相同；在标记引物598-1的PCR扩增产物电泳结果中，待测芥菜植株的电泳条带与紫叶油菜p1029植株的条带相同；在标记引物PLC871的PCR扩增产物电泳结果中，待测芥菜植株的电泳条带与紫叶芥菜1280-1植株的条带相同；
4)同时符合步骤3)中全部电泳结果的待测芥菜为高含量花青素芥菜品系
由于高含量花青素芥菜品系具有来自紫色小白菜09N-742、紫叶油菜p1029和紫叶芥菜1280-1的调控花青素代谢基因的特异性基因标记。因此，通过分子生物学手段能够准确快速的鉴定待测芥菜是否为高含量花青素芥菜品系。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为高含量花青素芥菜品系的育种流程图。
具体实施方式
实施例一：纯合体09N-742-B的选育
紫色小白菜09N-742(取自北京农林科学院蔬菜研究中心)作母本，香港客家芥菜(购自广西横县子龙种业有限公司)作父本杂交得到F1代。筛选出F1代中表现型为紫色叶片的单株作母本，香港客家芥菜作轮回亲本，连续回交5代得到BC5F1代。回交在花蕾期进行，人工去除每一代紫色叶片单株的雄蕊，并通过人工授粉将香港客家芥菜的花粉转移到紫色叶片单株的雌蕊柱头上，使其授粉。BC5F1代进行自交得到BC5F2代，种植BC5F2代至叶片长出，筛选出其中的紫色叶片单株，检测是否为含有调控花青素代谢基因的纯合体。
取约小拇指尖大小的BC5F2代的芥菜新鲜叶片于2ml离心管中，紫色叶片为实验组，绿色叶片为对照组。加入0.25ml十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液后，加入一颗磨样钢珠，将离心管置于冰上，液面高于组织破碎机探头，进行组织破碎30s。破碎后再加入0.5mlCTAB缓冲液，将离心管置于65℃水浴60min，水浴期间多次剧烈震荡离心管。水浴结束后，加入0.75ml的氯仿：异戊醇混合液(氯仿和异戊醇体积比为24:1)震荡15～20min，震荡混匀后，在室温下，12000rpm离心8min，用移液枪吸取约0.6ml上清液于新的2ml离心管中。再次加入0.6ml的氯仿：异戊醇混合液(氯仿和异戊醇体积比为24:1)震荡15～20min，震荡混匀后，在室温下，12000rpm离心8min，用移液枪吸取约0.5ml上清液于新的1.5ml离心管中。向1.5ml离心管加入0.5ml无水乙醇和30μL浓度为3M醋酸钾溶液(无水乙醇和醋酸钾溶液经过-20℃预冷。)缓慢摇匀后置于-20℃冰箱约30min，DNA沉淀于离心管底部。至冰箱取出后，用移液枪枪头挑出沉淀的DNA，置于新的1.5ml离心管，加入0.5ml 76％乙醇漂洗超过1h。清除DNA表面的有机杂质后，在室温下，5000rpm离心4min将DNA离心到管底，倒掉管中的76％乙醇，室温下干燥过夜。DNA干燥后，加入0.2mlTE缓冲液溶解作母液保存，并用分光光度计检测浓度与纯度。使用时，根据母液浓度添加灭菌蒸馏水稀释至50ng/μL。
CTAB缓冲液的配方如下：
Figure GDA0002986444330000051
由于紫色小白菜09N-742的基因组中含有与花青素代谢相关的基因，随着紫色小白菜09N-742与香港客家芥菜杂交以及回交，来自两个亲本的染色体经过分离和重组，因此，芥菜后代也拥有了含有调控花青素代谢基因的染色体，叶片呈现紫色。因为紫色小白菜09N-742具有与花青素代谢相关基因的基因标记，标记引物BVRCI613和标记引物BVRCI417，因此，我们可以通过分析PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，更精准地筛选紫色叶片单株中具有调控花青素代谢基因的纯合体。标记引物BVRCI613具有序列表中SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示的核苷酸序列，标记引物BVRCI417具有序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，两对标记引物分别进行PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
PCR反应体系如下(10.0μL)：
Figure GDA0002986444330000052
Figure GDA0002986444330000061
PCR反应条件如下：94℃预变性2min；94℃变性1min，53℃退火30s，72℃延伸45s，共计30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
取3～5μL标记引物BVRCI613的PCR扩增产物跑聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染并比对观察电泳条带。BC5F2群体中条带完全与母本紫色小白菜09N-742相同的单株，初步判定为携带紫色小白菜09N-742所具有的调控花青素代谢基因的纯合体，其余带型的单株则为杂合体或不携带该基因的单株。
针对BC5F2群体中条带完全与母本紫色小白菜09N-742相同的单株，继续取3～5μL对应DNA模板中，由标记引物BVRCI417扩增的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。若其条带仍然与母本紫色小白菜09N-742的条带完全相同，则判定该单株为携带紫色小白菜09N-742调控花青素代谢基因的纯合体。对该纯合体进行标记，并等待其自花授粉后留取种子，命名为09N-742-B。该纯合体中调控花青素代谢的基因来源于紫色小白菜09N-742。
实施例二：纯合体p1029-B的选育
紫叶油菜p1029(取自韶关学院英东农业科学与工程学院李海渤实验室)作母本，香港客家芥菜(购自广西横县子龙种业有限公司)作父本杂交得到F1代。筛选出F1代中表现型为紫色叶片的单株作母本，香港客家芥菜作轮回亲本，连续回交5代得到BC5F1代。回交在花蕾期进行，人工去除每一代紫色叶片单株的雄蕊，并通过人工授粉将香港客家芥菜的花粉转移到紫色叶片单株的雌蕊柱头上，使其授粉。BC5F1代进行自交得到BC5F2代，种植BC5F2代至叶片长出，筛选出其中的紫色叶片单株，检测是否为含有调控花青素代谢基因的纯合体。
由于紫叶油菜p1029的基因组中含有与花青素代谢相关的基因，随着紫叶油菜p1029与香港客家芥菜杂交以及回交，来自两个亲本的染色体经过分离和重组，因此，芥菜后代也拥有了含有调控花青素代谢基因的染色体，叶片呈现紫色。因为紫叶油菜p1029具有与花青素代谢相关基因的基因标记，标记引物598-1，因此，我们可以通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，更精准地筛选紫色叶片单株中具有调控花青素代谢基因的纯合体。标记引物598-1具有序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
叶片DNA提取和PCR反应体系与实施例一相同，此处不再赘述。
PCR反应条件如下：94℃变性2min；94℃变性1min，53℃退火30s，72℃延伸45s，共计30个循环；72℃延伸5min，然后4℃保存。
银染并观察聚丙烯酰胺凝胶电泳条带条带，若BC5F2群体中单株的条带完全与紫叶油菜p1029相同，则该单株为携带p1029调控花青素合成基因的纯合体，否则为杂合体或不该单株不携带p1029所具有的调控花青素代谢基因。对该纯合体进行标记，并等待其自花授粉后留取种子，命名为p1029-B，该纯合体中调控花青素代谢的基因来源于紫叶油菜p1029。
实施例三：纯合体1280-1-B的选育
紫叶芥菜1280-1(取自青海大学高原生态与农业国家重点实验室)作母本，香港客家芥菜(购自广西横县子龙种业有限公司)作父本杂交得到F1代。筛选出F1代中表现型为紫色叶片的单株作母本，香港客家芥菜作轮回亲本，连续回交5代得到BC5F1代。回交在花蕾期进行，人工去除每一代紫色叶片单株的雄蕊，并通过人工授粉将香港客家芥菜的花粉转移到紫色叶片单株的雌蕊柱头上，使其授粉。BC5F1代进行自交得到BC5F2代，种植BC5F2代至叶片长出，筛选出其中的紫色叶片单株，检测是否为含有调控花青素代谢基因的纯合体。
由于紫叶芥菜1280-1的基因组中含有与花青素代谢相关的基因，随着紫叶芥菜1280-1与香港客家芥菜杂交以及回交，来自两个亲本的染色体经过分离和重组，因此，芥菜后代也拥有了含有调控花青素代谢基因的染色体，叶片呈现紫色。因为紫叶芥菜1280-1具有与花青素代谢相关基因的基因标记，标记引物PLC871，因此，我们可以通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，更精准地筛选紫色叶片单株中具有调控花青素代谢基因的纯合体。标记引物598-1具有序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
叶片DNA提取和PCR反应体系与实施例一相同，此处不再赘述。
PCR反应为：94℃变性2min；94℃变性1min，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min，然后4℃保存。
银染并观察聚丙烯酰胺凝胶电泳条带，若BC5F2群体中单株的条带完全与母本紫叶芥菜1280-1相同，则该单株是携带紫叶芥菜1280-1调控花青素代谢基因的纯合体，否则是杂合体或不携带紫叶芥菜1280-1所具有的调控花青素代谢基因。对该纯合体进行标记，并等待其自花授粉后留取种子，命名为1280-1-B。该纯合体中调控花青素合成的基因来源于紫叶芥菜1280-1。
实施例四：纯合体09N-742-p1029-B的选育
实施例一得到的纯合体09N-742-B与实施例二得到纯合体p1029-B互为父母本进行杂交得到F1代，F1代自交得到F2代。种植F2代至叶片长出，筛选出其中的紫色叶片单株，检测是否为含有调控花青素代谢基因的纯合体。
由于作为亲本的纯合体09N-742-B和p1029-B均具有与花青素代谢相关的基因以及与上述基因相关的基因标记，标记引物BVRCI613、标记引物BVRCI417和标记引物598-1。经过两者的杂交以及F1代的自交，其后代中具有来自两个亲本的与花青素代谢相关的基因以及与上述基因相关的基因标记。因此，我们可以通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，更精准地筛选紫色叶片单株中具有调控花青素代谢基因的纯合体。
叶片DNA提取和PCR反应体系与实施例一相同，PCR反应条件与实施例一和实施例二相同，此处不再赘述。
三对标记引物分别进行PCR。取3～5μL标记引物BVRCI613的PCR扩增产物跑聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，银染并在观片灯下观察比对电泳条带条带，若F2群体中的单株条带与纯合体09N-742-B的条带不完全相同，则该单株为杂合体或者不含有纯合体09N-742-B中的花青素合成基因。
若F2群体中单株的条带与纯合体09N-742-B的条带完全相同，则继续取3～5μL对应DNA模板中，标记引物BVRCI417的扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，若其条带仍然与纯合体09N-742-B的条带完全相同，那么该单株含有来自纯合体09N-742-B所具有的调控花青素代谢的基因，且为纯合体。
通过标记引物BVRCI613和标记引物BVRCI417筛选出具有纯合体09N-742-B调控花青素代谢基因的纯合体后，继续取对应的DNA模板中，标记引物598-1的扩增产物跑聚丙烯酰胺凝胶电泳，若其与纯合体p1029-B的条带完全相同，那么后代含有来自纯合体09N-742-B和纯合体p1029-B的调控花青素代谢的基因，且为纯合体。
对纯合体进行标记，并等待其自花授粉后留取种子，命名为09N-742-p1029-B。该纯合体中同时含有来源于紫色小白菜09N-742和紫叶油菜p1029的调控花青素代谢的基因。
实施例五：纯合体1280-1-p1029-B的选育
实施例二得到纯合体p1029-B与实施例三得到的纯合体1280-1-B互为父母本进行杂交得到F1代，F1代自交得到F2代。种植F2代至叶片长出，筛选出其中的紫色叶片单株，检测是否为含有调控花青素代谢基因的纯合体。
由于作为亲本的纯合体p1029-B和纯合体1280-1-B均具有与花青素代谢相关的基因以及与上述基因相关的基因标记，标记引物598-1和标记引物PLC871。经过两者的杂交以及F1代的自交，其后代F2中具有来自两个亲本的与花青素代谢相关的基因以及与上述基因相关的基因标记。因此，我们可以通过PCR扩增和聚丙烯凝胶酰胺电泳技术，更精准地筛选紫色叶片单株中具有调控花青素代谢基因的纯合体。
叶片DNA提取和PCR反应体系与实施例一相同，PCR反应条件与实施例二和实施例三相同，此处不再赘述。两对标记引物分别进行PCR。
分别取3～5μL两组PCR扩增产物跑聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，银染并在观片灯下观察比对电泳条带，若F2群体中的单株条带完全与纯合体p1029-B相同，则该单株为携带纯合体p1029-B调控花青素代谢基因的纯合体。继续取3～5μL对应DNA模板中，标记引物PLC871扩增的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，若其条带完全与纯合体1280-1-B相同，那么该单株同时含有来自纯合体p1029-B及纯合体1280-1-B的调控花青素代谢的基因，且为纯合体。
对纯合体进行标记，并等待其自花授粉后留取种子，命名为1280-1-p1029-B。该纯合体中同时含有来源于紫叶油菜p1029和紫叶芥菜1280-1的调控花青素代谢的基因。
实施例六：纯合体09N-742-1280-1-p1029-B的选育
实施例四得到纯合体09N-742-p1029-B与实施例五得到的纯合体1280-1-p1029-B互为父母本进行杂交得到F1代，F1代自交得到F2代。种植F2代至叶片长出，筛选出其中的紫色叶片单株，检测是否为含有调控花青素代谢基因的纯合体。
由于作为亲本的纯合体09N-742-p1029-B和纯合体1280-1-p1029-B均具有与花青素代谢相关的基因以及与上述基因相关的基因标记，标记引物BVRCI613、标记引物BVRCI417、标记引物598-1和标记引物PLC871。经过两者的杂交以及F1代的自交，其后代中具有来自两个亲本的与花青素代谢相关的基因以及与上述基因相关的基因标记。因此，我们可以通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，更精准地筛选紫色叶片单株中具有调控花青素代谢基因的纯合体。以上述四对标记引物分别进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
叶片DNA提取和PCR反应体系与实施例一相同，PCR反应条件与实施例一、实施例二和实施例三相同，此处不再赘述。
分别取3～5μL四组PCR扩增产物跑聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，银染并在观片灯下观察比对电泳条带条带。以标记引物BVRCI613为例，若F2群体中的单株电泳条带与纯合体09N-742-p1029-B的条带相同，那么初步判定该单株含有来自纯合体09N-742-p1029-B的调控花青素代谢的基因，且为纯合体。
同理观察标记引物BVRCI417、标记引物598-1和标记引物PLC871的PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳条带。若F2群体中的单株电泳条带完全与亲本电泳条带均相同，那么该单株含有同时来自纯合体09N-742-p1029-B和纯合体1280-1-p1029-B的调控花青素代谢的基因，且为纯合体。
对该纯合体单株进行标记，并等待其自花授粉后留取种子，命名为09N-742-p1029-1280-1-B。该纯合体中同时含有来源于紫色小白菜09N-742、紫叶油菜p1029和紫叶芥菜1280-1的调控花青素代谢的基因。
实施例七：高含量花青素芥菜品系的选育
实施例六得到的纯合体09N-742-p1029-1280-1-B进行自交，后代即为高含量花青素芥菜品系。其聚合了紫色小白菜09N-742、紫叶油菜p1029和紫叶芥菜1280-1三种植物中调控花青素代谢的基因，并具有芥菜产量高、口感好的优点。
实施例八：花青素含量比较
首先，分别摘取高含量花青素芥菜新品系、纯合体09N-742-B、纯合体p1029-B和纯合体1280-1-B的新鲜紫色叶片，并各自称取0.1g后于液氮中冷冻研磨；研磨至粉状后加入2ml酸化乙醇提取液(85％乙醇和0.1％HCL的混合液)，室温下避光超声波破碎30min，破碎后于4℃避光溶解过夜，完全溶解后，仍于室温下超声破碎30min；然后，置于离心机中，12000rpm转速下离心15min，取上清液；接着，取2μl上清液，用紫外分光光度计测量530nm波长处的上清液吸光值；最后，将吸光值带入Fuleki and Francis公式中，计算花色素苷含量，并比较四种纯合体的花色素苷含量。
Fuleki and Francis公式：花色素苷总量(mg/100g)＝A530×V×n×100×98.2-1×M-1。
式中的A530表示色素在530nm波长处的吸光度；V表示加入浸提液的体积；n表示比色稀释倍数；98.2表示花色苷在530nm波长处平均消光系数；M表示提取物的质量。
经检测得，纯合体09N-742-B的花色素苷含量为132.08±0.267mg/100g；纯合体p1029-B的花色素苷含量为64.33±0.162mg/100g；纯合体1280-1-B的花色素苷含量为167.62±0.332mg/100g；高含量花青素芥菜新品系的花色素苷含量为250.89±0.231mg/100g。高含量花青素芥菜新品系花色素苷含量高于上述三种纯合体的花青素苷含量。可见，具有三种花青素来源的芥菜相比具有一种花青素来源的芥菜，具有更高的花青素含量。
实施例九：高含量花青素芥菜品系的鉴定
取待测芥菜植株上约小拇指甲盖大小的叶片，提取DNA；同时，分别取紫色小白菜09N-742植株、紫叶油菜p1029植株和紫叶芥菜1280-1植株上约小拇指甲盖大小的叶片，提取DNA做对照组。
取待测芥菜植株的DNA，分别依次与标记引物BVRCI613、标记引物BVRCI417、标记引物598-1和标记引物PLC871进行PCR扩增；取自紫色小白菜09N-742植株的DNA，分别依次与标记引物BVRCI417和标记引物BVRCI417进行PCR扩增；取自紫叶油菜p1029植株的DNA，与标记引物598-1进行PCR扩增；取自紫叶芥菜1280-1植株的DNA，与标记引物PLC871进行PCR扩增。
叶片DNA提取和PCR反应体系与实施例一相同，PCR反应条件与实施例一、实施例二和实施例三相同，此处不再赘述。
对于标记引物BVRCI613的PCR扩增产物，跑聚丙烯酰胺凝胶电泳后，银染观察电泳条带，待测芥菜植株的电泳条带与紫色小白菜09N-742植株的条带完全相同；对于标记引物BVRCI417的PCR扩增产物，待测芥菜植株的电泳条带与紫色小白菜09N-742植株的条带完全相同；对于标记引物598-1的PCR扩增产物，待测芥菜植株的电泳条带与紫叶油菜p1029植株的条带完全相同；对于标记引物PLC871的PCR扩增产物，待测芥菜植株的电泳条带与紫叶芥菜1280-1植株的条带完全相同。
若待测芥菜植株的电泳结果同时符合上述四种电泳结果，那么待测芥菜为高含量花青素芥菜，其所属品系为高含量花青素芥菜品系。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Figure GDA0002986444330000121
Figure GDA0002986444330000131
Figure GDA0002986444330000141
序列表
<110> 韶关学院
<120> 一种高含量花青素芥菜品系及其选育方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcctgcca aaaagaatca aaa 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacgtcggag cttgggcg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccctgatcaa agcgaaaatc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acatcttcgg gagaagcatc 20
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaaaaatta agcaaaatct gttatag 27
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcctttagag agtaacgtct ttgag 25
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagttcggtc ttcgttcc 18
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgacagata gccacga 17

Claims (5)

1.一种高含量花青素芥菜品系的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)具有一种花青素来源的芥菜品系的选育：
紫色小白菜09N-742作母本，芥菜作父本杂交得到F1代，筛选F1代中表现型为紫色叶片的单株作母本，芥菜为轮回亲本，连续回交后，筛选回交后代中表现型为紫色叶片的单株进行自交，然后利用基因标记一从自交后代中筛选得到纯合体09N-742-B；
紫叶油菜p1029作母本，芥菜作父本杂交得到F1代，筛选F1代中表现型为紫色叶片的单株作母本，芥菜为轮回亲本，连续回交后，筛选回交后代中表现型为紫色叶片的单株进行自交，然后利用基因标记二从自交后代中筛选得到纯合体p1029-B；
紫叶芥菜1280-1作母本，芥菜作父本杂交得到F1代，筛选F1代中表现型为紫色叶片的单株作母本，芥菜为轮回亲本，连续回交后，筛选回交后代中表现型为紫色叶片的单株进行自交，然后利用基因标记三从自交后代中筛选得到纯合体1280-1-B；
2)具有两种花青素来源的芥菜品系的选育：
纯合体09N-742-B与纯合体p1029-B杂交后自交，然后利用基因标记一和基因标记二，在自交后代中共同筛选得到纯合体09N-742-p1029-B；
纯合体p1029-B与纯合体1280-1-B杂交后自交，然后利用基因标记二和基因标记三，在自交后代中共同筛选得到纯合体1280-1-p1029-B；
3)具有三种花青素来源的芥菜品系的选育：纯合体09N-742-p1029-B和纯合体1280-1-p1029-B杂交后自交，然后利用基因标记一、基因标记二和基因标记三，从自交后代中共同筛选得到纯合体09N-742-p1029-1280-1-B；
4)高含量花青素芥菜品系的选育：纯合体09N-742-p1029-1280-1-B自交，得到高含量花青素的芥菜新品系；
所述的基因标记一是紫色小白菜09N-742基因组中调控花青素代谢基因的标记引物BVRCI613和标记引物BVRCI417；所述的基因标记二是紫叶油菜p1029基因组中调控花青素代谢基因的标记引物598-1；所述的基因标记三是紫叶芥菜1280-1基因组中调控花青素代谢基因的标记引物PLC871；
所述的标记引物BVRCI613具有序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述的标记引物BVRCI417具有序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；所述的标记引物598-1具有序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；所述的标记引物PLC871具有序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的高含量花青素芥菜品系的选育方法，其特征在于，在步骤1)中，所述连续回交的代数为5代。
3.根据权利要求2所述的高含量花青素芥菜品系的选育方法，其特征在于，在步骤1)中，所述连续回交在花蕾期进行，人工取出紫色叶片单株的雄蕊后进行人工授粉。
4.根据权利要求3所述的高含量花青素芥菜品系的选育方法，其特征在于，在步骤1)至3)中，所述自交的代数为1代。
5.权利要求1所述的高含量花青素芥菜品系的选育方法，其特征在于，步骤4)中高含量花青素芥菜品系的鉴定方法包括以下步骤：
a.取待测芥菜植株叶片，提取DNA做实验组；分别取紫色小白菜09N-742植株、紫叶油菜p1029植株和紫叶芥菜1280-1植株的叶片，提取DNA做对照组；
b.待测芥菜植株的DNA依次与标记引物BVRCI613、标记引物BVRCI417、标记引物598-1和标记引物PLC871进行PCR扩增；紫色小白菜09N-742植株的DNA，依次与标记引物BVRCI613和标记引物BVRCI417进行PCR扩增；紫叶油菜p1029植株的DNA，与标记引物598-1进行PCR扩增；紫叶芥菜1280-1植株的DNA，与标记引物PLC871进行PCR扩增；
c.分别对步骤b的PCR扩增产物进行电泳并观察条带，在标记引物BVRCI613的PCR扩增产物电泳结果中，待测芥菜植株的电泳条带与紫色小白菜09N-742植株的条带相同；在标记引物BVRCI417的PCR扩增产物电泳结果中，待测芥菜植株的电泳条带与紫色小白菜09N-742植株的条带相同；在标记引物598-1的PCR扩增产物电泳结果中，待测芥菜植株的电泳条带与紫叶油菜p1029植株的条带相同；在标记引物PLC871的PCR扩增产物电泳结果中，待测芥菜植株的电泳条带与紫叶芥菜1280-1植株的条带相同；
d.同时符合步骤c中全部电泳结果的待测芥菜为所述高含量花青素芥菜品系。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109392697B (zh) * 2018-11-16 2021-09-17 东北农业大学 一种利用远缘杂交技术培育紫色大白菜新种质的方法
CN110396553A (zh) * 2019-03-18 2019-11-01 信阳师范学院 一种区分叶用紫叶芥菜和绿叶芥菜的分子标记及区分方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102242219A (zh) * 2011-07-18 2011-11-16 北京市农林科学院 一种鉴定白菜紫色性状的方法及专用引物对
CN104839011A (zh) * 2015-05-29 2015-08-19 北京市农林科学院 一种获得紫色芥蓝的方法
CN107211885A (zh) * 2017-07-04 2017-09-29 韶关学院 一种小菘菜细胞质雄性不育系及保持系的选育及繁殖方法
CN107581059A (zh) * 2017-10-27 2018-01-16 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所 一种紫色大白菜育种方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102242219A (zh) * 2011-07-18 2011-11-16 北京市农林科学院 一种鉴定白菜紫色性状的方法及专用引物对
CN104839011A (zh) * 2015-05-29 2015-08-19 北京市农林科学院 一种获得紫色芥蓝的方法
CN107211885A (zh) * 2017-07-04 2017-09-29 韶关学院 一种小菘菜细胞质雄性不育系及保持系的选育及繁殖方法
CN107581059A (zh) * 2017-10-27 2018-01-16 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所 一种紫色大白菜育种方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Factors influencing anthocyanin content in red cabbage (Brassica oleracea var capitata L f rubra (L) Thell);Roberta Piccaglia等;《Journal of the Science of Food and Agriculture》;20021231(第82期);全文 *
Fine mapping and candidate gene analysis of an anthocyanin‑rich gene, BnaA.PL1, conferring purple leaves in Brassica napus L.;Haibo Li等;《Molecular Genetics and Genomics》;20161231;全文 *
甘蓝型油菜紫叶基因BnaA.PL1定位和候选基因分析;李海渤;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20170228(第2期);全文 *
紫菜苔叶片和茎杆花青素含量的遗传分析;刘进等;《西北农林科技大学学报(自然科学版)》;20171227(第03期);全文 *
芥菜类蔬菜杂种优势利用的研究进展与展望;万正杰等;《华中农业大学学报》;20180131;第37卷(第１期);全文 *
鉴定与芥菜型油菜紫叶基因Bjpl1紧密连锁的AFLP及SCAR标记(英文);赵志等;《西北农业学报》;20130425;第22卷(第04期);全文 *

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